II. METODOLOGI 2.1 Penyediaan Bakteri Probiotik Bakteri probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri NP5, yang merupakan bakteri dari genus Bacillus. Bakteri NP5 ini merupakan bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan nila dan telah dilakukan beberapa uji seperti uji ketahanan terhadap ph asam, uji penempelan, serta uji patogenisitas (Putra 2010). Penyediaan bakteri probiotik diawali dengan menumbuhkan bakteri NP5 ke dalam media Trypticase Soy Agar (TSA) miring dan diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator. Setelah itu dilakukan kultur bakteri NP5 dalam 10 ml media Trypticase Soy Broth (TSB) steril dan diinkubasi selama 24 jam di dalam water bath shaker dengan kecepatan 140 rpm. Selanjutnya dilakukan pemanenan bakteri probiotik dengan memindahkan suspensi bakteri ke dalam tabung Corning dan disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm yang bertujuan untuk memisahkan bakteri probiotik dengan media kulturnya. Kemudian dilakukan pencucian dengan menambahkan Phosphate Buffer Saline (PBS) steril sebanyak 10 ml, lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Setelah itu dilakukan tahap pencucian kedua dengan menambahkan 4 ml PBS steril lalu dihomogenkan dengan vortex dan suspensi bakteri probiotik siap dicampurkan ke dalam pakan. 2.2 Ekstraksi Oligosakarida/Prebiotik Prebiotik yang digunakan berasal dari ubi jalar varietas sukuh (Ipomea batatas L.). Proses ekstraksi oligosakarida dilakukan dengan menggunakan etanol 70% sebagai pelarutnya, mengacu pada metode Muchtadi (1989). Sebanyak 10 gram tepung kukus ubi jalar dilarutkan ke dalam etanol 70% sebanyak 100 ml dan diaduk dengan menggunakan magnetic stirer selama 15 jam pada suhu ruang. Setelah itu larutan diendapkan lalu disaring dengan menggunakan kertas saring steril. Cairan hasil penyaringan disentrifuse selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm untuk mengendapkan sisa residu yang tertinggal. Selanjutnya dilakukan penyaringan kembali dengan menggunakan kertas saring steril dan filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan evaporator vacuum pada suhu 40 o C. 3
Hasil pemekatan diencerkan dengan akuades steril dengan jumlah yang ditentukan melalui perhitungan total padatan terlarut (TPT). 2.3 Perhitungan Total Padatan Terlarut Total padatan terlarut (TPT) diukur berdasarkan metode Apriyantono et al. (1989) yang bertujuan untuk melihat kepekatan padatan terlarut prebiotik yang berguna pada analisa oligosakarida. Cawan porselin dikeringkan dalam oven selama 1 jam dengan suhu 100 C, kemudian didinginkan selama 30 menit agar berat cawan stabil dan cawan ditimbang (a gram). Sebanyak 1 ml ekstrak oligosakarida ditempatkan dalam cawan porselin tersebut dan cawan ditimbang (b gram). Kemudian cawan yang berisi ekstrak oligosakarida dimasukkan ke dalam oven bersuhu 100 C selama 24 jam, lalu cawan tersebut didinginkan dalam desikator selama 30 menit agar berat cawan stabil dan cawan ditimbang (c gram). Total padatan terlarut dihitung berdasarkan hasil perbandingan berat ekstrak setelah dikeringkan dengan berat ekstrak sebelum dikeringkan. Keterangan: a b c TPT = x 100% = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida dan dioven 24 jam 2.4 Pengujian Sinbiotik secara In Vivo 2.4.1 Persiapan Wadah dan Ikan Uji Wadah yang digunakan pada penelitian ini adalah akuarium berukuran 30 cm x 25 cm x 25 cm sebanyak 12 buah. Sebelum digunakan, akuarium dicuci dan dikeringkan, lalu didesinfeksi selama 24 jam dengan kaporit 100 ppm dan dibilas hingga bersih. Kemudian setiap akuarium diisi air sebanyak 10 liter dan dikaporit 30 ppm selama 24 jam, lalu dinetralisir dengan tiosulfat 15 ppm dan diberi aerasi kuat. Bagian atas akuarium ditutup dengan kasa agar ikan tidak keluar dari wadah dan bagian luar dinding akuarium ditutup dengan plastik hitam agar ikan tidak mengalami stres. 4
Benih ikan patin yang digunakan berasal dari Cibanteng, memiliki bobot rata-rata 0,43±0,06 gram dan panjang rata-rata 3.55±0.17 cm, dipelihara dengan kepadatan 3 ekor/liter (Radyo 2009). Sebelum diberi perlakuan, ikan diadaptasikan terlebih dahulu terhadap lingkungan selama 1 minggu, lalu ikan dipuasakan selama 1 hari sebelum diberi pakan perlakuan. 2.6.2 Uji In Vivo Pakan uji yang digunakan pada penelitian ini merupakan pakan komersil udang bermerk dagang Feng-Li, berbentuk remah (crumble), dan memiliki kadar protein sebesar 40% (Lampiran 1). Selanjutnya pakan ditambahkan sinbiotik dengan dosis berbeda sesuai pada masing-masing perlakuan. Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan dengan 3 ulangan, yaitu: K : Pemberian pakan tanpa penambahan sinbiotik A : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik 0,5 dosis (probiotik 0,5% + prebiotik 1%) B : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik 1 dosis (probiotik 1% + prebiotik 2% (Wang 2007 dan Mahious et al. 2006)) C : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik 2 dosis (probiotik 2% + prebiotik sebesar 4%) Sebelum dicampurkan ke dalam pakan, disediakan terlebih dahulu suspensi bakteri probiotik (NP5) dengan kepadatan 10 6 CFU/ml (Putra 2010). Pembuatan pakan perlakuan dilakukan dengan cara mencampurkan bakteri probiotik dan prebiotik sesuai dosis masing-masing perlakuan, dan 2% kuning telur ke dalam mortar dan diaduk hingga merata. Selanjutnya campuran tersebut ditambahkan pakan komersil dan diaduk hingga merata, lalu pakan dikeringanginkan selama 15 menit. Pemberian pakan perlakuan dilakukan selama 30 hari dengan frekuensi pemberian sebanyak 3 kali sehari secara restricted dengan FR sebesar 8% dari bobot biomassa. Untuk menjaga kualitas air selama pemeliharaan, dilakukan penyifonan setiap hari sebanyak 10% dari total volume air tiap akuarium dan pergantian air sebanyak 70% setiap 3 hari sekali. Selain itu juga dilakukan pengukuran suhu setiap hari pada pagi dan sore hari, sedangkan pengukuran DO, ph, dan TAN dilakukan pada awal dan akhir pemeliharaan. 5
2.5 Parameter Pengamatan 2.5.1 Tingkat Kelangsungan Hidup (SR) Kelangsungan hidup ikan diamati setiap hari dari awal hingga akhir perlakuan. Tingkat kelangsungan hidup ikan dihitung dengan menggunakan rumus berdasarkan Effendie (1997): Keterangan : SR = Tingkat kelangsungan hidup (%) Nt No = Jumlah ikan pada akhir perlakuan = Jumlah ikan pada awal perlakuan SR = 100% 2.5.2 Laju Pertumbuhan Harian (LPH) 1987): Keterangan : Wt Laju pertumbuhan spesifik dihitung menggunakan rumus berikut (Huisman, LPH (%) = 1 100% = Bobot rata-rata ikan pada akhir perlakuan (gram) Wo = Bobot rata-rata ikan pada awal perlakuan (gram) n = Lama perlakuan 2.5.3 Pertumbuhan Panjang Nilai pertumbuhan panjang didapatkan berdasarkan selisih panjang benih ikan patin pada awal perlakuan dengan panjang benih ikan patin pada akhir perlakuan. Pertumbuhan panjang dihitung melalui rumus berikut (Effendie 1997): Pertumbuhan panjang = Lt Lo Keterangan : Lt = Panjang rata-rata benih akhir perlakuan (cm) Lo = Panjang rata-rata benih awal perlakuan (cm) 6
2.5.4 Konversi Pakan (FCR) Nilai konversi pakan yang digunakan selama perlakuan ini dapat diketahui melalui rumus berikut (Effendie 1997): FCR = Keterangan : FCR = Konversi pakan Pa = Jumlah pakan yang dihabiskan (gram) Bt = Biomassa ikan pada akhir perlakuan (gram) Bo = Biomassa ikan pada awal perlakuan (gram) Bm = Biomassa ikan yang mati (gram) 2.5.5 Hematologi Ikan 2.5.5.1 Total Eritrosit Total eritrosit dihitung berdasarkan Blaxhall dan Daisley (1973) dengan cara: sampel darah dihisap dengan pipet bulir merah sampai skala 1. Kemudian ditambahkan larutan Hayem s dengan cara dihisap sampai skala 101, lalu campuran tersebut dihomogenkan dengan cara pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Setelah itu tetesan pertama dari dalam pipet dibuang, dan tetesan selanjutnya dikeluarkan ke atas hemasitometer yang sudah ditutup dengan kaca penutup, Selanjutnya dilakukan perhitungan sel darah merah pada 5 kotak besar hemasitometer di bawah miroskop. Total sel darah merah didapatkan berdasarkan rumus berikut: eritrosit = sel eritosit terhitung x (pengencer/volume) 2.5.5.2 Total Leukosit Total leukosit dihitung berdasarkan Blaxhall dan Daisley (1973) dengan cara: sampel darah dihisap dengan pipet bulir putih sampai skala 0,5. Kemudian ditambahkan larutan Turk s dengan cara dihisap sampai skala 11, lalu campuran tersebut dihomogenkan dengan cara pipet digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Setelah itu tetesan pertama dari dalam pipet dibuang, dan tetesan selanjutnya dikeluarkan ke atas hemasitometer yang sudah ditutup dengan kaca penutup, Selanjutnya dilakukan perhitungan sel darah putih pada 5 kotak 7
kecil hemasitometer di bawah miroskop. Total sel darah putih didapatkan berdasarkan rumus berikut: leukosit = sel leukosit terhitung x (pengencer/volume) 2.5.5.3 Kadar Hemoglobin (Hb) Kadar hemoglobin diukur melalui metode Sahli dengan menggunakan Sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake 1977). Prosedur pengukuran kadar hemoglobin dilakukan dengan cara: darah dihisap dengan pipet Sahli sampai skala 20 mm 3 atau 0,2 ml. Kemudian darah di dalam pipet dimasukkan ke dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0,1 N sampai skala 10 pada skala yang berwarna merah, lalu diaduk dan didiamkan selama 3-5 menit. Setelah itu ditambahkan akuades sedikit demi sedikit sampai warna campuran darah dan HCl sama dengan warna larutan standar yang ada di dalam Hb-meter. Selanjutnya kadar hemoglobin dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan angka pada skala yang berwarna kuning. Kadar hemoglobin yang terbaca memiliki satuan gram% yang berarti banyaknya hemoglobin dalam satuan gram per 100 ml darah. 2.5.5.4 Kadar Hematokrit (He) Kadar hematokrit diukur berdasarkan Anderson dan Siwicki (1993) dengan cara: sampel darah dimasukkan ke dalam tabung mikrohematokrit sampai ¾ bagian tabung, lalu ujung tabung disumbat dengan crystoseal. Setelah itu tabung disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Kemudian dilakukan pengukuran panjang darah yang mengendap (a) dan panjang total volume darah (b) di dalam tabung mikro hematokrit. Kadar hematokrit dinyatakan sebagai % volume padatan sel darah yang dihitung dengan rumus berikut: He = (a/b) x 100% 2.5.5.5 Diferensial Leukosit Perhitungan diferensial leukosit ditentukan berdasarkan Amlacher (1970). Perhitungan dilakukan dengan cara mengamati preparat ulas darah. Pembuatan preparat ulas darah ini dilakukan dengan cara: darah diteteskan di atas gelas objek yang telah dibilas alkohol, lalu ujung gelas objek kedua diletakkan di atas gelas 8
objek yang telah ditetesi darah dengan membentuk sudut sebesar 30. Kemudian gelas objek kedua tersebut ditarik sampai bagian ujung terpanjang gelas objek pertama dengan menyentuh darah tetapi tidak menyentuh permukaan gelas objek pertama. Preparat dikeringanginkan dan difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Selanjutnya preparat dikeringanginkan kembali dan dilakukan pewarnaan dengan Giemsa selama 15 menit. Setelah itu preparat dibilas dengan air mengalir dan dikeringanginkan, lalu preparat ulas diamati di bawah mikroskop, kemudian dihitung jenis-jenis leukosit dan dihitung pula persentase dari masing-masing jenis leukosit tersebut. 2.5.5.6 Aktivitas Fagositosis Perhitungan aktivitas fagositosis mengacu pada Anderson dan Siwicki (1993) dilakukan dengan cara: sebanyak 50 µl sampel darah dimasukkan ke dalam eppendorf dan ditambahkan 50 µl suspensi bakteri Staphylococcus aureus dalam PBS yang memiliki kepadatan 10 7 CFU/ml. Campuran tersebut dihomogenkan dan diinkubasi selama 20 menit. Kemudian sebanyak 5 µl campuran tersebut dibuat preparat ulas dan dikeringanginkan, selanjutnya difiksasi dengan metanol dan dikeringanginkan. Selanjutnya preparat diwarnai dengan pewarna Giemsa selama 15 menit, lalu dibilas dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Pengamatan aktivitas fagositosis dilakukan di bawah mikroskop dan dihitung persentase dari total 100 sel darah putih yang menunjukkan aktivitas fagositosis. 2.5.6 Kualitas Air Pengukuran kualitas air yang berupa DO, ph, dan TAN dilakukan pada saat awal dan akhir perlakuan. Sedangkan parameter suhu dilakukan setiap hari pada pagi dan sore hari. Tabel 1 di bawah ini adalah satuan dan alat ukur dari parameter kualitas air yang diamati. Tabel 1. Satuan dan alat ukur dari parameter kualitas air Parameter Satuan Alat ukur Suhu o C Termometer Oksigen terlarut ppm DO meter ph - ph meter TAN ppm Spektrometer 9
2.6 Analisis Data Analisis data yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Data dianalasis dengan menggunakan program SPSS 16.0 dan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan. Parameter yang dianalisis statistik secara kuantitatif terdiri dari kelangsungan hidup, laju pertumbuhan harian, pertumbuhan panjang, serta konversi pakan. Sedangkan data hematologi dan kualitas air dilakukan analisis secara deskriptif. 10