III. METODE PENELITIAN A. Materi 1. Materi Penelitian Materi penelitian berupa benih ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) berumur 1, 2, 3, dan 4 bulan hasil kejut panas pada menit ke 25, 27 atau 29 setelah pencampuran milt dan oosit. Pakan Ikan berupa pelet komersial (dengan kandungan nutrisi Protein 41% dan Lemak 6%). Bahan yang akan digunakan meliputi GnRH analog + domperidon, parafin dengan titik leleh 56-58 o C, larutan bouin, balok es, pewarna Carrazi s Haematoxylin, eosin, gelatin 1%, xylol, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 100%, giemza, metanol, dan akuades. Alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu water bath, saringan, spuit 1 ml, kertas tissue, pipet tetes, gelas ukur 100 ml, sendok plastik, botol fiksatif, cetakan parafin terbuat dari kertas karton, steples, specimen holder, mikrotom putar beserta asesorinya, lampu spiritus, kertas label, pinset, skapel, object glass, cover glass, milimeter block, hot plate, eye piece graticle, cawan petri, oven inkubator, mikroskop binokuler, camera digital, gunting bedah, aerator, countainer/wadah pemeliharaan, dan wadah plastik. B. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian dilaksanakan selama 9 bulan dimulai dari Mei 2014 Februari 2015. C. Metode Penelitian 1. Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan secara eksperimental menggunakan rancangan dasar berupa Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau Completely randomized design dengan 4 (empat) perlakuan dan 6 (enam) ulangan. Perlakuan yang dicobakan meliputi: 1) Kejut panas 40 o C selama 90 detik pada menit ke 25. 2) Kejut panas 40 o C selama 90 detik pada menit ke 27. 3) Kejut panas 40 o C selama 90 detik pada menit ke 29. 4) Kontrol (tanpa pemberian kejut panas). 9
2. Variabel yang diamati Variabel bebas yang diamati yaitu waktu pemberian kejut panas, sedangkan variabel tergantung adalah diferensiasi gonad. Parameter utama yang diamati berupa struktur gonad, jumlah dan ukuran sel germinalis primordia, dan volume gonad. Parameter pendukung meliputi panjang dan berat ikan, pengukuran eritrosit, dan jumlah larva hidup pada akhir penelitian. 3. Bagan Alir Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian 10
4. Cara Kerja 4.1. Pemijahan dan Stripping Induk Ikan Nilem Induk ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) jantan dan betina matang gonad disiapkan, ovaprim disuntikkan kepada masing-masing induk ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V.) jantan dan betina, dengan dosis 0,5ml/kg BB. Selanjutnya ditempatkan dalam satu akuarium dan ditunggu selama 8-10 jam. Pada saat induk telah menunjukkan tanda-tanda akan memijah, masing-masing induk ikan jantan dan betina distripping untuk mendapatkan milt dan oosit. 4.2. Perlakuan Poliploidisasi Empat wadah plastik disiapkan sebagai kontrol, perlakuan 25 menit, 27 menit, dan 29 menit, milt dan oosit disatukan dibeberapa wadah plastik, ditambahkan akuadest atau air untuk mengaktivasi sperma, kemudian wadah plastik diagitasi secara perlahan, setelah itu sel telur disaring untuk menghilangkan milt dan dimasukkan ke dalam wadah pertama sebagai kontrol. Sel telur lainnya dimasukan ke kontainer yang telah diberi aerasi, untuk selanjutnya akan diberi kejut panas pada menit ke 25, 27, dan 29 menit setelah pencampuran milt dan oosit. Pada waktu yang telah ditentukan, sel telur ditelakkan ke dalam saringan dan diberi kejut panas dengan mencelupkan sel telur tersebut ke dalam water bath yang telah disiapkan pada suhu 40 o C. Pemberian kejut panas dilakukan selama 90 detik. Sel telur yang telah diberi kejut panas dimasukkan ke dalam wadah penetasan yang telah dipersiapkan agar embrio berkembang dan menetas 4.3. Pemeliharaan Benih Hasil Poliploidisasi Larva hasil penetasan dari masing-masing perlakuan kejut panas dipelihara selama 4 bulan dalam kontainer bervolume 25 l yang masingmasing berisi 25 ekor. Pemberian pakan ikan dilakukan 2 kali sehari pada pagi dan sore hari. 4.4. Pengukuran Panjang dan Berat Ikan Pada hari ke 30, 60, 90, dan 120 setelah penetasan, secara acak diambil 6 ekor sampel, diamati morfologinya kemudian diukur panjang dan berat 11
masing-masing. Pengukuran panjang total ikan dilakukan menggunakan kertas milimeter block dengan ketelitian 1mm. Pengukuran berat ikan dilakukan menggunakan timbangan digital dengan ketelitian 0,01 mg, kemudian hasil yang didapatkan dicatat, selanjutnya ikan difoto. 4.5. Pembuatan Sediaan Histologi 1) Ikan yang telah diukur panjang dan beratnya dimatikan. 2) Proses embedding menggunakan metode paraffin. 3) Setelah paraffin membeku direkatkan pada holder dari kayu dan diberi kode nomor spesimen. 4) Pengirisan blok paraffin dilakukan dengan menggunakan rotary microtome dengan ketebalan 5 µm. 5) Pita yang didapatkan dari hasil pemotongan dicelupkan kedalam air hangat dan kemudian dilekatkan ke objek glas yang telah dilapisi gelatin 1 %. 6) Proses Pewarnaan jaringan menggunakan Carrazi s Haematoxylin dan eosin (Prosedur lengkap pembuatan sediaan histologi gonad ikan nilem disajikan pada Lampiran. 3). 4.6. Evaluasi Sediaan Histologi Gonad diidentifikasi sebagai struktur berpasangan terletak di sebelah ventral gelembung renang. Di dalam gonad terdapat primordial germ cell berbentuk bulat dengan rasio inti terhadap sel relatif besar dengan inti bersifat metakromatik dan jaringan somatis. Gonad dibungkus oleh lapisan tunica dan dihubungkan dengan dinding dorsal tubuh melalui mesenterium dorsal (Nakamura, 2013). Seluruh irisan pada masing-masing sampel dievaluasi di mikroskop, jumlah irisan yang memperlihatkan keberadaan gonad dihitung (I). Jumlah irisan yang memiliki gonad dibagi sepuluh, hasil bagi tersebut (x) digunakan sebagai interval dalam evaluasi struktur gonad. Pada setiap sampel dievaluasi 10 irisan dengan jarak (x). Pada setiap irisan yang diamati diukur luasnya (A) menggunakan eye piece graticle yang telah dikalibrasi Volume gonad dihitung menggunakan Cavaliery principles dengan rumus sebagai berikut: V= A. x. 10. t Keterangan t = ketebalan irisan gonad yaitu 5µ 12
Gambar 3.2. Skema Pengukuran Volume Gonad menggunakan eye piece graticle Jumlah seluruh PGC pada setiap irisan yang digunakan untuk pengukuran volume gonad dihitung dan dicatat. Diameter PGC diperoleh dengan mengukur 10 sel pada setiap irisan yang digunakan untuk pengukuran volume gonad. 4.7. Pengukuran Eritrosit Sebagai data pendukung pada penelitian ini dilakukan pengukuran dimensi eritrosit dan inti eritrosit serta dihitung volume eritrosit dan inti eritrosit, luas eritrosit, rasio diameter panjang dan lebar inti dan eritrosit serta rasio inti dan eritrosit. Sediaan eritrosit disiapkan dengan membuat preparat apus darah yang diperoleh dari vena caudal masing-masing sampel (Prosedur pembuatan sediaan apus darah disajikan pada Lampiran 2). Sebanyak 100 sel dari masing-masing sampel digunakan untuk evaluasi ukuran eritrosit. Pengukuran dilakukan menggunakan eye piece micrometer yang telah dikalibrasi (Felip, 2009). Gambar 3.3. Skema Pengukuran Diameter Eritrosit Luas Eritrosit dan luas inti eritrosit dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : S = (a/2) x (b/2) Keterangan : a = diameter panjang b = diameter lebar 13
Volume eritrosit dan volume inti eritrosit dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : D. Metode Analisis Veritrosit = 4/3 x x (A/2) x (B/2) 2 Vinti eritrosit = 4/3 x x (a/2) x (b/2) 2 Keterangan : A = Panjang eritrosit B = Lebar eritrosit a = Panjang inti eritrosit b = Lebar inti eritrosit Data hasil pengukuran volume gonad, jumlah dan ukuran PGC selanjutnya dianalisis menggunakan ANOVA satu arah. Apabila nilai p<0,05 maka analisis dilanjutkan dengan BNT. Struktur gonad dianalisis secara deskriptif. Keterkaitan antara ukuran eritrosit ( panjang dan volume inti eritrosit) dan panjang tubuh serta jumlah PGC dan volume gonad dianalisis menggunakan uji korelasi. 14