UJI MUTAGEN (AMES TEST) Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB
Pendahuluan Lingkungan di sekitar kita banyak mengandung senyawa karsinogen (cancer-causing agents) misalnya sinar UV, polutan industri, pestisida, food additives dan produk tobacco Analisis terhadap berbagai senyawa kimia yang makin hari semakin banyak digunakan, menjadi perhatian utama peneliti toksikologi, karena kecurigaan terhadap kemungkinan bahaya kanker yang mungkin diakibatkan oleh senyawa tersebut. Senyawa karsinogen ini dapat menginduksi kanker karena mereka bersifat mutagen (dapat menyebabkan mutasi, yang dapat mengubah susunan DNA
MUTAGEN Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat meningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi (perubahan) dapat mempengaruhi reproduksi sel, bahkan kadangkala menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali Beberapa contoh mutagen, antara lain senyawa kimia mustard, etil metil sulfonat, sinar uv, radiasi sinar x, dll. Mutagenesis adalah proses pembentukan mutasi
Beda MUTAGEN dan KARSINOGEN Karsinogen menyebabkan KANKER Mutagen menyebabkan MUTASI, tidak selalu menyebabkan KANKER
Klasifikasi senyawa karsinogen menurut aktivitasnya dalam tahapan karsinogenesis Initiating agent (incomplete carcinogen) : Senyawa kimia yang hanya menginisiasi sel Promoting agent : senyawa yang menyebabkan ekspansi sel yang terinisiasi Progressor agent : senyawa yang dapat mengubah sel yang terinisiasi atau sel yang ada dalam tahap promosi menjadi sel yang berpotensi menjadi sel kanker Karsinogen lengkap (complete carcinogen) : senyawa yang mampu menginduksi kanker dari sel normal, biasanya memiliki sifat inisiasi, promosi dan progessor
Epidemiologi karsinogenesis epidemiologi adalah studi tentang distribusi dan determinan penyakit melalui observasi terhadap eksperimen yang terkontrol. Observasi atau pengamatan termasuk : pengamatan episodik pengamatan retrospektif pengamatan prospektif
Hubungan faktor karsinogenik dengan kanker yang terjadi Penyebab senyawa karsinogen Kemungkinan kanker yang dapat terjadi Bukti karsinogenitas Minuman beralkohol Esophagus, hati, orofaring, laring Cukup aflatoksin Hati cukup Makanan (lemak, protein, kalori) Payudara, kolon, endometrium, kemih cukup merokok Mulut, faring, laring, paru-paru, esophagus, kemih cukup Senyawa pengalkil Kemih, leukemia cukup Senyawa arsen Kulit, hati cukup Kloramfenikol leukemia terbatas Estrogen premonopause Sel hati cukup Estrogen postmonopause Endometrium Terbatas
Penyebab kematian karena kanker Makanan : 35% Rokok : 30% Infeksi : 10% Perilaku seksual : 7% Pekerjaan : 4% Faktor geofisik : 3% Alkohol : 3% Polusi : 2% Produk industri < 1% Zat penambah makanan < 1%
Uji senyawa karsinogen Uji jangka pendek (short-term test) : dikembangkan untuk mengidentifikasi senyawa karsinogenik yang berpotensi atas dasar kapasitasnya untuk menginduksi mutasi pada DNA di dalam sel secara in-vitro atau in-vivo. Contoh test : Ames test. Pada Ames test, digunakan mikroba Salmonella typhimurium. Selain uji mutasi bakteri, ada pula uji mutasi sel mamalia secara in-vitro, uji mutasi gen secara in-vivo menggunakan mencit, uji kerusakan DNA secara in-vitro. Uji jangka menengah : uji kronis 1 tahun : Uji menggunakan 50 ekor tikus Uji jangka panjang : uji kronis 2 tahun : Multi stage models pada perkembangan neoplasti
AMES Test Ames test adalah uji untuk menentukan apakah suatu senyawa adalah mutagen. Nama test ini diambil dari nama penemunya yaitu Bruce Ames. Bruce Ames dkk pada tahun 1970an menemukan suatu metode uji dengan menggunakan bakteri khusus yang sangat sensitif terhadap senyawa2 mutagen Penggunaan Ames test adalah berdasarkan asumsi bahwa setiap senyawa yang bersifat mutagenik terhadap bakteri yang digunakan, dapat berubah menjadi karsinogen yang dapat menyebabkan kanker
The Food and Drug Administration (FDA) USA saat ini menggunakan metode yg dikembangkan Ames untuk menapis senyawa2 kimia secara cepat dan murah Walaupun demikian, pada kenyataannya, beberapa senyawa yang menyebabkan kanker pada hewan percobaan (misalnya dioksin) tidak menunjukkan positif pada Ames test (atau kebalikannya)
Ames test sangat murah dan mudah, sehingga banyak yang beranggapan bahwa test ini tidaklah valid Bakteri yang digunakan : Galur mutan Salmonella typhimurium
Mengapa menggunakan galur mutan? Biakan induk (Wild-type) dari Salmonella typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpa penambahan asam amino. Hal ini dimungkinkan karena mereka membuat asam amino mereka sendiri dengan jalur biosintesis yang berbeda2 Pada mutan Salmonella typhimurium, tidak dapat tumbuh tanpa asam amino histidin karena mutasi ditujukan pada gen yang mengkode salah satu dari 9 enzim yang digunakan pada jalur biosintesis histidin
. Oleh karena itu, mutan Ames hanya akan tumbuh bila ada histidin di dalam medium pertumbuhan karena mutan tersebut tidak dapat mensintesis sendiri histidin tersebut. Mutan ini adalah mutan auxotroph yang disebut mutan histidine-dependent or his - (baca : hiss-minus)
Mutan auxotroph yang berinteraksi dengan senyawa sample, berubah menjadi prototroph Mutan prototroph dapat tumbuh baik dalam media tanpa histidin
Contoh Ames test untuk uji kualitatif Suatu suspensi biakan Salmonella typhimurium galur histidinerequiring (his ) ditumbuhkan dalam pelat agar yang mengandung campuran rat liver enzymes yang tidak mengandung histidin Sebuah filter paper di impregnasi dengan 10µg 2-aminofluorene, suatu karsinogen. Efek mutagenik senyawa ini dapat menyebabkan bakteri tersebut memperoleh kembali kemampuannya untuk tumbuh walaupun di dalam media tidak ada histidinnya. Hal ini menyebabkan tumbuhnya koloni bakteri disekitar disk filter paper.
Mengapa medium untuk Ames test ditambahkan ekstrak hati (liver extract)? Banyak senyawa kimia tidak bersifat mutagen atau karsinogen, tetapi dapat berubah menjadi mutagen atau karsinogen setelah dimetabolisme di dalam tubuh (hati) Bakteri uji adalah mikroba prokaryot, sedangkan manusia adalah eukaryot, oleh karena itu perlu ditambahkan campuran enzim2 hati organisme eukaryot (dalam hal ini hati tikus)
Bagaimana menghitung hasil Ames test? Jumlah koloni bakteri yang tumbuh merupakanukuranaktivitasmutagenik (potensi) dari senyawa yang digunakan Angka ini biasanya merepresentasikan jumlah revertants (bakteri yang termutasi) per mikrogram of mutagen atau per gram sampel yang mengandung mutagen
Koreksi terhadap hasil Ames test Pada umumnya mutasi spontan terjadi pada awal pembiakan bakteri dalam medium yang tidak mengandung histidin Hal ini perlu diperhitungkan sebelum menguji senyawa kimia yang dianalisis. Pada awal pengujian ditumbuhkan 10 8 sel bakteri, maka setelah beberapa waktu dihitung jumlah bakteri yang tumbuh, dan angka ini digunakan untuk pengurangan jumlah bakteri yang memang termutasi oleh senyawa kimia. Dengan cawan petri terpisah, baru dilakukan uji mutagen dengan menggunakan senyawa kimia yang diuji di dalam media yang ditambahkan campuran enzim hati tikus
Biakan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam di tempat gelap Jumlah koloni yang terbentuk menunjukkan revertans yang terbentuk yang sebanding dengan potensi senyawa mutagen
Galur mutan Salmonella typhimurium Galur mutan dari Salmonella typhimurium yang digunakan dalam Ames test memiliki sensitivitas yang berbeda-beda Galur TA 1535 memiliki satu substitusi basa yang menyebabkan missense mutation di dalam gen yang mengkode enzim pertama dalam sintesis histidin. Enzim yang dimiliki mutan mengandung proline sementara biakan induk mengandung leucine Galur TA 100 mirip dengan 1535, tetapi dapat mendeteksi jenis-jenis mutagen yang berbeda
Galur lain yang digunakan misalnya galur yang mengalami mutasi yang berbedabeda ( bisa frameshift, missense atau nonsense), pada operon histidin Beberapa galur yang digunakan juga termutasi pada uvrb, rfa, yang berakibat meningkatkan permeabilitas sel terhadap senyawa kimia tertentu
PROSEDUR Ekstrak homogenate rat liver (S9) dicampur dengan strain dari bakteri his-. Dengan tidak adanya histidin, bakteri tidak dapat tumbuh di dalam medium minimum (control). Pada saat bakteri dicampur dengan bahan yang diduga mutagen (X), terbentuknya revertant colonies menunjukkan bahwa beberapa hisbacteria telah termutasi (reverted) menjadi his+ dan dapat disimpulkan bahwa senyawa X adalah suatu mutagen.
Gambar uji mutagen
Jumlah koloni yang dihasilkan setara dengan besarnya efisiensi mutagen mengembalikan sifat mutan ke asalnya Suatu mutagen A menghasilkan jumlah revertans yang lebih tinggi dari kontrol, berarti mutagen A adalah betul-betul mutagen dan mungkin suatu karsinogen. Suatu mutagen B tidak menghasilkan jumlah revetans lebih banyak dari kontrol, maka dapat dikatakan bahwa senyawa B bukanlah suatu mutagen.
Metode lain untuk uji mutagen Menggunakan mencit transgenik yang disuntikkan dengan senyawa kimia (kandidat mutagen) DNA dari jaringan tertentu diisolasi lalu disisipkan dalam bakteriofaga, lalu ditransformasikan ke dalam E.coli E.coli ditumbuhkan dalam medium tertentu, dan dihitung frekuensi mutasi berdasarkan perbandingan jumlah koloni yang berwarna terhadap yang tidak berwarna