SELF-PROPAGATING ENTREPRENEURIAL EDUCATION DEVELOPMENT BIOINDUSTRI: Kinetika Pertumbuhan Mikroba Nimas Mayang Sabrina S, STP, MP Lab. Bioindustri, Jur Teknologi Industri Pertanian Universitas Brawijaya Email : nimas.sunyoto@ub.ac.id 1. PENDAHULUAN - Pengantar - Tujuan - Definisi 2. PERTUMBUHAN MIKROBA 3. KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBA 4. PERHITUNGAN MIKROBA MODUL 7 Minggu 7 1. PENDAHULUAN 1.1 Pengantar Sebagai makhluk hidup, mikroba mempunyai satu ciri penting, yaitu tumbuh dan berkembang biak. Seperti layaknya makhluk hidup yang lain, bakteri mempunyai suatu siklus hidup, mulai dari pertumbuhan, masa stasioner sampai akhirnya mencapai tahapan kematian. Pengetahuan mengenai kinetika pertumbuhan mikroba penting untuk diketahui dalam rangka penggunaan agen mikroba dalam dunia bioindustri. Dalam modul ini akan dipelajari mengenai pertumbuhan mikroba, kurva pertumbuhan dan perhitungan mikroba. Dengan diketahuinya pengetahuan mengenai pertumbuhan mikroba ini diharapkan akan dapat mengoptimalkan penggunaan mikroba dalam dunia bioindustri. 1.2 Tujuan Penguasaan materi dalam modul ini, yang dirancang sebagai landasan dasar Bioindustri, akan dapat Mengetahui dan mengenal perhitungan sel mikrobia, kinetika dan pertumbuhan mikrobia.
1.3 Definisi Persamaan yang menunjukkan laju pertumbuhan mikroorganisme dan laju produksi produk serta beberapa faktor yang berpengaruh Contoh : kinetika pertumbuhan mikroorganisme dan laju penghasilan produk 2. PERTUMBUHAN MIKROBA 2.1 Pembelahan Biner Sebagian besar bakteri tumbuh melalui suatu mekanisme yang disebut dengan pembelahan biner. Dalam pembelahan biner, bakteri membelah menjadi dua sel yang identik, yang kemudian membelah lagi menjadi empat, delapan, enam belas, tiga puluh dua dan seterusnya, seperti yang terlihat pada Gambar. Proses pembelahan biner tersebut adalah sebagai berikut: Sel induk membesar dan menduplikasi DNA Sekat sel membagi isi sel menjadi 2 bagian Hasil akhir menjadi 2 anakan sel identik Waktu yang diperlukan untuk membelah diri disebut waktu generasi. Waktu generasi berbeda pada satu spesies dengan spesies yang lain. Seperti contohnya Escheria coli yang dapat membelah hanya dalam waktu 20 menit, akan tetapi Mycobacterium spp baru dapat membelah dalam waktu berjam-jam. Waktu generasi dalam suatu spesies tidak selalu tetap karena bergantung terhadap berbagai faktor antara lain medium, spesies dan umur bakteri. 3. KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBA 3.1 Kurva Pertumbuhan Pertumbuhan bakteri dibagi menjadi empat tahapan yaitu fase lag, fase log, fase stasioner dan kematian seperti dapat dilihat pada gambar. Fase Lag Pada fase log, jumlah sel hanya sedikit. Pada fase ini mikroba mulai menyesuaikan diri dengan lingkungan baru. Beberapa enzim dan zat perantara dibentuk sehingga Page 2 of 8
keadaannya memungkinkan terjadinya pertumbuhan lebih lanjut. Ukuran sel mulai membesar tetapi belum membelah diri. Fase Pertumbuhan yang Dipercepat Bakteri sudah mulai membelah diri, tetapi waktu generasinya masih panjang. Fase pertumbuhan yang dipercepat bersama-sama dengan fase permulaan sering disebut lag phase atau phase of adjustment. Fase Pertumbuhan Logaritma Dalam jangka waktu tertentu, mikroba akan mengalami peningkatan dalam hal ukuran tertentu dan setelah periode waktu tertentu biomas tersebut menjadi dua kali lipat. Dapat dilihat pada gambar bahwa pada fase log atau terkadang dikenal dengan fase eksponensial, jumlah sel yang ada dalam kultur mengalami kenaikan jumlah yang pesat. Waktu generasi pada fase ini berlangsung pendek dan konstan. Metabolisme pada fase ini berlangsung paling pesat, jadi sintesis bahan sel sangat cepat dan konstan. Keadaan ini berlangsung terus sampai salah satu atau beberapa nutrien habis atau telah terjadi penimbunan atas hasil metabolisme yang bersifat racun yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan. Fase Stationer yang Maksimum Mikroba pada fase stasioner, jumlah mikroba cenderung stabil, dengan sedikit kematian. Adanya penurunan kandungan nutrisi dan meningkatnya penimbunan zat-zat racun zat-zat racun yang menghambat kecepatan pembelahan menjadi semakin meningkat. Oleh karena itu bakteri yang mati juga meningkat. Pada fase ini jumlah bakteri yang dihasilkan sama dengan jumlah bakteri yang mati sehingga jumlah bakteri yang hidup menjadi konstan. Fase Kematian yang Dipercepat dan Fase Kematian Logaritma Kedua fase ini biasanya dikenal dengan fase menurun. Pada fase ini kecepatan kematian semakin meningkat sedang kecepatan pembelahan menjadi nol. Setelah sampai ke fase kematian, logaritma kecepatan kematian mencapai maksimal dan jumlah sel menurun dengan cepat. Page 3 of 8
3.2. Laju Pertumbuhan Spesifik Laju pertumbuhan spesifik (μ) adalah laju pertumbuhan yang ditunjukkan pada setiap fase pertumbuhan bakateri. Pembagian masing-masing fase tersebut dapat dilihat pada gambar. Laju pertumbuhan dapat dihitung dengan menggunakan formula: Keterangan : F = laju alir V = volume kultur = laju kematian spesifik dx dt μx F X αx V Akumulasi sel = pertumbuhan pengeluaran sel yang mati Sedangkan untuk kultur batch, formula penghitungan laju pertumbuhan spesifik dapat dihitung dengan persamaan berikut: F X 0 dan α μ V dx 1 dx μx μ dt X dt Laju Penggunaan Substrat Akumulasi Substrat = substrat masuk substrat yang dikonsumsi untuk pertumbuhan substrat yang dikonsumsi untuk sintesis produk substrat yang dikonsumsi untuk perawatan substrat keluar Secara lebih lengkap, laju penggunaan substrat dinyatakan dalam persamaan berikut ini: ds dt F V μx qpx S0 mx Y Y x s p s F S V Page 4 of 8
Keterangan: F = Laju alir (l/jam) V = Volume kultur (l) So = [substrat yang masuk] (g/l) Yx/s = koefisien rendemen biomassa = Yp/s = koefisien rendemen produk = gram sel yang dibentuk gram substrat yang dikonsumsi gram produk yang dibentuk gram substrat yang dikonsumsi μ= laju pertumbuhan spesifik qp = laju pembentukan produk spesifik m= koefisien pemeliharaan = gram produk yang dibentuk gram substrat yang dikonsumsi Laju penggunaan substrat pada kultur batch 1 ds q s X dt 4. PERHITUNGAN MIKROBA Secara umum terdapat dua macam metode perhitungan mikroba, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Metode langsung meliputi penggunaan mikroskop, viable plate count, filtrasi membran dan most probable number (angka paling mungkin), sedangkan metode secara tidak langsung dapat dilakukan dengan metode turbidity dan dry weight determination (perhitungan berdasarkan berat kering). Metode langsung: (a) Mikroskopik Ilustrasi metode mikroskopik dapat dilihat pada gambar di bawah: Metode perhitungan sel secara langsung menghitung sel yang hidup dan mati secara total pada sebuah slide khusus dengan petak pengukuran. (b) Viable plate count (perhitungan mikroba hidup pada lempeng) Terkadang jumlah bakteri pada sampel yang ada terlalu besar untuk dihitung secara langsung. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk menentukan jumlah sel adalah dengan menggunakan viable plate count. Sampel yang akan dihitung pertama-tama diencerkan dalam sebuah larutan yang tidak akan Page 5 of 8
membahayakan mikroba namun sebaliknya juga tidak mendukung pertumbuhan mikroba tersebut (sehingga mikroba tidak akan tumbuh selama masa analisa). Pada kebanyakan kasus volume dari larutan (atau bagian dari padatan) dari sampel pertama kali diencerkan 10 kali pada larutan buffer dan dicampur secara sempurna. Pada kebanyakan kasus, sebuah porsi 0,1-1,0 ml pada pengenceran pertama kemudian diencerkan lebih lanjut sebanyak 10 kali, sehingga total pengencerannya adalah 100 kali. Proses ini diulangi kembali sampai konsentrasinya yang diperkirakan menjadi 1000 sel per ml tercapai. Pada teknik sebarang pada cawan petri beberapa pengenceran tertinggi (kerapatan bakteri terendah) kemudian diambil dan disebar tangkai gelas steril pada sebuah medium padat yang akan membantu mikroba untuk tumbuh. Perlu dipastikan bahwa cairan disebar akan terendam pada akar. Hal ini dilakukan agar mencegah tersisanya cairan pada permukaan yang menyebabkan koloni menumpuk menjadi satu. Metode kedua untuk menghitung bakteri hidup adalah teknik penuangan pada cawan petri, yang terdiri dari satu bagian larutan dengan agar cair dan menuang campuran pada cawan petri. Pada setiap kasus, pengenceran sampel sudah cukup tinggi sehingga sel tunggal tersimpan dalam agar dan hal tersebut memberikan peningkatan pada koloni. Dengan menghitung setiap koloni, jumlah total dari unit koloni yang terbentuk/colony forming units (CFUs) pada cawan ditentukan. Dengan mengalikan perhitungan ini dengan total pengenceran larutan, maka dimungkinkan untuk menghitung jumlah total CFUs pada sampel sebenarnya. Gambar mengenai pengenceran tersebut dapat dilihat pada gambar berikut: Page 6 of 8
(c) Most probable number (Angka yang Paling Mungkin) MPN adalah suatu teknik penghitungan mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel. Contoh: Data yang didapat adalah 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu dicocokkan dengan tabel menghasilkan nilai 150 MPN/gram. Metode Tidak Langsung (a) Turbidity (Kekeruhan) Pengukuran kekeruhan memerlukan beberapa alat untuk menentukan jumlah dari cahaya yang dipencarkan oleh sebuah suspensi sel. Partikel kecil seperti bakteri dapat menghamburkan cahaya sesuai dengan jumlahnya. Kekeruhan atau kerapatan optikal dari suspensi sel berhubungan secara langsung dengan massa sel atau jumlah sel, setelah pembuatan dan kalibrasi kurva standar. Metode ini sederhana dan tidak merusak sel, akan tetapi sensitifitasnya terbatas pada sekitar 10 7 sel per ml untuk kebanyakan bakteri. Prinsip kerja dari turbiditas tersebut dapat dilihat pada gambar. (b) Penentuan berat kering Metode lain yang dapat dipakai adalah metode perhitungan berat kering bakteri. Salah satu cara yang digunakan adalah dengan pengukuran volatile suspended solid (VSS) Page 7 of 8
REFERENSI Anonymous. 2012. Viable Plate Count. http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=book&func=displayarticle&art_id =106. Diakses pada 20 Juli 2012 E. Indra Pradika. 2011. Metode MPN (Most Probable Number) atau APM (Angka Paling Mungkin). http://ekmon-saurus.blogspot.com/2011/03/metode-mpnmost-probable-number-atau.html. Diakses pada 20 Juli 2012 Suharto, Ign. 1995. Bioteknologi dalam Dunia Industri. Andi offset, Yogyakarta. Todar, Kenneth. 2012. The Growth of Bacterial Populations. http://textbookofbacteriology.net/growth.html. Diakses pada 20 Juli 2012 PROPAGASI A. Latihan dan Diskusi (Propagasi vertical dan Horizontal) 1. Menurutmu, metode mana yang paling efektif untuk digunakan dalam perhitungan bakteri? B. Pertanyaan (Evaluasi mandiri) 1.Sebutkan fase-fase dalam pertumbuhan bakteri! 2. Mengapa mulai ada sedikit dari jumlah bakteri yang mati pada fase stasioner? 3. Apa yang dimaksud dengan turbidity? 4. Apa yang dimaksud dengan MPN? 5. Mengapa turbidity dapat digunakan untuk menghitung bakteri? C. QUIZ 1. Jelaskan ruang lingkup bioindustri! 2. Apakah perbedaan antara kapang dan khamir? 3. Jelaskan contoh bioindustri yang melibatkan peran bakteri! 4. Jelaskan mengenai urutan fase pertumbuhan bakteri! 5. Bagaimana mekanisme pelaksanaan perhitungan bakteri dengan menggunakan most probable number atau angka yang paling mungkin? Page 8 of 8