TEKNOLOGI PRODUKSI ENZIM MIKROBIAL Ani Suryani FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PENDAHULUAN Sumber Enzim Tanaman dan Hewan Mikroba Enzim dari Tanaman
Enzim dari Hewan
Enzim dari Mikroba
TEKNOLOGI ISOLASI, PENYIMPANAN DAN AMOBILISASI Replikasi Transkripsi Intraseluler Translasi Enzim Ekstraseluler Membran Melekat pada membran 1. Berada di sekitar sel 2. Berdifusi ke lingkungan 3. Diangkut ke organ lain Letak Enzim Fungsional
Tahapan umum ekstraksi dan isolasi enzim industrial
A.EKSTRAKSI DAN SEPARASI Tahapan : 1. Pemecahan Sel 2. Klarifikasi dan presipitasi 3. Sentrifusi dan Filtrasi 4. Pengeringan dan Proses Lanjutan
1. Pemecahan Sel Pemecahan Sel Mekanis Non mekanis Bentuk cair Bentuk padat Manipulasi lingkungan Kimiawi dan Enzimatis Pemecahan dengan gelembung netrasonik (sonikator) Agitasi mekanis dengan tekanan (pompa penekan French pressure) Homogenasi dan penggilingan dengan mortar/blender Penghancuran dengan Hammer mill Freeze-thaw kejutan osmotik Penggunaan vakum desikasi Penambahan detergen ionik/non ionik, lisozim, dsb. Berbagai metode pemecahan dinding sel
2. Klarifikasi dan Presipitasi Klarifikasi : Pemisahan berbagai partikel non enzim yang tercampur dengan enzim yang dilakukan dengan cara mengendapkan partikel tersebut tanpa mengumpalkan enzimnya. Penambahan senyawa yang menimbulkan penggumpalan senyawa non enzim yang tidak diinginkan ini akan memudahkan pemurnian selanjutnya. Contoh : - amonium fosfat - asam askorbat - garam-garam kalsium - serat selulose - sistein - tanah diatome - asam fosfat - garam Na fosfat -Nasulfat -Nasitrat
Presipitasi : Penambahan senyawa yang hanya menggumpalkan protein dan tidak menggumpalkan bahan lain, dan dengan sendirinya akan memisah dan lebih memurnikan enzim yang dihasilkan. Dua jenis medote kimiawi yang digunakan : 1. Menambahkan pelarut organik Misal : metanol, etanol, isopropanol dan seton 2. Menambahkan garam Misal : amonium sulfat, natrium sulfat, sodium sulfat
Ion garam yang ditambahkan mempengaruhi kelarutan protein. 1. Salting in pada konsentrasi rendah ion-ion garam akan melingkupi molekul protein dan mencegah bersatunya molekul-molekul ini, sehingga protein melarut. 2. Salting out pada konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi diantara sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan menurunkan kelarutan protein. Pada skala laboratorium, proses pemurnian lanjutan biasanya tidak menghendaki kelebihan garam. Garam yang tersisa dari proses penggumpalan enzim ini harus dipisahkan dengan dialisis atau filtrasi gel (desalting)
Proses disalting enzim setelah pengendapan oleh garam a. Dialisis b. Filtrasi gel
Enzim-enzim dan beberapa protein mempunyai kemampuan untuk membentuk garam dengan penambahan logam. Terbentuknya garam akan menurunkan kelarutan protein ion garam yang ditambahkan mempengaruhi kelarutan protein. Bagan alat pemekat protein oleh senyawa bertekanan osmosis tinggi
4. Pengering dan dan proses lanjutan Enzim dapat dijual dalam bentuk cair atau padat, tepung/serbuk, tablet dan bentuk amobil. Enzim cair diperoleh setelah dilakukan pemekatan dengan evaporasi vakum. Proses penguapan harus dilakukan pada suhu yang tidak merusak struktur dan fungsi hayati enzim. Pengeringan vakum pada suhu rendah umumnya dipergunakan pada skala laboratorium dan terlalu mahal apabila dilakukan pada skala industrik. Pada skala industri proses spray dryer dapat dipergunakan. Kekurangan proses ini adalah menyebabkan penurunan aktivitas enzim karena suhu yang dipergunakan relatif tinggi.
Contoh ekstraksi enzim mikrobial dari fermentasi cair
Proses pembuatan enzim bebas debu
Bentuk jual beberapa enzim industri
PEMURNIAN ENZIM DENGAN KHROMATOGRAFI DAN ELEKTROFORESIS 1. Khromatografi Kolom Khromatografi kolom : sistem pengaliran suatu fluida melalui kolom yang mengandung matrik bahan pengisi dan substanta yang ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan daya ikat terhadap bahan pengisi. Metode khromatografi kolom : 1. Khromatografi Pertukaran Ion dan Filtrasi Gel 2. Khromatografi Afinitas 3. Khromatografi Interaksi Hidrofobik 4. Khromatogarfi Cair Metode Cepat
Proses khromatografi pertukaran ion dan gel filtrasi
Gambaran skematis khromatografiafinitas. E : enzim yang ingin diisolasi, L : ligan dan ( ) komponen dalam campuran yang tidak memiliki afinitas terhadap ligan
Filtrasi selektif untuk pemekatan cairan enzim
Manfaat aplikasi Khromatografi kolom pada skala besar Jenis khromatografi Filtrasi gel Pertukaran ion Afinitas Interaksi hidrofobik Aplikasi Baik digunakan pada tahap akhir pemurnian; kapasitasnya terbatas pada kecepatan fraksinasi rendah. Paling baik digunakan pada tahap awal khromatografi, untuk menanpung volume yang besar, karena kapasitasnya yang tinggi, apabila digunakan matriks yang tepat. Biasanya digunakan pada tahap menjelang akhir. Kapasitasnya dipengaruhi oleh jenis protein yang dipisahkan. Dapat dipergunakan baik pada tahap awal maupun akhir. Perlu digunakan eluen dengan polaritas/kekuatan ion tinggi. Jadi paling baik dilakukan setelah khromatografi pertukaran ion atau setelah pengendapan dengan garam. Kapasitas dan resolusinya tinggi, demikian pula kecepatannya.
2. Elektroforesis Elektroforesis : Suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan di bawah pengaruh medan listrik. Di dalam larutannya, protein enzim akan bermuatan bergantung kepada ph larutan, dan titik iso listrik enzim. Jenis elektroforesis : 1. Elektroforesis kertas 2. Elektroforesis selulosa aseta/nitrit 3. Elektroforesis gel Yang bermanfaat bagi pemisahan protein adalah elektroforesis gel, sedangkan jenis elektroforesis lainnya bermanfaat dalam pemisahan molekul yang lebih kecil.
Pemisahan protein dengan elektroforesis
Penggunaan Senyawa aditif dan contoh enzim yang distabilkan
AMOBILISASI ENZIM Pada umumnya penggunaan enzim hanya terbatas sekali pakai saja, sehingga setiap mulai pengolahan atau analisis harus menggunakan enzim baru. Untuk mengatasi kekurangan-kekurangan dalam penggunaan enzim konvensional, teknologi enzim membuat enzim amobil baik untuk tujuan proses pengolahan dengan sistem batch maupun proses dengan sistem kontinyu. Enzim amobil adalah suatu enzim yang secara fisik maupun kimia tidak bebas bergerak sehingga dapat dikendalikan atau diatur kapan enzim harus kontak dengan substrat.
Membukanya konformasi enzim
1. Metode Pengikatan Silang Stabilitas konformasi enzim melalui pengikatan silang
Pembentukan Basa Schiff pada Reaksi Glutaraldehida dengan Sisi Samping Lisin pada Enzim
Berbagai Pereaksi Multifungsional yang Dimanfaatkan dalam membuat Enzim Amobil
2. Metode Pengikatan dengan Bahan Penyangga Stabilitas Konformasi enzim Melalui Pengikatan dengan Bahan Penyangga
Beberapa Gugus Fungsional Polimer Penyangga dan Protein Enzim yang berikatan secara Kovalen
3. Metode Penjebakan Stabilitas konformasi enzim karena terlindung oleh suatu matriks polimer
Stabilitas konformasi enzim karena terlindung oleh proses kopolimerisasi gel
Penggunaan enzim amobil secara berulang-ulang
TERIMA KASIH