Kawalatur Expresi Gen Gene Expression and Regulation A. Sintesis Protein a) Kod Genetik * Maklumat dalam gen dibawa dalam bentuk kod= kod genetik. * jujukan asid nukleik pada mrna dibaca mengikut kodon= 1 kodon terdiri daripada 3 bes. * 1 asid amino mungkin dikodkan oleh lebih daripada satu kodon. * Korana, Nirenberg dan Leder memainkan peranan penting dalam penyelidikan kod genetik 1
Kod Genetik 2
* Contoh: DNA: TAC AAA AAG GTT TCG CAC ACT mrna:aug UUU UUC CAA AGC GUG UGA AA: Met Phe Phe Gln Ser Val *** Kodon Mula: ATG (>90%), GTG (>10%) Kodon Stop : UGA, UAA, UAG 3
b) Peranan mrna * messenger RNA dihasilkan oleh polimerase RNA menggunakan DNA (kromosom) sebagai templat. Proses digelar TRANSKRIPSI * mrna membawa maklumat tentang protein yang perlu dihasilkan didalam jujukan asid nukleiknya. * jujukan mrna di TERJEMAHKAN oleh ribosom untuk menghasilkan jujukan asid amino (protein) 4
Transkripsi RNA polimerase TGTTGACA--11-15bp--TATAAT--5-8bp-- -35-10 * Jujukan -35 dan -10 (Pribnow box, TATAA box) yang ditunjukkan ialah jujukan konsensus Gen -10 rrna2 TATTAT rrne1 TATAAT rrnd1 TATAAT biob TAGGTT trp TTAACT lac TATGTT Tapak Transkripsi Mula * Enzim RNA polimerase bersentuhan dengan templat DNA di bahagian -35 dan -10 * Nukleotida pertama yang ditranskripsikan lazimnya purina: A atau G * mrna: 5
SD Kodon Kodon (RBS) Mula Stop Bahagian yang diterjemahkan 3-10 nukleotida diantara RBS dan Kodon Mula SD (jujukan Shine -Dalgarno) = RBS (Ribosome binding site) * Jujukan RBS adalah komplementari pada suatu jujukan dalam 16S rrna yang terdapat dalam subunit 30S ribosom. mrna 5'-UAAGGAGGNNNNNNNNNAUG 3' 16SrRNA OH-AUUCCUCC-(~1400 NNN)-5' 6
Kodon Mula * Amino asid pertama dalam rantai peptida ialah "Methionine" * Oleh itu "Kodon Mula" lazimnya: ATG (>90%) * Dalam beberapa gen kodon mula didapati mempunyai jujukan GTG (>10%) * GTG dijumpai sebagai kodon mula dalam organisma yang mempunyai kandungan GC yang tinggi dalam kromosom e.g. M. tuberculosis (65% kromosomnya terdiri daripada G dan C) * Sekiranya GTG kodon mula dalam sesuatu gen, GTG mula ini masih kod untuk methionine BUKAN valine 7
c) mrna splicing * Gen eukariot terdiri daripada intron dan exon Intron Exon DNA mrna mrna matang * Splicing berlaku dalam nukleus * mrna matang lah yang akan diterjemahkan Homework: Apakah mekanisma yang digunakan dalam mrna splicing? 8
c) Peranan Ribosom * Ribosom dijumpai dalam sitoplasma sel * Lebihkurang 10,000 ribosom dalam satu sel: kilang protein Ribosom prokariot: * Satu subunit 30S & satu subunit 50S subunit (= 70S) * Subunit 30S terdiri drpd. 16S RNA + 21 proteins * Subunit 50S terdiri drpd. 23S & 5S RNA + 34 proteins * Boleh mengesan RBS pada mrna * mempunyai 2 tapak mengikat trna (transfer RNA) 9
d) Peranan trna * struktur: 3 "hairpin loops" * ~ 60 jenis dalam bakteria (>100 dalam eukariot) * panjang: 73-93 nukleotida 10
* mengandungi bes yang dimodifikasi (selepas dihasilkan): e.g. pseudouridine, inosine * tapak antikodon: mengesan dan mengikat kodon di mrna * Asid amino dilekatkan kepada "asid amino arm" melalui aktiviti enzim aminoacyl trna synthetase Homework: Berapakah jumlah asid amino? Berapakah jumlah aminoacyl trna synthesase? Berapakah jumlah trna dalam prokariot dan eukariot? Berapakah jumlah kodon dalam kod genetik? 11
Beberapa fakta penting tentang trna untuk methionine: * Ada sekurang-kurangnya 2 trna untuk methionine: trna i Met yang membawa methionine untuk kodon mula (AUG) trna Met yang membawa methionine untuk kodon AUG lain dalam rantaian. * methionine trna synthetase akan melekatkan methionine kepada kedua-dua jenis trna: Met- trna i Met Met- trna Met * Dalam bakteria kumpulan amino dalam methionine dalam Met- trna i Met dimodifikasikan: "formylated" 12
(a) Langkah-langkah Permulaan (Initiation) dalam Sintesis Protein * Proses sintesis bermula dengan subunit 30S (melalui 16S rrna) mengesan dan mengikat mrna pada jujukan RBS. Proses dibantu IF (initiation factors)- Kompleks Permulaan 30S * 50S ribosome mengikat mrna dan subunit 30S; IF terbebas dan GTP dihidrolisiskan untuk tenaga * trna membawa N-formylmethionine ke posisi pertama (tapak P) menghasilkan: Kompleks Permulaan 70S 13
(b) Pemanjangan (Elongation) * 2 tapak bersebelahan dalam ribosom: P & A * Tapak A terima trna-aa baru; dalam contoh ini trna yang membawa phenylalanine (Phe-tRNA Phe ) * Asid amino methionine akan diikat dengan asid amino phenylalanine menghasilkan permulaan rantai peptida 14
* Ribosome akan bergerak ke arah kodon seterusnya menyebabkan Phe-tRNA Phe dan rantai peptida baru dipindahkan dari tapak A ke tapak P (pergerakan ini digelar translokasi) * Tapak A akan menjadi kosong * trna Met yang tidak lagi mempunyai amino asid methionine akan terkeluar dari kompleks ini * Perlu tenaga (GTP) and faktor-faktor pemanjangan (elongation factors) * Leu-tRNA Leu yang membawa leucine pula bersedia untuk memasuki kompleks ini. 15
* Leu-tRNA Leu akan mengambil tempat di tapak A * Rantai Met--Phe akan bersambung dengan asid amino Leu menghasilkan rantai peptida Met--Phe--Leu * Proses ini berterusan dan rantaian akan berpanjangan: GTP dan Faktor Pemanjangan G (G elongation factor) diperlukan dalam sistem prokariot. * Pemanjangan akan berhenti apabila proses pemberhentian berlaku 16
(c) Pemberhentian (Termination) * Berlaku apabila ribosom mengesan kodon berhenti "stop codon": UAG, UAA, or UGA * Faktor-faktor pemberhentian (termination factors': TF) menyebabkan komplex ribosom-mrna terurai. 17
B. Kawalan Ekspresi Gen (a) Kawalan diperingkat transkripsi: * Banyak gen terdapat dalam bentuk operon: beberapa gen dikawal oleh satu promoter * Oleh itu bila promoter off semua gen dalam operon tidak diekspresikan. Homework: Review lac and trp operons! * Kawalan transkripsi melalui mobilisasi gen Promoter Gene A Gene B Gene B Gene A 18
* Kawalan transkripsi melalui flip-flop promoter Promoter * Promoter kuat dan promoter lemah (strong and weak promoters) * Pemberhentian Transkripsi (Transcription termination) Dalam prokariot kromosom kecil-gen berdekatan diantara satu dengan yang lain Kawalan pemberhentian transkripsi penting untuk menghalang masaalah penghasilan mrna yang tidak betul. 19
Dua mekanisma utama: a) Rho-dependent (perlu protein Rho termination factor) * 50% tapak pemberhentian menggunakan protein Rho - tiada persamaan jujukan dapat dilihat * Protein Rho berasosiasi dengan rantaian mrna dan interaksi ini mengaktifkan aktiviti ATPase * Rho bertranslokasi di atas mrna ke arah 3' * Mungkin "menolak" RNA polymerase daripada templat DNA 20
b) Rho independent (tidak perlu protein khas) mrna forms Stem - Loop RNA polymeras 21
22
(a) Kawalan diperingkat terjemahan: * jumlah gen rrna: lagi banyak gen rrna lagi banyak ribosom dihasilkan dan lebih cepat ekspresi * mrna prokariot bersifat polisistron: satu mrna mengkodkan lebih dari satu gen dan diekspresikan serentak. * Gen-gen dalam kerangka terjemahan berlainan AUG GCG ACG UUU UUA UGC GCC UGC 23
Jenis-jenis ekspresi 1. Constitutive * Sentiasa diekspresikan * contoh: gen ribosomal, gen-gen replikasi dan transkripsi, metabolisme 2. Inducible * Ekspresi perlu diransangkan * Contoh: lac operon. Bila lactose ditambah dalam medium E. coli, enzim ß- galactosidase dan lac permease dihasilkan dalam beberapa minit. * repressor lac menghalang transkripsi. Lactose mengikat protein repressor. Kedua-dua enzim diekspresikan sekali. * Lazim melibatkan kemasukan bahan dari luar kedalam sel. 24
3. Repressible * Gen dieskpresikan secara normal (contoh gen penghasilan asid amino tertentu) * Jika asid amino tersebut terdapat dalam medium dan masuk kedalam sel atau penghasilan asid amino melebihi keperluan: asid amino berlebihan mengikat repressor protein dan kompleks asid amino-repressor menghalang transkripsi 4. Cryptic * Gen yang tidak ditranskripsi *? 25