16 TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman Hsuang Keng (1978) dalam Wijaya (1999) menyatakan bahwa sistematika tanaman andaliman adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae, Divisio: Spermatophyta, Subdivisio : Angiospermae, Klass : Dicotyledonae,Sub klass : Rosidae, Ordo : Rutales, Family : Rutaceae, Genus : Zanthoxylum, Spesies : Zanthoxylum acanthopodium DC. Sistem perakaran (radix) tanaman antarasa adalah sistem akar tunggang, karena akar lembaga tumbuh terus menjadi akar pokok yang bercang-cabang menjadi akar-akar yang lebih kecil lagi. Akar pokok yang berasal dari akar lembaga disebut Radix primana (Mulia, 2000). Andaliman (zanthoxylum acanthopodium DC) tumbuh sebagai pohon berbatang kuas, bukan merambat. Batang-batangnya berdahan banyak, daundaunya kecil, mirip seperti bunga mawar. Di sekujur batang, ranting, dari bawah ke bawah ujung dipenuhi duri-duri yang tajam, seperti duri mawar. Namun duri andaliman lebih besar dan kokoh. tinggi pohon rata-rata 2-4 meter, jarak lebih dari 5 meter. Usia produktif kurang dari 7 tahun. Buah andaliman muncul dari antara duri-duri itu lazimnya diapit dari duri-duri, buah tumbuh dari duri (Simanjuntak, 2006). Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) merupakan tanaman yang termasuk pada famili Rutaceae dengan ciri-ciri famili yang dipunyainya antara lain adalah mempunyai daun majemuk, bunga majemuk terbatas dalam anak payung serta mempunyai perhiasan bunga satu lingkaran, yaitu kelopak bunga tersusun oleh lima daun kelopak bebas, Genus Zanthoxylum dikenal sebagai
17 tanaman yang mempunyai tingkat keanekaragaman yang cukup tinggi, terbukti dengan jumlah spesiesnya yang mencapai 250 spesies sebagian besar terbesar di benua Amerika, sedangkan di Asia banyak ditemukan di daratan China dan india. daun andaliman tersebar, bertangkai dan merupakan daun majemuk menyirip beranak daun gasal, dengan panjang berkisar 5-20 cm dan lebar 3-15 cm, terdapat kelenjar minyak (Sabri, et al, 2008). Gambar 1.Bagian Tanaman Andaliman (A) Pohon Andaliman, (B) Daun Andaliman, (C) Buah Andaliaman Bunga andaliman adalah bunga majemuk terbatas yang terletak dibagian ketiak daun, ukuran bunga kecil dengan dasar bunga rata atau berbentuk kerucut. Kelopak bunga 5-7, panjang 1-2 cm, berwarna kuning pucat dan berkelamin dua. buah berbentuk kotak sejati atau kapsul, diameter 2-5 mm, pada saat muda berwarna hijau sedangkan pada saat tua berwarna hitam mengkilap, mempunyai kulit yang keras dan setiap buahnya mempunyai biji saru (Siregar, 2003). Buah andaliman kecil-kecil, butirannya lebih kecil dari merica, buahnya bertangkai, memetiknya lebih mudah kalau masih muda, buah berwarna hijau, dan
18 jika kering akan berwarna hitam. Buah andaliman yang baru dipetik sebaiknya dibungkus dengan daun pisang sebab kalau dibiarkan terbuka, akan cepat rusak dan buahnya langsung berubah hitam, dan pecah-pecah, dan bijinya akan keluar dari kulit. Oleh karena itu, untuk mendapatkan satu kilogram andaliman sangat sulit. Memanen andaliman buah perdana biasanya lebih mudah karena tangkainya lebih panjang-panjang sehingga lebih mudah memetik tetapi karena durinya masih runcing pemetikan buah sebaiknya dilakukan lebih hati-hati (Winarno, et al, 2008 ). Kulit luar biji (semen) antarasa yang tipis merupakan pelindung utama pada bagian biji yang ada di dalam. Warna lapisan kulit luarnya coklat kehitamhitaman, sedangkan lapisan kulit dalamnya biasanya tipis.(mulia, 2000) Syarat Tumbuh Andaliman banyak tumbuh di tanah kering di dataran tinggi dan rendah. Tumbuhan yang hidup subur di atas 1.200 m dpl itu mempunyai sifat antibakteri Salmonella typhy, Shigella disentriae, dan Escherichia coli. Andaliman adalah sumbernya senyawa polifenolat, monoterpen dan seskuiterpen, serta kuinon. Selain itu dalam andaliman juga terdapat kandungan minyak atsiri seperti geraniol, linalool, cineol, dan citronellal yang menimbulkan kombinasi bau mint dan lemon (Simangunsong, 2008). Di Indonesia, tumbuhan ini tumbuh liar di pegunungan dengan ketinggian 1400 m dpl pada temperatur 15-180 C. Asal tumbuhan ini dari daerah Himalaya Subtropis. Di dunia, tumbuhan ini tersebar antara lain di India Utara, Nepal, Pakistan Timur, Myanmar, Thailand, dan Cina. Di Cina, tumbuhan ini tumbuh pada ketinggian 2900 m dpl (Wijaya, 1999).
19 Keragaman Genetik Keragaman genetik dalam suatu populasi tanaman sangat penting, agar seleksi dengan maksud untuk mendapatkan karakter-karakter unggul dapat dilakukan. Makin tinggi keragaman genetik maka peluang untuk mendapatkan genotipe unggul semakin besar (Greech and Reich, 1971), dan menunjukkan besarnya pengaruh genetik terhadap sifat yang diekspresikan (Knight, 1979). Jika keragaman genetik suatu tanaman sangat sempit sehingga seleksi sulit dilakukan maka, salah satu cara untuk meningkatkan keragaman genetik adalah melalui mutasi. Mutasi adalah terjadinya perubahan materi genetik pada tingkat genom, kromosom, DNA atau gen sehingga mengakibatkan terjadinya keragaman genetik (Soeranto, 2003). Dalam bidang pemuliaan tanaman, teknik mutasi dapat meningkatkan keragaman genetik sehingga memungkinkan pemulia melakukan seleksi genotipe tanaman sesuai dengan tujuan pemuliaan yang dikehendaki. (Pandin, 2010). Keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor penting untuk merakit varietas unggul baru. Peningkatan keragaman genetik dapat dilakukan dengan memanfaatkan plasma nutfah yang tersedia di alam dan dapat pula dengan melakukan persilangan. Sifat-sifat tertentu sering tidak ditemukan pada sumber gen yang ada sehingga teknologi lainnya perlu diterapkan (Hutami et al, 2005). Informasi keragaman genetik sangat diperlukan untuk mendukung kegiatan konservasi dalam pemuliaan tanaman. Untuk kegiatan konservasi, besarnya keragaman genetik mencerminkan sumber genetik yang diperlukan untuk adaptasi ekologi dalam jangka waktu pendek dan evolusi dalam jangka panjang, sedangkan untuk pemuliaan, keragaman genetik yag luas diperlukan
20 dalam kegiatan seleksi. Program pemuliaan jangka panjang yang memanfaatkan plasma nutfah untuk memperbaiki sifat-sifat agronomi dari aksesi/jenis terpilih harus didasarkan pada perkiraan determinasi genetik yang lebih akurat, sehingga penentuan individu tanaman sebagai bahan dalam perbaikan genetik dapat dilakukan dengan tepat (Rahayu dan Handayani, 2010). Keragaman yang tinggi didalam populasi memberikan dasar yang luas untuk program pengembangan. Dasar untuk seleksi dalam proses ini sama seperti konservasi ex-situ tetapi lebih difokuskan pada tingkat tertinggi dari heterozigositas. Untuk menghasilkan program seleksi yang efektif, seleksi dengan individu yang jumlahnya lebih banyak dilakukan di dalam populasi sehingga variasi genetik yang tinggi dapat dijaga (Lim et al., 2002). Dalam pemuliaan tanaman, keragaman genetik dalam populasi tanaman mempunyai arti yang sangat penting (Mangoendidjojo, 2003) untuk pengembangan sumber genetik yang diperlukan dalam pemuliaan tanaman (Karsinah et al., 2002). Tingkat keragaman individu dalam populasi menggambarkan status keberadaan spesies tersebut di alam. Populasi dengan keragaman genetik yang tinggi mempunyai peluang hidup yang lebih baik karena mempunyai kemampuan yang lebih baik untuk beradaptasi dengan lingkungannya. Keragaman genetik memainkan peran yang sangat penting dalam adaptabilitas suatu spesies karena ketika lingkungan suatu spesies berubah, variasi gen yang kecil diperlukan agar spesies dapat bertahan hidup dan beradaptasi (Salisbury dan Ross, 1995). Spesies yang memiliki derajat keragaman genetic
21 yang tinggi pada populasinya akan memiliki lebih banyak variasi alel yang dapat diseleksi (Elfrod dan Stansfield, 2007). PCR (Polymerase Chain Reaction) Reaksi Berantai Polimerase (Polymerase Chain Reaction / PCR) adalah metode amplifikasi suatu sekuen DNA tertentu. PCR merupakan cara yang sensitif, selektif, dan sangat cepat untuk memperbanyak sekuen DNA yang diinginkan (Murray et al., 2009). Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5 fosfat dan oligonukleotida yang identik dengan sekuen pada ujung 3 OH rantai DNA cetakan yang lain, (3) Deoksiribonukleotida trifosfat (dntp), yang terdiri atas datp, dctp, dgtp, dttp, dan (4) Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang berfungsi sebagai katalis dalam reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lainnya yang juga berperan penting adalah senyawa buffer (Yuwono, 2006). Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin panjang primer, makin spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut. Beberapa faktor seperti konsentrasi DNA, ukuran panjang primer, komposisi basa primer, konsentrasi ion Mg, dan suhu
22 hibridisasi primer harus dikontrol dengan hati-hati agar dapat diperoleh pita-pita DNA yang utuh dan baik (Suryanto, 2003).. Keunggulan PCR yaitu (1) Polimerase DNA dapat diarahkan untuk sintesis wilayah DNA tertentu. Teknik PCR sebenarnya mengeksploitasi berbagai sifat alami replikasi DNA. Dalam proses tersebut, polimerase DNA menggunakan DNA berserat tunggal sebagai cetakan untuk mensintesis serat baru yang komplementer. Cetakan berserat tunggal dapat diperoleh dengan mudah dilaboratorium melalui pemanasan DNA berserat ganda pendek untuk memulai (prime) proses sintesis. Posisi awal dan akhir sintesis DNA pada PCR dapat ditentukan dengan menyediakan suatu oligonukleotida sebagai primer yang menempel secara komplementer pada cetakan sesuai dengan keinginan peneliti dan (2) PCR menghasilkan amplifikasi wilayah DNA tertentu. Serat DNA dapat berfungsi sebagai cetakan untuk mensintesis bila primer oligonukleotida disediakan untuk masing masing serat. Sepasang primer dapat dipilih yang membatasi flanking wilayah dari DNA yang ingin diperbanyak sehingga serat DNA yang baru disintesis dimulai dari posisi primer, membentang sampai melewati posisi primer dari serat lainnya (Mahardika, 2003). Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) pertama kali diperkenalkan oleh Williams et al(1990). RAPD banyak digunakan untuk menganalisis keanekaragaman karakter genetic dalam berbagai penelitian dengan pertimbanganantara lain tidak membutuhkan latar belakang pengetahuan tentang genom yang akan dianalisis, primer yang digunakan bersifat universal (dapat digunakan untuk prokariot maupun eukariot), mampu menghasilkan karakter yang
23 relatif tidak terbatas jumlahnya,bahan-bahan yang digunakan relatif lebih murah, preparasi lebih mudah,dan memberikan hasil lebih cepat dibandingkan dengan analisis molekular lainnya (Weising et al., 1995). Metode RAPD mampu mendetekasi sekuen nukleotida dengan hanya menggunakan satu primer. Primer tersebut akan berikatan dengan utas tunggal genom yang satu dan pada utas DNA pasangannya dengan arah berlawanan. Selama situs penempelan primer masih berada pada jarak yang dapat diamplifikasi pada umumnya tidak lebih dari 5000 pasangan basa (pb), maka akan diperoleh produk DNA amplifikasi (Weising et al., 1995). Polimorfisme RAPD merupakan hasil dari perbedaan panjang DNA hasil amplifikasi (Powell et al., 1996) Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) merupakan salah satu dari beberapa teknik pembuatan penanda berbasis DNA dengan melibatkan penggunaan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction). Teknik PCR-RAPD dapat digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan genotip normal dan abnormal, berdasarkan perbedaan pada pita DNA yang dapat teramplifikasi dengan random primer. Pita DNA yang berbeda akan dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui perbedaan urutan basa DNA antara genotip normal dan abnormal (Azizah,2009). Teknik RAPD hanya digunakan pada satu primer arbitrasi yang dapat menempel pada kedua utas DNA setelah didenaturasi pada situs tertentu yang homolog dengan spesifitas penempelan yang tinggi. Potongan DNA yang teramplifikasi berdasarkan pilihan penempelan yang bersifat acak dan tidak harus berkaitan dengan gen tertentu. Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana dan mudah dalam hal preparasi. Teknik RAPD memberikan hasil yang lebih cepat dibandingkan dengan teknik molekuler lainnya (Bardakci, 2001).
24 Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana dan mudah dalam hal preparasi. Teknik RAPD memberikan hasil yang lebih cepat dibandingkan dengan teknik molekuler lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan jumlah karakter yang relatif tidak terbatas, sehingga sangat membantu untuk keperluan analisis keanekaragaman organisme yang tidak diketahui latar belakang genomnya. Pada tanaman tahunan RAPD dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi seleksi awal. Teknik RAPD sering digunakan untuk membedakan organisme tingkat tinggi (eucaryote). Namun demikian beberapa peneliti menggunakan teknik ini untuk membedakan organisme tingkat rendah (procaryote) atau melihat perbedaan organisme tingkat rendah melalui piranti organel sel seperti mitokondria (Suryanto, 2003). Dalam program pemuliaan tanaman, diperlukan identifikasi baik karakter morfologi maupun molekuler untuk menguji keragaman genotip klon-klon yang akan dipilih untuk tetua persilangan. Pemakaian teknik RAPD memiliki resolusi yang sebanding dengan RFLP dalam hal analisis kekerabatan antar genotif dan mampu menghasilkan jumlah karakter yang tidak terbatas sehingga sangat membantu dalam analisis keragaman genetik tanaman yang tidak diketahui latar belakang genomnya. Analisis RAPD hanya memerlukan sejumlah kecil DNA sehingga sangat sesuai untuk species tanaman berkayu. RAPD memerlukan biaya lebih rendah dibandingkan biaya untuk uji kekerabatan berdasarkan analisis DNA yang lain. Metode RAPD menggunakan primer dengan ukuran sepuluh basa sering digunakan untuk studi kekerabatan, identifikasi varietas, pemetaan genetik, analisis struktur DNA organisme dan finger printing suatu individu organisme. Teknik RAPD menggunakan primer acak maupun spesifik telah terbukti dapat
25 digunakan sebagai penanda molekuler untuk berbagai karakter agronomis penting. Pemakaian marka molekuler RAPD banyak digunakan untuk menyusun kekerabatan beberapa individu dalam spesies maupun kekerabatan antar spesies. Penggunaan kekerabatan ini dapat dijadikan rujukan dalam pemuliaan persilangan untuk mendapatkan keragaman yang tinggi dari hasil suatu persilangan penanda RAPD yang efektif dalam mengevaluasi silsilah bahan, sementara SSR sangat penting untuk mengenali perbedaan antara karakteristik kuantitatif (Maftuchah, 2001). Dalam menganalisis keragaman, ada beberapa hal penting yaitu pemilihan primer yang dapat menampilkan polimorfisme pita-pita DNA diantara individu yang diuji dan kualitas pita DNA yang tajam untuk memudahkan interpretasi dan keakuratan data. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi kualitas pita DNA produk amplifikasi PCR dalam analisis RAPD adalah konsentrasi MgCL2, konsentrasi DNA, konsentrasi enzim polimerase, primer, dan suhu siklus PCR terutama suhu annealing (Prana dan Hartati,2003).