MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan Agustus 2011. Pelaksanaan penelitian di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Materi Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian antara lain autoclave, seperangkat alat analisis proksimat (analisis kadar air, protein kasar, protein murni, lemak kasar, serat kasar, dan analisi kadar abu) dan analisis protein murni, hammer mill, dan ph meter. Bahan yang diperlukan untuk penelitian adalah onggok, zeolit, urea, mineral formula ramos, kapang Aspergillus niger dan seperangkat bahan analisis proksimat dan protein murni. Prosedur Pembiakan Starter Aspergillus niger Cendawan stok diremajakan pada media Potato Dextrose Agar (PDA). Biakan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Biakan hasil peremajaan ini ditumbuhkan kembali pada cawan Petri berisi media PDA dan diinkubasi pada kondisi dan jangka waktu yang sama. Biakan ini digunakan sebagai sumber inokulum untuk dibiakkan (10%) pada media cair Buffered Peptone Water (BPW) dan diinkubasi kembali pada suhu 25 o C selama 72 jam. Kemudian di uji pada media PDA pada cawan, dengan metode pengenceran (1mL biakan ke dalam 9 ml Larutan BPW (1:9)), diambil 0,1 ml hasil pengenceran dan dimasukkan ke dalam cawan PDA, diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Jika terdapat pertumbuhan cendawan, maka biakan yang sudah ditumbuhkan pada BPW (1:10) tersebut dapat digunakan sebagai starter. Pembuatan Mineral Ramos et al. (1983) Menimbang (NH 4 )2SO 4 75 gram; Urea 40 gram; NaH 2 PO 4 15 gram; 7H 2 O 5 gram; KCl 1,5 gram; CaCl 2 0,5 gram; dan FeSO 4. 7H 2 O 0,75 gram. Kemudian semua bahan tersebut dilarutkan dalam satu liter aquades. 11
Onggok dicampur dengan zeolit (0; 2,5 atau 5% dari BK onggok) hingga homogen Disterilisasi selama 15 menit Didinginkan Ditambahkan Urea (0, 3, atau 6% dari BK onggok), Aspergillus niger (2% dari BK onggok), Larutan mineral formula ramos(1,5% dari BK onggok) Fermentasi selama 6 hari ditimbang Dikeringkan pada oven 60 C selama 48 jam Digiling dengan Hammer mill ditimbang Analisis Proksimat (kadar air, abu, lemak kasar, protein kasar, dan serat kasar) dan Protein Murni Gambar 3. Alur Proses Fermentasi 12
Proses Fermentasi Onggok di peroleh dari industri tapioka dari bogor kemudian dikeringkan dan digiling. Zeolit dalam bentuk tepung digunakan sebanyak 0; 2,5 dan 5% dari bahan kering onggok. Kedua bahan tersebut dicampur hingga homogen kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoclave dengan suhu 120 C dan tekanan 250 psi selama 15 menit. Setelah dingin dicampur dengan urea sebanyak 0; 3 dan 6% dari bahan kering onggok. Mineral formula Ramos et al. (1983) ditambahkan sebanyak 1,5% dari berat kering onggok. Seluruh bahan tersebut dicampur secara merata dan ditambahkan aquades untuk mencapai kadar air sekitar 75%. Selanjutnya starter Aspergillus niger ditambahkan sebanyak 2% dari bahan kering campuran bahan. Campuran kemudian dimasukkan kedalam ruang fermentasi dan diinkubasikan pada suhu 28 sampai 32 C selama 6 hari. Setelah waktu inkubasi selesai dilakukan pemanenan dengan menghentikan aktifitas kapang dengan cara dikeringkan di oven pada suhu 45 C selama 48 jam. Hasil fermentasi kemudian dianalisa kandungan bahan kering (BK), abu, lemak kasar (LK), protein kasar (PK), serat kasar (SK), dan protein murni (Gambar 3). Analisis Kualitas Nutrisi Onggok Fermentasi Kualitas onggok dievaluasi dengan menggunakan analisis proksimat yaitu Bahan Kering, Abu (ash), Protein Kasar, Lemak Kasar, Serat Kasar, BETN sesuai dengan AOAC (1999). Analisis Bahan Kering. Penentuan kadar air adalah dengan mengeringkan cawan dalam oven pada suhu 105 C selama 1 jam, kemudian dimasukkan dalam eksikator dan ditimbang (x), setelah itu sampel ditimbang kira-kira 5 gram (y) dan dimasukkan ke dalam cawan dan sampel dioven pada suhu 105 C selama 8 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator, lalu ditimbang (z). Alur analisis bahan kering dapat dilihat pada Gambar 4. Bahan kering dapat diketahui dengan menggunakan rumus : (x+y-z) x 100% Kadar Air = y Bahan Kering = (100 Kadar Air)% 13
Gambar 4. Alur Proses Analisis Kadar Air Analisa Kadar Abu. Cawan porselin dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C selama beberapa jam, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang (x). Sampel ditimbang kira-kira 5 gram (y) dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Setelah itu dipijar sampai tidak berasap, lalu dimasukkan dalam tanur pada suhu 600 C. Setelah abu menjadi putih seluruhnya, dimasukkan dalam eksikator dan ditimbang (z). Alur analisis kadar abu dapat dilihat pada Gambar 5. Kadar Abu dapat diketahui dengan menggunakan rumus: (z-x) x 100% Kadar Abu = y Gambar 5. Alur Proses Analisis Kadar Abu Analisa Kadar Serat Kasar. Sampel kira-kira 1 gram (x) dimasukkan dalam gelas piala 500 ml dan ditambahkan 50 ml H 2 SO 4 0.3 N, lalu dipanaskan selam 30 menit (dari mendidih). Setelah itu tambahkan 25 ml NaOH 1.5 N dan dididihkan kembali selama 30 menit. Cairan disaring dengan kertas saring (a) dengan corong Buchner dan dicuci berturut-turut dengan: 50 ml air panas, 50 ml H 2 SO 4, 50 ml air panas dan 14
25 ml Aceton. Kertas saring dan isinya dimasukkan dalam cawan porselin, lalu dioven pada suhu 105 C sampai kering. Setelah itu dimasukkan dalam eksikator selama 1 jam dan ditimbang (y), lalu dipijarkan dalam tanur sampai putih dan didinginkan kembali serta ditimbang (z). Alur analisis serat kasar dapat dilihat pada Gambar 6. Penentuan nilai kadar serat kasar dengan menggunakan rumus: Kadar Serat Kasar = (y-z-a) x 100% y Gambar 6. Alur Proses Analisis Kadar Serat Kasar Kasar Analisis Protein Kasar. Sampel kira-kira 0,3 gram (x) dimasukkan ke labu destruksi dan ditambahkatalis secukupnya serta 25 ml H 2 SO 4 pekat. Kemudian dipanaskan dalam ruangan asam sampai larutan menjadi jernih dan berwarna hijau kekuningan. Setelah itu didinginkan dan dimasukkan dalam labu penyulingan dan diencerkan dengan 300 ml air serta ditambah batu didih dan 100 ml NaOH 33%. Labu penyulingan dipasang dengan cepat diatas alat penyulingan hingga 2/3 cairan dalam labu penyulingan menguap yang ditangkap larutan H 2 SO 4 berindikator dalam labu elenmeyer (alur dapat dilihat pada Gambar 7). Hasil penyulingan dalam labu Erlenmeyer dititar dengan larutan NaOH 0,3N sampai warna menjadi biru kehijauan. Volume NaOH dihitung sebagai z ml dan dibandingkan dengan titar blanko y ml. penentuan nilai kadar protein kasar dengan menggunakan rumus: 15
Kadar Protein Kasar = (y-z) x N NaOH x 0,014 x 6,25 x x 100% Gambar 7. Alur Proses Analisis Kadar Protein Kasar Analisis Kadar Lemak Kasar. Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ektraksi soxhlet dikeringkan dalam oven. Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga bobot tetap. Sebanyak 5 g sampel sampel dibungkus dengan kertas saring, kemudian ditutup dengan kapas wol yang bebas lemak. Kertas saring yang berisi sampel tersebut dimasukkan dalam alat ekstrasi soxhlet, kemudian dipasang alat kondensor di atasnya dan labu lemak dibawahnya. Pelarut dietil eter atau petroleum eter dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran yang digunakan. Selanjutnya dilakukan refluks minimum 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada didalam labu lemak didestilasi dan ditampung. Kemudian labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 C, selanjutnya didinginkan dalam eksikator dan dilakukan penimbangan hingga diperoleh bobot tetap. Alur analisis kadar lemak dapat dilihat pada Gambar 8. Berat Lemak (g) Kadar Lemak Kasar = x 100% Berat Sampel (g) Gambar 8. Alur Proses Analisis Kadar Lemak Kasar 16
Analisis Kadar Protein Murni. Sampel kira-kira 1-2 gram kering ditambahkan batu didih dan 25 ml aquadest. Suspense dikocok dengan keras selama 10 menit kemudian didiamkan selama 20 menit. Larutan tri-chlor acetic acid 20% sebanyak 25 ml ditambahkan dan dikocok selama 10 menit, kemudian didiamkan selama tiga jam pada suhu 4 C (Freezer). Supernatan disaring melalui kertas saring Whatman 41 sampai didapat filtrate yang transparan. Kandungan N dalam filtrate ini ditentukan dengan metode Kjedahl (Gambar 9). Perbedaan antara protein kasar dengan NPN (Non Protein Nitrogen) adalah protein murni. Gambar 9. Alur Proses Analisis Kadar Protein Murni Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Faktorial 3x3x3. Dimana urea sebagai faktor pertama (0%; 3% dan 6%) dan zeolit sebagai faktor kedua (0%; 2,5% dan 5%). Ulangan yang dilakukan sebanyak 3 kali. Perlakuan yang digunakan antara lain : A1 : Onggok A2 : Onggok+ 3% Urea A3 : Onggok+ 6% Urea B1 : Onggok+2.5% Zeolit B2 : Onggok+ 2.5% Zeolit+3% Urea B3 : Onggok+ 2.5% Zeolit+6% Urea C1 : Onggok+5% Zeolit C2 : Onggok+ 5% Zeolit+3% Urea C3 : Onggok+ 5% Zeolit+6% Urea 17
Setiap perlakuan ditambahkan larutan mineral formula Ramos et al. (1983) kemudian difermentasikan dengan Aspergillus niger selama 6 hari. Model matematik yang digunakan dalam analisa adalah : Y ijk = + i + β j + ( β) ij + ijk Keterangan : Y ij : nilai pengamatan perlakuan faktor ke-i dan faktor ke-j : rataan umum i : efek level ke-i pada faktor baris A β j ij : efek level ke-j pada faktor kolom B : eror perlakuan Data yang diperoleh dianalisa menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan apabila hasilnya menunjukkan sangan berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan uji jarak Duncan (Steel dan Torrie, 1997) 18