BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2004 Pebruari 2005 di Sub Laboratorium Biologi Laboratorium Pusat MIPA UNS Surakarta sebagai tempat untuk mengadakan perlakuan, pemeriksaan kualitas spermatozoa, pengamatan, dan pemotretan preparat, serta di Laboratorium Pathologi Balai Besar Veteriner Wates sebagai tempat pembuatan preparat awetan testis. A. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Kandang pemeliharaan dan kandang perlakuan (Lampiran 26). Kandang pemeliharaan terbuat dari plastik dan alumunium berukuran 60cm x 40cm x 20cm, berjumlah 5 kandang, alas kandang menggunakan sekam. Kandang perlakuan terbuat dari kayu dan triplek berukuran 30cm x 30cm x 50cm yang terdiri dari dua ruangan, ruangan atas untuk menempatkan mencit dan ruangan bawah untuk meletakkan rokok yang akan dibakar, ruangan atas dan bawah dipisahkan oleh kasa kawat, semua sisi kandang tertutup rapat kecuali bagian atas kandang terdapat lubang yang ditutup dengan kasa untuk keluar masuknya udara. Pada kandang pemeliharaan dan kandang perlakuan terdapat tempat makan dan minum. 21
b. Timbangan digital (Mettler Toledo AT 400) c. Peralatan untuk pengamatan kualitas spermatozoa: bilik hitung Haemasitometer Neubauer, stop watch, cawan petri, pipet tetes, gelas benda, gelas penutup, batang pengaduk, hot plate (Kika Laboratechnik), mikroskop cahaya (Olympus), dan disecting kit d. Peralatan untuk pembuatan preparat awetan testis: bak parafin, disecting kit, kertas label, botol flakon, gelas benda, gelas penutup, oven (Memmert), rotary microtome (Fuji Optical Electronic), staining kit, holder, cawan petri, hot plate (Kika Laboratechnik), pipet tetes, dan mikroskop cahaya (Olympus) e. Peralatan untuk fotomikrografi: mikroskop cahaya yang terhubung dengan kamera (Nikon Eclipse E 400) dan film Fuji ASA 200 2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Hewan uji berupa mencit jantan (Mus musculus L.) galur Swiss berumur kurang lebih 2 bulan dengan berat badan kurang lebih 20 g berjumlah 25 mencit, diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) Yogyakarta b. Rokok kretek Djarum 76 c. Bahan pembuatan preparat 1) Kloroform untuk narcose mencit
2) Bahan untuk pembuatan preparat pengamatan morfologi spermatozoa dan viabilitas spermatozoa: Irisan cauda epididimis, garam fisiologis (NaCI 0,9%), neutral red 1%, dan giemsa 3% 3) Bahan untuk pembuatan preparat awetan testis dengan metode parafin: Formalin 4% untuk fiksasi, garam fisiologis, alkohol bertingkat, xylol, toluol, parafin, pewarna Hematoxylin-Eosin Y, akuades, Mayer s albumin, dan enthellan. d. Bahan pakan mencit yaitu BR-2 dan air minum berupa air ledeng C. Cara Kerja 1. Rancangan Percobaan Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan rancangan percobaan dengan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) menggunakan lima macam perlakuan dengan lima ulangan pada masing-masing perlakuan. 2. Cara Perlakuan a. Sebelum penelitian dimulai hewan uji diaklimasi dalam lingkungan laboratorium selama satu minggu untuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Kemudian hewan uji ditimbang untuk mengetahui berat badan awal, setelah itu hewan uji dimasukkan dalam kandang perlakuan. b. Rokok dibakar ujungnya kemudian diletakkan pada kandang perlakuan. Tiap kandang perlakuan berisi lima mencit. Setelah rokok yang terakhir habis terbakar, mencit dikeluarkan dari kandang perlakuan. Selama perlakuan hewan uji diberi makan dan minum ad libitum. Perlakuan dilaksanakan setiap
hari selama 32 hari. Pada hari ke-33 semua hewan uji dikorbankan. Untuk kelompok kontrol, hewan uji dikorbankan menyertai hewan perlakuan. Perincian pembagian kelompok dan perlakuan adalah sebagai berikut: Kelompok I : Mencit tanpa paparan asap rokok sebagai kontrol Kelompok II : Mencit dengan perlakuan paparan asap rokok dari 1 batang rokok/hari/5 mencit untuk tiap kandang perlakuan Kelompok III : Mencit dengan perlakuan paparan asap rokok dari 2 batang rokok/hari/5 mencit untuk tiap kandang perlakuan, rokok dibakar satu per satu Kelompok IV : Mencit dengan perlakuan paparan asap rokok dari 3 batang rokok/hari/5 mencit untuk tiap kandang perlakuan, rokok dibakar satu per satu Kelompok V : Mencit dengan perlakuan paparan asap rokok dari 4 batang rokok/hari/5 mencit untuk tiap kandang perlakuan, rokok dibakar satu per satu 3. Pengambilan Sampel Hewan uji dibius dengan kloroform kemudian dibedah menggunakan disecting kit untuk mengambil organ testis dan cauda epididimis. Dari sampel yang telah diambil kemudian dibuat preparatnya.
4. Pembuatan Preparat a. Irisan Melintang Testis Sebelum pembuatan preparat awetan testis, potongan testis sebelah kanan ditimbang terlebih dahulu. Dari potongan tersebut dibuat preparat irisan dengan metode parafin menggunakan pewarna HE menurut Suntoro (1983) dan diamati di bawah mikroskop meliputi penghitungan jumlah sel spermatogonia, spermatosit primer, spermatid, dan lapisan sel spermatogenik, serta mengamati susunan sel-sel spermatogenik. Setiap preparat diamati sebanyak 10 penampang melintang tubulus seminiferus berpenampang bulat secara acak. b. Preparat Apus Spermatozoa Potongan cauda epididimis diambil dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah diisi 1 ml garam fisiologis (NaCI 0,9 %) dengan suhu 37 C - 40 C. Kemudian cauda epididimis dipotong-potong sampai halus dan diaduk dengan gelas pengaduk sampai terbentuk suspensi spermatozoa. 1) Morfologi Spermatozoa Suspensi spermatozoa diteteskan di atas gelas benda, dibuat preparat apus dan dikeringkan di udara. Sediaan apus difiksasi dengan metil alkohol selama 3-5 menit, kemudian diwarnai dengan giemsa 3% selama 45 menit. Preparat dicuci dengan akuades dan dikeringkan di atas hot plate. Diamati dengan mikroskop perbesaran 400 kelainan-kelainan bentuk atau abnormalitas yang terlihat. Dari 100 spermatozoa yang diamati, dihitung persentase sel yang normal dan abnormal.
2) Viabilitas Spermatozoa Suspensi spermatozoa diteteskan dan diratakan di atas gelas benda, diwarnai dengan neutral red 1% dengan cara meneteskannya di atas gelas benda, kemudian ditutup dengan gelas penutup dan langsung diamati di bawah mikroskop perbesaran 400. Spermatozoa hidup tidak berwarna sedangkan spermatozoa yang mati berwarna merah. Dari 100 spermatozoa yang diamati, dihitung persentase sel hidup dan sel mati. 3) Kecepatan Gerak Spermatozoa Suspensi spermatozoa diteteskan pada alat bantu bilik hitung Haemasitometer Neubaeur dan diamati di bawah mikroskop perbesaran 400. Ditentukan spermatozoa yang memiliki pergerakan normal (gerak progresif). Dengan menggunakan stop watch, ditentukan lama waktu yang diperlukan spermatozoa tersebut untuk bergerak secara lurus menempuh jarak sisi bujur sangkar kecil. Waktu yang digunakan spermatozoa untuk menempuh jarak tersebut dikonversikan ke dalam mikrometer / detik. Diulangi untuk setiap 10 spermatozoa dan dihitung rata-ratanya. 4) Motilitas Spermatozoa Suspensi spermatozoa diteteskan pada alat bantu bilik hitung Haemasitometer Neubaeur dan diamati di bawah mikroskop perbesaran 400 gerakan-gerakan spermatozoa. Dilakukan penilaian kualitas spermatozoa berdasarkan motilitasnya dengan nilai 0 sampai 5 sebagai berikut : 0 : spermatozoa tidak bergerak 1 : gerak berputar di tempat
2 : gerakan berayun atau melingkar, kurang dari 50% spermatozoa motil bergerak progresif, dan tidak ada gelombang 3 : antara 50% sampai 80% spermatozoa motil bergerak progresif dan menghasilkan gerakan masa 4 : pergerakan progresif yang gesit dan segera membentuk gelombang dengan 90% spermatozoa motil 5 : gerakan yang sangat progresif, gelombang yang sangat cepat, menunjukkan 100% spermatozoa motil (Toelihere, 1985). D. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisa dengan Analisis Varians (ANOVA) dengan metode RAL pada ketelitian 5 % kemudian untuk mengetahui beda nyata antar perlakuan dilanjutkan dengan uji DMRT (Duncan s Multiple Range Test) dengan menggunakan program komputer SPSS 10. Dari hasil perhitungan dilakukan analisis terhadap parameter berat testis, jumlah sel spermatogonia, spermatosit primer, spermatid, dan lapisan sel spermatogenik, serta kecepatan gerak spermatozoa, persentase motilitas spermatozoa, persentase viabilitas spermatozoa, dan persentase morfologi spermatozoa.