BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan post test only control group design. 3.2 Sampel dan Besar Sampel Penelitian Sampel penelitian ini adalah biakan murni S. mutans yang berasal dari laboratorium Tropical Disease Universitas Airlangga. Jumlah pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus umum: (t-1) (r-1) 15 (t-1) x (r-1) 15 (7-1) x (r-1) 15 6 x (r-1) 15 6r-6 15 6r 21 r 3,5 4 Keterangan : t r : Jumlah perlakuan dalam penelitian. : Jumlah perlakuan ulang (sampel)
Jumlah perlakuan (r) ulang yang digunakan adalah 4. Pada penelitian ini digunakan 6 kali pengulangan. Kelompok I : ekstrak dengan konsentrasi 100 % = 6 sampel Kelompok II : ekstrak dengan konsentrasi 50% = 6 sampel Kelompok III : ekstrak dengan konsentrasi 25% = 6 sampel Kelompok IV : ekstrak dengan konsentrasi 12,5% = 6 sampel Kelompok V : ekstrak dengan konsentrasi 6,25% = 6 sampel Kelompok VI : ekstrak dengan konsentrasi 3,125 % = 6 sampel Kelompok VII : ekstrak dengan konsentrasi 1,56 % = 6 sampel Kelompok VIII : kontrol negatif (ekstrak buah mahkota dewa tanpa suspensi S.mutans)= 1 sampel Kelompok IX : kontrol Mc Farland = 1 sampel Jumlah sampel keseluruhan = 44 sampel
3.3 Variabel Penelitian VARIABEL BEBAS : Ekstrak buah mahkota dewa dengan pelarut etanol dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%. VARIABEL TERGANTUNG Pertumbuhan S.mutans pada media MHA dengan pengukuran KHM dan KBM VARIABEL TERKENDALI Rotary - evaporator 1 ATM dan temperatur 60 0 C Asal tumbuh buah mahkota dewa (Karangsari, Medan Polonia) Media untuk pertumbuhan S. mutans Suhu inkubasi Waktu pengamatan dan pembiakan suspensi bakteri S.mutans Sterilisasi alat, bahan dan media Waktu pengamatan Konsentrasi bahan coba suspensi S.mutans pada saat diinokulasi pada media. Jumlah sampel bahan percobaan yang diteteskan ke media padat (50µl). VARIABEL TIDAK TERKENDALI Lamanya penyimpanan buah mahkota dewa Suhu dan pengiriman dari bahan coba Keterampilan operator
3.3.1 Variabel Bebas Variabel bebas yang termasuk pada penelitian ini adalah ekstrak buah mahkota dewa pelarut etanol dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56%. 3.3.2 Variabel Tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini adalah pertumbuhan S.mutans pada media MHA dengan pengukuran nilai KHM dan KBM. 3.3.3 Variabel Terkendali Asal tumbuh buah mahkota dewa (Karangsari, Polonia Medan) Media untuk pertumbuhan S. mutans Suhu inkubasi Waktu inkubasi Sterilisasi alat, bahan dan media Waktu pengamatan Konsentrasi bahan coba Suspensi S.mutans pada saat diinokulasi pada media MHA 3.3.4 Variabel tidak terkendali Lamanya penyimpanan ekstrak buah mahkota dewa Suhu dan pengiriman dari bahan coba Keterampilan operator
3.4 Defenisi Operasional Defenisi Operasional pada penelitian ini adalah: Buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl) adalah buah mahkota dewa yang tumbuh di Kelurahan Karangsari, Kecamatan Medan Polonia, Medan. Ekstrak buah mahkota dewa pelarut etanol adalah ekstrak yang diperoleh dengan melakukan ekstraksi buah mahkota dewa yang telah dimaserasi dengan pelarut etanol 96% sehingga diperoleh ekstrak kental. S.mutans adalah bakteri yang diambil dari plak gigi dan diperoleh dari Laboratorium Tropical Disease Universitas Airlangga. KHM (Kadar Hambat Minimum) adalah konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati kekeruhan pada media perbenihan dengan menggunakan metode dilusi. KBM (Kadar Bunuh Minimum) adalah konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh bakteri sebesar 99 % atau 100 % pada media agar. Kontrol Mc Farland berisi bakteri yang disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 % sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1x10 8 CFU/ml. 3.5 Bahan dan Alat Penelitian 3.5.1 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang dipakai adalah:
Buah mahkota dewa sebanyak 2 kg. Pelarut etanol 96% 5 liter (Kimia Farma, Indonesia) Biakan murni S.mutans Media MHA (Mueller Hinton Agar) Media MHB (Mueller Hinton Broth) Media nutrient agar Spritus Alkohol 70% Wipol Kapas Steril Cotton Bud Formalin 1% NaCl 0,85 % Aquades 3.5.2 Alat Penelitian Alat-alat penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah : Rotavapor Alat destilasi pelarut Autoklaf (Yamamoto SN 210) Oven (Gallenkomp) Inkubator (Fisher scientific Isotemp Incubator model 630-D)
Destilator Vaccum Rotary Evaporator Kaliper geser Neraca Analitic Electric Tabung reaksi (Pyrex) Blender Electronic Balance (Chyo JP2-6000) Vortex Pisau Aluminium foil 1 gulungan Erlenmeyer (Pyrex) Kertas saring Gelas ukur Rak tabung reaksi Sprayer Hot Plate Cawan petri Pipet mikro dan tissue Batang pengaduk Kaca pembesar Bunsen Ose
3.6 Tempat dan Waktu Penelitian 3.6.1 Tempat Penelitian 1. Laboratorium Farmakognosi Farmasi USU 2. Laboratorium Penelitian Farmasi USU 3. Laboratorium Tropical Disease UNAIR 3.6.2 Waktu Penelitian: September 2010 - Juli 2011 3.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Buah Mahkota Dewa Buah mahkota dewa yang dipakai adalah buah yang segar atau baru dipetik dari pohon mahkota dewa yang ditanam di Kelurahan Karangsari, Kecamatan Medan Polonia, Medan, tidak cacat dan berwarna merah pada sore hari. Gambar 5: Tanaman mahkota dewa dan buah mahkota dewa yang berasal dari Kelurahan Karang Sari, Kecamatan Polonia. Bahan baku berupa buah mahkota dewa sebanyak 2 kg dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang kemudian dibelah agar bagian cangkang dan bijinya mudah dipisahkan. Buah mahkota dewa diiris halus untuk mempercepat proses
pengeringan dan mempermudah penggilingan lalu dikeringkan di lemari pengering selama 14 hari. Gambar 6 : Buah mahkota dewa dicuci, ditimbang 2 kg, kemudian diiris halus. Gambar 7 : Sampel buah mahkota dewa dimasukkan ke dalam lemari pengering sehingga diperoleh sampel kering. Kemudian sampel yang telah kering diblender sampai menjadi serbuk simplisia sebanyak 190 gram kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96%. Selama proses maserasi, sel buah mahkota dewa mengalami kondisi jenuh sehingga sel-selnya akan mengeluarkan senyawasenyawa aktif yang kemudian diikat oleh pelarut etanol tersebut. Pelarut etanol akan mengikat berbagai senyawa aktif seperti, polifenol, flavonoid, terpenoid, sterol dan alkaloid. Maserat diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel.
Gambar 8 : simplisia kering ditimbang lalu diblender kemudian dimaserasi Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkulator yang ditutup aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Pada bagian ujung perkulator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan ± 20 tetes/menit. Prosedur penampungan maserat diulangi sampai maserat yang dihasilkan berwarna jernih, dan didapat maserat cair sebanyak ± 4 liter. Gambar 9 : perkolasi dengan pelarut etanol 96%.
Semua maserat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan, 1 ATM dengan temperatur 60 0 C. Ekstrak kental yang dihasilkan didinginkan selama 24 jam kemudian dilakukan pengeringan beku dalam freeze dryer selama 24 jam. Gambar 10: Penguapan maserat pada Vaccum Rotary Evaporator Gambar 11: Ekstrak kental pelarut etanol 3.7.2 Pembuatan Media Bakteri Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media nutrient agar (NA) dengan cara dimasak, sebanyak 2 gram nutrient agar dilarutkan ke dalam 100 ml akuades, lalu media dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih sehingga media NA benar-benar larut. Kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada tekanan 2 atm, suhu 121 0 C. Media MHB (Mueller Hinton Broth) dan MHA (Mueller Hinton Agar) dibuat untuk menguji aktivitas antibakteri. Media MHB yang digunakan untuk melihat KHM, dibuat dengan cara melarutkan 4,2 gram bubuk media MHB dalam aquades sampai 200 ml. Larutan dipanaskan sampai bubuk benar-benar larut, selanjutnya
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada tekanan 2 atm, 115 0 C. Media MHA yang digunakan sebagai media untuk melihat KBM, sebanyak 7,6 gram Mueller Hinton Agar dilarutkan ke dalam 200 ml akuades, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 atm, suhu 121 0 C. Setelah disterilkan, media disimpan ke dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin. 3.7.3 Pembiakan spesimen Pembiakan spesimen S.mutans dilakukan dalam suasana aerob. Selanjutnya pembiakan pada media nutrient agar yang telah disediakan sebelumnya pada cawan petri. Biakan bakteri diinkubasi dalam suasana aerob pada suhu 37 0 C selama 24 jam, lalu diamati apakah bakteri S.mutans telah tumbuh subur dan murni didapat. Apabila pertumbuhan bakteri tidak subur dan terjadi kontaminasi bakteri lain atau jamur, prosedur pembiakan bakteri dan pengamatan diulang kembali sampai biakan yang didapat benar-benar murni. Kemudian sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji tersebut disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9 % pada tabung reaksi steril. Kemudian suspensi bakteri divorteks hingga homogen sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1x10 8 CFU/ml.
3.7.4 Penentuan KHM dan KBM Bahan Coba Bahan coba ekstrak buah mahkota dewa yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% dan 3,125% dan 1,56%. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasi. Suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya diambil 1 ml dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks hingga homogen. Selanjutnya tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam pada inkubator kemudian diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol. Konsentrasi terendah dari larutan sampel yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (ditandai dengan mulai adanya kejernihan secara visual oleh tiga pengamat secara independen) ditentukan sebagai Kadar Hambat Minimum (KHM). Penentuan KBM dilakukan pada pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% 3,125%, 1,56% sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni metode Drop Plate Mills Mesra. Bahan coba dengan konsentrasi diatas diambil 50µl untuk tiap konsentrasi kemudian diteteskan pada MHA sebanyak 6 replikasi. Spesimen didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni
bersinggungan dianggap 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit) / ml cairan (suspensi). Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50µl, maka perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil yang sesuai standar (CFU/ml). 3.8 Analisis Data Data hasil penelitian diperoleh dengan cara mengamati KHM dan KBM bahan coba pada berbagai konsentrasi. Konsentrasi bahan coba yang mulai jernih pada konsentrasi terkecil sebagai KHM sedangkan konsentrasi bahan coba yang sudah mampu membunuh bakteri atau tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni ditandai sebagai KBM.
BAB 4 HASIL PENELITIAN Setelah diperoleh ekstrak kental pelarut etanol buah mahkota dewa, dilakukan uji aktivitas antibakteri pada media MHA yang telah diinokulasi suspensi S.mutans. Pengujian daya antibakteri dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56%). Metode yang digunakan adalah metode pengenceran ganda (dilusi) untuk mengetahui KHM dan KBM bahan coba. Perubahan yang terjadi ditandai dengan hasil biakan mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol (Mc Farland yang diinkubasi 24 jam) ditandai sebagai KHM selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Mills Mesra yang bertujuan untuk membuktikan adanya kemampuan untuk membunuh bakteri pada konsentrasi terkecil sebesar 99% - 100%, yang disebut dengan KBM (Kadar Bunuh Minimum). Gambar 12 : Suspensi bakteri S.mutans sebelum berkontak dengan bahan coba
Gambar 13 : Suspensi bakteri Streptococcus mutans setelah berkontak dengan bahan coba pada berbagai konsentrasi. Setelah peletakan bahan coba pada suasana aerob dengan inkubasi 37 C selama 24 jam terlihat bahwa pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% masih memberikan efek antibakteri yang ditandai dengan tidak dijumpai pertumbuhan koloni bakteri sehingga dilakukan uji pada konsentrasi dibawahnya yaitu konsentrasi 3,125% dan konsentrasi 1,56% guna mengetahui nilai KHM dan KBM dari bahan coba. A B C
D E F Gambar 14 : Pertumbuhan koloni yang terbentuk pada media MHA pada konsentrasi ekstrak buah mahkota dewa 3,125 % dengan pelarut etanol pada (A) replikasi 1, (B) replikasi 2, (C) replikasi 3, (D) replikasi 4, (E) replikasi 5, (F) replikasi 6 A B Gambar 15: Pada konsentrasi 6,25% sudah tidak terjadi pertumbuhan bakteri (A); pada konsentrasi 1,56% terjadi pertumbuhan koloni yang tidak dapat dihitung. Hasil didapat bahwa pada konsentrasi 6,25% tidak dijumpai adanya pertumbuhan bakteri atau senilai 0 CFU/ml yang menunjukkan bahwa pada konsentrasi ini sudah mampu memberikan daya antibakteri sedangkan pada konsentrasi 3,125%, dijumpai adanya pertumbuhan bakteri, yaitu 122x20 CFU/ml pada replikasi 1 sehingga konsentrasi 6,25% ditetapkan sebagai KHM dan KBM.
Tabel 1. Perhitungan jumlah bakteri untuk bahan coba ekstrak etanol buah mahkota dewa. No PARAMATER Hasil Uji Hasil Hitung Kuman a. Konsentrasi 100% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 b. Konsentrasi 50% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 c. Konsentrasi 25% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 d. Konsentrasi 12,5% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6
e. Konsentrasi 6,25% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 f. Konsentrasi 3,125% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 122x20 CFU/ml 101x20 CFU/ml 91x20 CFU/ml 120x20 CFU/ml 128x20 CFU/ml 125x20 CFU/ml g. Konsentrasi 1.56% - Ulangan 1 - Ulangan 2 - Ulangan 3 - Ulangan 4 - Ulangan 5 - Ulangan 6 TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD TBUD Keterangan : Hasil uji hanya berlaku untuk contoh yang diuji. Faktor pengenceran 20 kali. TBUD : Tidak Bisa Untuk Dihitung (atau > 300 koloni)
BAB 5 PEMBAHASAN Penelitian tentang pengaruh ekstrak buah mahkota dewa dan bakteri S.mutans membuktikan bahwa ekstrak buah mahkota dewa memiliki daya antibakteri. Penelitian diatas dilakukan teknik pengenceran ganda (dilusi) melalui pengukuran KHM dan KBM bahan coba terhadap pertumbuhan bakteri, yang bertujuan untuk mengetahui adanya kekeruhan dan adanya pertumbuhan bakteri setelah diberikan perlakuan ekstrak buah mahkota dewa dari berbagai konsentrasi (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,56%). Metode dilusi oleh Fereira et al., 2002, dilakukan untuk mengamati aktivitas antibakteri karena bahan coba langsung berkontak dengan mikroorganisme. Nilai KHM diketahui dengan mengamati adanya kekeruhan suspensi setelah diinkubasi 37 C selama 24 jam dan KBM diketahui dengan menghitung jumlah koloni bakteri pada media padat. Ada dua metode untuk menentukan daya antibakteri, yaitu agar diffusion test dan dillution test. Pada metode agar diffusion test diukur zona hambat / inhibisi bakteri yang tergantung pada kelarutan dan difusi bahan coba sehingga kurang efektif untuk menghambat mikroorganisme. Sedangkan metode dilusi lebih efektif karena bahan uji langsung berkontak dengan mikroorganisme sehingga hasil penelitian akan lebih representatif. Atas dasar inilah peneliti memilih metode dilusi untuk menguji daya antibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap S.mutans.
Penelitian ini dimulai dengan melakukan ekstraksi buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa [Scheff.] Boerl). Ekstraksi merupakan metode yang sering digunakan untuk memisahkan komponen atau senyawa dari tumbuhan. Pemisahan komponen atau senyawa tumbuhan dimulai dari proses maserasi. Selama proses maserasi, sel buah mahkota dewa mengalami kondisi jenuh sehingga sel-selnya akan mengeluarkan senyawa-senyawa aktif yang kemudian diikat oleh pelarut etanol tersebut seperti flavonoid, alkaloid, saponin dan tanin. Pelarut yang digunakan adalah pelarut etanol. Alasan penggunaan pelarut etanol karena sifatnya yang dapat melarutkan seluruh bahan aktif yang terkandung dalam suatu bahan alami, baik bahan aktif yang bersifat polar, semipolar maupun non polar. Selain itu, pelarut etanol diketahui lebih aman (tidak bersifat toksik) jika dibandingkan dengan pelarut metanol. Selanjutnya dilakukan perkolasi hingga diperoleh maserat cair, yang akan dilakukan penguapan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator yang bekerja dengan cara menurunkan tekanan udara dari tekanan udara luar menjadi <1 ATM sehingga tekanan uap pelarut serta titik didih pelarut menurun. Penurunan tekanan akan berbanding lurus dengan penurunan temperatur sehingga menghindari terjadinya penguraian kandungan kimia maserat cair yang diekstraksi. Dalam hal ini, senyawa aktif mahkota dewa yang berkhasiat sebagai antibakteri adalah flavonoid, alkaloid, saponin, fenol dan tanin. Flavonoid akan merusak membran sel bakteri karena sifatnya lipofilik. Alkaloid berperan sebagai antimikroba karena sifatnya mampu berikatan dengan DNA. Efek antibakteri dari senyawa saponin sebagai deterjen yang memiliki molekul ampifatik (mengandung bagian hidrofilik dan hidrofobik) yang dapat melarutkan protein membran. Ujung
hidrofobik saponin berikatan pada region hidrofobik protein membran sel dengan menggeser sebagian besar unsur lipid yang terikat. Ujung hidrofilik saponin merupakan ujung yang bebas akan membawa protein ke dalam larutan sebagai kompleks deterjen-protein sehingga sel bakteri menjadi lisis. Fenol bersifat toksik terhadap bakteri yang dianggap bertanggung jawab terhadap toksisitas bakteri. Setelah dilakukan pengujian nilai KHM dan KBM dalam berbagai konsentrasi, tidak dijumpai adanya pertumbuhan bakteri (steril atau 0 CFU/ml) pada konsentrasi 100% hingga 6,25% yang artinya pada konsentrasi tersebut memberikan daya antibakteri maka dilakukan pengenceran lagi di bawah konsentrasi 6,25% yaitu konsentrasi 3,125% dan 1,56%. Pada konsentrasi 3,125%, pengenceran yang dilakukan akhirnya mampu mengurangi daya hambat bahan uji terhadap pertumbuhan bakteri sehingga terlihat adanya pembentukan koloni bakteri 122x20 CFU/ml pada replikasi 1, sedangkan pada konsentrasi 1,56% terjadi pembentukan koloni bakteri yang tidak dapat dihitung. Efek antibakteri bahan coba dilihat dari besar nilai KHM dan KBM bahan coba terhadap pertumbuhan bakteri dengan jumlah bakteri harus sama untuk setiap perlakuan sesuai dengan standar 0,5 Mc Farland. Suspensi standar 0,5 Mc Farland adalah adalah suspensi yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan bakteri sama dengan 10 8 CFU/ml maka suspensi bakteri dibuat terlebih dahulu kemudian disesuaikan kekeruhannya dengan 0,5 Mc Farland (1x10 8 CFU/ml) selanjutnya diinokulasi pada media cair dengan jumlah yang sama untuk berbagai konsentrasi. 25 Nilai minimum yang ditunjukkan pada bahan coba dengan konsentrasi 6,125% yaitu 0 CFU/ml maka ditentukan sebagai nilai KHM dan KBM. Jika
dibandingkan dengan penelitian sebelumnya yang menguji daya antibakteri ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap Enterococcus faecalis terdapat perbedaan KHM dan KBM dengan KHM dan KBM berada pada konsentrasi yang lebih besar, yaitu 12,5%. Penelitian lain oleh Yunanto, K menyatakan bahwa infusum daun mahkota memiliki daya hambat terbesar pada konsentrasi 50 %. 12 Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak buah mahkota dewa lebih efektif menghambat pertumbuhan S.mutans dibandingkan infusum daun mahkota dewa sedangkan pada pada penelitian lain didapatkan infusum daun mahkota dewa memiliki daya antibakteri terhadap Stapylococcus aureus dengan KHM 3,125 gram% dan KBM 6,25% sedangkan bakteri E.coli juga terdapat efek antibakteri namun tidak lebih besar dari 25 gram%. 13 Hal ini menunjukkan nilai KHM dan KBM infusum daun mahkota dewa terhadap Stapylococcus aureus hampir sama dengan penelitian ini. Metode dilusi dilakukan pada penelitian ini dengan pengenceran sebesar setengah dari konsentrasi awal, yaitu konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5% 6,25%, 3,125% dan 1,56% maka memungkinkan adanya konsentrasi lain >3,125% - 6,25% yang dapat membunuh S.mutans sehingga perlu dilakukan pengujian antibakteri dengan metode pengenceran lain. Selain itu, ekstrak etanol mahkota dewa yang memiliki saponin dengan kandungan yang rendah berarti memiliki makna toksisitas yang rendah dapat menjadi pertimbangan pengembangan ekstrak tersebut sebagai salah satu bahan alternatif pencegahan karies.
BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan Ekstrak etanol buah mahkota dewa memiliki daya antibakteri sehingga mampu menghambat pertumbuhan S.mutans. Efek antibakteri dinilai dari nilai KHM dan KBM yang terdapat pada ekstrak etanol buah mahkota dewa pada konsentrasi 6,25% dengan jumlah koloni 0 CFU/ml. 6.2 Saran 1. Perlu ada pengujian antibakteri lebih lanjut pada konsentrasi >3,125% - 6,25% dapat membunuh S.mutans dengan metode lain. 2. Perlu dilakukan uji toksisitas pada ekstrak etanol buah mahkota dewa untuk mengetahui pengaruhnya terhadap pertumbuhan sel. 3. Penelitian ini dapat dipakai sebagai dasar penelitian lebih lanjut untuk penelitian in vivo dalam penentuan konsentrasi KHM dan KBM ekstrak etanol buah mahkota dewa yang aman jika dipakai sebagai bahan alternatif pencegahan karies baik bentuk obat kumur, topikal aplikasi atau pasta gigi.