ANALISIS KERAGAMAN ISOZIM LAKTAT DEHIDROGENASE PADA BERBAGAI TINGKAT PROLIFIKASI INDUK DOMBA EKOR TIPIS (Variance Analysis of Lactate Dehydrogenises Isozim to Prolification Level Various of Javanese Thin-Tail Ewes) M.Y. SUMARYADI, PRAYITNO, D. PURWANTINI dan A. SUSANTO Fakultas Peternakan Universitas Jend. Soedirman, Purwokerto ABSTRACT Thirty Javanese thin-tail ewes were selected base on parity of 2-3 and litter size using to study variance of Lactate Dehydrogenises (LDH) Isozim in relation to prolification level of ewes. The experiment ewes were allocated into three groups. The first group was low prolification, second group was middle prolification, and third group was high prolification. All experiment ewes were injected prostaglandin (7.5 mg luprositol per head) to same of follicle growth phase. In the heat, ten ml of blood samples were drawn with plain vacutainer from the jugular vein to concentration analysis and pattern of isozim protein of LDH by electrophoresis. The result of experiment show that LDH concentration has different significantly (P<0.01) between prolification level of ewes, then this isozim can used to predict of prolification level of ewes with precision of 66.67%. The result of analysis of electrophoresis indicate pattern of isozim protein variance, although number of sample was very limited. It is concluded that variance analysis of LDH indicate to different prolification level of ewes. Key words: Isozim, lactate dehydrogenises (LDH), prolification, ewes ABSTRAK Tiga puluh induk domba ekor tipis diseleksi berdasarkan paritas 2-3 dan jumlah anak sekelahiran yang digunakan untuk mempelajari keragaman isozim laktat dehidrogenase (LDH) kaitannya dengan tingkat prolifikasi induk domba. Domba percobaan dikelompokan menjadi tiga kelompok masing-masing kelompok I mewakili tingkat prolifikasi rendah, kelompok II mewakili tingkat prolifikasi sedang, dan kelompok III mewakili tingkat prolifikasi tinggi. Seluruh domba percobaan disuntik prostaglandin (7,5 mg luprositol/ekor) untuk menyeragamkan fase pertumbuhan folikel. Pada saat berahi, sampel darah diambil dari vena jugularis untuk menganalisis konsentrasi maupun pola protein isozim LDH. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi isozim LDH berbeda sangat nyata (P<0,01) antar tingkat prolifikasi induk domba. Bahkan konsentrasi isozim ini dapat digunakan untuk memprediksi tingkat prolifikasi induk domba ekor tipis, walaupun dengan tingkat kebenaran prediksi sebesar 66,67%. Hasil analisis gel elektroforesis menunjukkan pola keragaman protein isozim walaupun dengan jumlah sample yang relatif sedikit. Disimpulkan bahwa analisis keragaman isozim LDH dapat menunjukan indikasi perbedaan tingkat prolifikasi domba. Kata kunci: Isozim, laktat dehidrogenase (LDH), prolifikasi, domba PENDAHULUAN Domba ekor tipis pada umumnya bersifat prolifik dengan jumlah anak satu sampai empat ekor per induk untuk setiap kelahiran. Hasil penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa sifat prolifikasi ternak domba dipengaruhi oleh gen tunggal FecJ F (Fecundity Java) yang bekerja secara aditif (BRADFORD et al., 1991; ELSEN et al., 1991). Kehadiran gen FecJ pada populasi domba di 59
Indonesia menyebabkan variasi dalam jumlah anak yang dilahirkan. Namun untuk mengidentifikasi gen prolifikasi pada domba tersebut masih perlu dikaji secara mendalam. Ditinjau dari aspek reproduksi, keragaman jumlah anak yang dilahirkan induk sangat erat kaitannya dengan laju ovulasi (BRADFORD et al., 1986) yang dipengaruhi oleh hormon FSH-LH (MCDONALD, 1980). Modulasi kedua hormon tersebut ternyata mampu meningkatkan jumlah folikel yang berovulasi pada ternak domba (SUMARYADI dan HARYATI, 2000; SUMARYADI et al., 2000). FSH-LH merupakan hormon glikoprotein yang disintesis seperti umumnya protein, yaitu hasil ekspresi lokus gen melalui proses transkripsi dan translasi DNA yang melibatkan reaksi enzimatis. Keadaan ini dimungkinkan bahwa keragaman laju ovulasi berkaitan dengan tipe alel yang memodulasi hormon dari hasil ekspresi sekelompok gen yang terdapat pada rantai DNA. Laktat dehidrogenase (LDH) merupakan isozim yang dapat digunakan untuk menguji keragaman genetik (SOFRO, 1993). Enzim ini berperan dalam mengkatalisis substrat yang akan digunakan sebagai prazat (prekursor) pembentukan hormon glikoprotein. Konsentrasi enzim ini sangat penting mengingat proses deglikosilasi elepasan karbohidrat)dari hormon glikoprotein menyebabkan penurunan konsentrasi hormon (SWEDLOW et al., 1996). Jika protein isozim yang dianalisis antar individu tidak bervariasi, maka gen yang mengendalikan protein tersebut tidak bervariasi atau sebaliknya (SINGER dan BUG, 1991). Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari konsentrasi dan keragaman isozim laktat dehidrogenase (LDH) kaitannya dengan tingkat prolifikasi induk domba. Hasil penelitian ini diharapkan dapat membuka jalan bagi kajian-kajian lanjutan untuk memperoleh salah satu indikator penciri keragaman prolifikasi domba induk, sehingga seleksi dapat dilakukan secara dini. 60 MATERI DAN METODE Rangkaian penelitian ini merupakan suatu percobaan lapangan menggunakan domba ekor tipis dengan berbagai tingkat prolifikasi dari Kelompok Tani Ternak Domba Amanat Desa Kedungjati, Bukateja, Purbalingga, yang dilanjutkan dengan analisis secara laboratoris untuk mengukur konsentrasi dan keragaman lisozim laktat dehidrogenase (LDH). Ternak dan protokol percobaan Penelitian ini enggunakan 30 domba ekor tipis yang telah diseleksi berdasarkan jumlah anak sekelahiran (JAS) dan paritas 2 sampai 3 sesuai dengan catatan yang ada selama hidupnya. Domba percobaan dikelompokan menjadi tiga kelompok dengan ketentuan kelompok I (prolifikasi rendah) adalah induk yang pernah beranak 2 sampai 3 kali dengan masing-masing JAS = 1, kelompok II (prolifikasi sedang) adalah induk yang pernak beranak 2 sampai 3 kali dengan masing-masing JAS = 2, dan kelompok III (prolifikasi tinggi) adalah induk yang pernak beranak 2 sampai 3 kali dengan masing-masing JAS = 3. Seluruh domba percobaan kemudian disuntik prostaglandin (7,5 mg luprositol/ekor) untuk menyeragamkan fase pertumbuhan folikel. Pada saat berahi, sampel darah diambil dari vena jugularis untuk menganalisis konsentrasi dan keragaman isozim laktat dehidrogenase. Penentuan konsentrasi enzim digunakan metode DEUTCHER (1990) dengan menggunakan substrat Natrium piruvat dan NADH. Piruvat akan direduksi oleh NADH menjadi laktat dan menghasilkan warna biru. Perhitungan konsentrasi LDH didasarkan pada perubahan nilai serapan warna dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm, sedangkan analisis keragaman isozim LDH dilakukan dengan menggunakan 6 ekor sample domba masing-masing dua ekor untuk setiap tingkat prolifikasi dengan teknik gel elektroforesis.
Analisis statistik Untuk melihat perbedaan konsentrasi LDH dari masing-masing prolifikasi dilakukan analisis variansi, kemudian dilanjutkan dengan analisis fungsi diskriminan untuk memprediksi tingkat prolifikasi berdasarkan konsentrasi LDH yang diolah dengan menggunakan program SPSS for windows release 9.0, dengan persamaan: Di = bo + b i j E j untuk i = 1, 2, 3 bo = konstanta (intersep) bi j = koefisien arah untuk enzim pada saat ke-j dari induk yang mempunyai tingkat prolifikasi ke-i E j = aktivitas enzim pada saat berahi ke-j Setelah fungsi diskriminan (Di) dengan (i = jumlah anak 1, 2, 3) diperoleh, maka aturan untuk memprediksi tingkat prolifikasi induk (A) adalah sebagai berikut: D1>D2 dan D1>D3 maka A = induk beranak 1 (prolifik rendah), D2>D1 dan D2>D3 maka A = induk beranak 2 (prolifik sedang), dan D3>D1 dan D2>D1 maka A = induk beranak 3 (prolifik tinggi). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil rataan konsentrasi enzim laktat dehidrogenase (µg/ml) pada berbagai tingkat prolifikasi domba disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Rataan Konsentrasi enzim laktat dehidrogenase (µg/ml) pada berbagai tingkat prolifikasi domba Tingkat Prolifikasi Prolifikasi Rendah Prolifikasi Sedang Prolifikasi Tinggi Konsentrasi LDH (µg/ml) 749,10 ± 87,04 a 885,60 ± 66,76 b 949,80 ± 53,76 c Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01) Berdasarkan data pada Tabel 1 menunjukkan bahwa rataan seluruh konsentrasi enzim laktat dehidrogenase pada saat berahi untuk tingkat prolifikasi rendah, sedang, dan tinggi masing-masing adalah 749,10±87,04; 885,60±66,76; dan 949,80±53,76 µg/ml. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa konsentrasi laktat dehidrogenase berbeda sangat nyata (P<0,01) antar tingkat prolifikasi induk domba. Ini berarti bahwa konsentrasi laktat dehidrogenase meningkat dengan meningkatnya tingkat prolifikasi. Besarnya peningkatan konsentrasi enzim laktat dehidrogenase dari tingkat prolifikasi rendah ke sedang dan ke tinggi masing-masing mencapai 18,22 dan 26,79%. Prediksi terhadap tingkat prolifikasi induk domba dilakukan dengan fungsi diskriminan berdasarkan keterangan konsentrasi enzim laktat dehidrogenase pada saat berahi, dan memberikan tingkat kebenaran prediksi 66,67% seperti disajikan pada Tabel 2. 61
Tabel 2. Hasil analisis diskriminan tingkat prolifikasi induk domba Kelompok Total data Total benar Proporsi benar Prolifikasi Rendah 10 7 0,70 Prolifikasi Sedang 10 6 0,60 Prolifikasi Tinggi 10 7 0,70 Total 30 20 0,6667 Hasil dari Tabel 1 menunjukkan bahwa proporsi kebenaran prediksi terhadap tingkat prolifikasi rendah, sedang, dan tinggi masing-masing adalah mencapai 70,00; 60,00; dan 70,00%. Ini berarti dari setiap 10 ekor induk yang beranak satu, dua, dan tiga (prolifikasi rendah, sedang, dan tinggi) terprediksi secara benar masing-masing sebanyak 7, 6, dan 7 ekor. Hal ini mengingat jumlah anak berkorelasi dengan laju ovulasi (PIPER dan BINDON, 1984; BRADFORD, 1985), yang dipengaruhi oleh hormon FSH-LH (MCDONALD, 1980). Modulasi kedua hormon tersebut ternyata mampu meningkatkan jumlah folikel yang berovulasi pada ternak domba (SUMARYADI dan HARYATI, 2000). FSH-LH merupakan hormon glikoprotein yang disintesis seperti umumnya protein. Enzim ini berperan dalam mengkatalisis substrat yang akan digunakan sebagai prazat (prekursor) pembentukan hormon glikoprotein. Aktivitas enzim ini sangat penting mengingat proses deglikosilasi (pelepasan karbohidrat) dari hormon glikoprotein menyebabkan penurunan konsentrasi hormon (SWEDLOW et al., 1996). Semakin tinggi sekresi hormon FSH-LH tentunya akan meningkatkan laju ovulasi dan memperbesar peluang kisaran jumlah anak yang akan dilahirkan oleh seekor induk. Prediksi terhadap tingkat prolifikasi rendah (D1), sedang (D2), dan tinggi (D3) berdasarkan konsentrasi LDH (X) pada saat berahi masing-masing mempunyai proporsi kebenaran prediksi 70,00; 60,00; dan 70,00% dengan mengikuti persamaan fungsi diskriminan sebagai berikut: D1 = - 56.403 + 1.151 LDH (X), D2 = -78.831 + 0.178 LDH (X), dan D3 = -90.675 + 0.191 LDH (X). Ketiga fungsi diskriminan ini memberikan tingkat kesalahan prediksi terhadap tingkat prolifikasi rendah, sedang, dan tinggi masing-masing sebesar 30,00, 40,00, dan 30,00%. Berdasarkan fungsi diskriminan yang diperoleh ternyata batas garis antara daerah prediksi tingkat prolifikasi rendah dan sedang mengikuti persamaan Y = 22.4281 2.7440 X, sedangkan batas garis antara daerah prediksi tingkat prolifikasi sedang dan tinggi mengikuti persamaan Y = 34.2719 4.0345 X (X adalah konsentrasi enzim laktat dehidrogenase saat berahi). Garis batas ini diperoleh dengan menyamakan dua fungsi diskriminan, yaitu D1 = D2 dan D2 = D3. Artinya tingkat prolifikasi induk domba yang tidak terprediksi secara benar akan masuk ke luar daerah batas garis persamaan yang telah ditentukan tersebut. Kenyataan ini memberikan peluang adanya keterkaitan antara aktivitas LDH dengan tingkat prolifikasi, sehingga perlu dikaji pola keragaman lokus isozim laktat dehidrogenase berdasarkan analisis gel elektroforesis. Hasil analisis keragaman isozim LDH yang diukur dari dua ekor sample domba untuk setiap kelompok ditunjukan pada Gambar 1. Berdasarkan gambar tersebut menunjukkan bahwa ada indikasi terjadinya keragaman jenis pola protein (bersifat multimerik) yang dapat dibedakan pada domba prolifik. Namun perbedaan pola protein antar masing-masing domba prolifik secara spesifik belum dapat diidentifikasi, karena jumlah sampel domba yang digunakan relatif sedikit. 62
Pr 1 Pr 2 Ps 1 Ps 2 Pt 1 Pt 2 Gambar 1. Mobilitas relatif protein LDH untuk tingkat prolifikasi rendah (Pr), prolifikasi sedang (Ps), dan prolifikasi tinggi (Pt) dalam hasil gel elektroforesis KESIMPULAN DAN SARAN Konsentrasi enzim laktat dehidrogenase pada saat berahi untuk tingkat prolifikasi rendah, sedang, dan tinggi masing-masing adalah 749,10; 885,60; dan 949,80 µg/ml. Prediksi terhadap tingkat prolifikasi induk domba dilakukan dengan fungsi diskriminan berdasarkan keterangan konsentrasi enzim laktat dehidrogenase pada saat berahi, ternyata memberikan tingkat kebenaran prediksi sebesar 66,67%. Kenyataan ini memberikan petunjuk untuk diteliti lebih lanjut pola keragaman lokus isozim laktat dehidrogenase berdasarkan analisis gel elektroforesis sebagai penciri masing-masing tingkat prolifikasi domba dengan sample yang lebih banyak UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada QUE Project Sub Program Studi Produksi Ternak Fakultas Peternakan UNSOED, atas penyediaan sumber dana (dengan kontrak perjanjian nomor: 096/J.23.SP QUE II/PS PT/VI/2000Tanggal 11 Juni 2000) serta kepada Sutarmo, Musalam, dan Mahasiswa Tim Riset Grant atas bantuan dan pelaksanaan penelitian. DAFTAR PUSTAKA BRADFORD, G.E. I. INOUNU, L.C. INIGUEZ, B. TIESNAMURTI and D.L. THOMAS, 1991. The Prolificacy Gene of Javanese Sheep. Dalam: J.M. Elsen, L. Bodin and J. Thimonier (Ed). Major Gene for Reproduction in Sheep. Proc. 2 nd Int. Workshop, Toulouse, France, July 16-18, 1990. pp:67-74. 63
BRADFORD, G.E., J.F. QUIRKE, P. SITORUS, I. INOUNU, B. TIESNAMURTI, F.L. BELL, I.C. FLETCHER and D.T. TORELL. 1986. reproductioin in Javanese Sheep: Evidence for Gene with Large Effect on Avulation Rate and Litter Size./ J. Anim. Sci. 63: 418-431. BRADFORD, G.E. 1985. Selection for Litter size. In Genetics of Reproduction in Sheep. R.B. Land and D.W. Robinson Ed. Butterworth, London. Pp. 3-18. DEUTCHER. M.P. 1990. Gude To Protein Purification. Methods In Enzymology. Academic Press INC. San Diego, New York. ELSEN, J.M., L. BODIN and J. THIMONIER. 1991. Major Gene for Reproduction in Sheep. INRA Paris. PIPER, L.R. and B.M. BINDON. 1984. Ovulation rate as selection criterion for improving littersize in Merino sheep. In Reproduction in sheep. D.R. Lindsay and D.T. Pearce Ed. Cambridge University Press, Cambridge. Pp. 237-239. SINGER, M. and P.BUG. 1991. Gene and Genoms. A Changigng Perspectip. University Science Books. California. SOFRO, A.S. M. 1993. Keragaman Genetik. PAU-Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. SUMARYADI, M.Y, HARYATI dan W. MANALU. 2000. Efek Penyuntikan PMSG terhadap konsentrasi progesteron kaitannya dengan Pertumbuhan Kelenjar Uterus Domba pada Fase Luteal Siklus Berahi. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner, Puslibangnak Bogor pp. 111-115 SUMARYADI, M.Y. dan HARYATI. 2000. Pemanfaatan kelimpahan folikel dengan Teknik Ovulasi Ganda untuk produksi embrio dan perbaikan kinerja reproduksi induk resipien. Laporan Penelitian QUE project Program Studi Produksi Ternak, Fakultas Peternakan Unsoed Purwokerto. SWEDLOW, J.R., R.L. MATTERI and H. PARKOFF. 1996. Deglycosylation of Gonadothropine with an Endoglycosidase. Proc. Soc. Exp. Biol. And Med. 18: 432-437. Pertanyaan: DISKUSI Apakah pengujian keragaman LDH dapat dilaksanakan pada domba yang masih anak/muda? untuk mempersingkat seleksi. Jawaban: Penelitian ini output-nya bertujuan mempercepat seleksi secara dini sehingga bisa dilakukan pada anak yang baru dilahirkan, dengan asumsi bahwa secara genetik pola protein spesifik LDH tidak akan berubah jika telah ditemukan untuk setiap prolifikasi. 64