PRINSIP DASAR TEORI MENGHITUNG MIKROORGANISME PADA CAWAN (BAGIAN 1) Tujuan dari tulisan ini adalah untuk membumikan prinsip teori menghitung mikroorganisme yang didalamnya meliputi cara sampling dan memilih metode tes yang tepat sehingga didapatkan data yang akurat dan meyakinkan. Artikel ini dipostingkan karena penulis jarang menjumpai uraian tentang cara menghitung bakteri dalam cawan yang berbahasa Indonesia. Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel, diantaranya adalah plate count (spread plate, pour plate, spiral plate), membrane filtration, MPN, menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dll.). Namun dalam ulasan ini lebih ditekankan pada metode yang memerlukan penghitungan koloni pada cawan petri, seperti membrane filtration, spread plate, pour plate dll. Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFU s/volume atau berat. CFU s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit s yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, sarcina dll. sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel. Hal-hal penting yang harus dipikirkan matang sebelum menganalisa sampel untuk diketahui jumlah mikroorganismenya adalah: 1. Memperkirakan jumlah mikroorganisme yang ada dalam sampel per satuan volume. 2. Memilih metode yang cocok sehingga dihasilkan data yang akurat. 3. Mengetahui jenis/golongan mikroorganisme yang akan dihitung, misalnya bermaksud akan menghitung yeast, bakteri, atau bakteri genus tertentu saja.
4. Menentukan media pertumbuhan yang cocok. 5. Benar-benar mengetahui perbedaan morfologi koloni antara bakteri, yeast dan molds. 6. Mencari tahu standar/ batas ambang/ jumlah maksimum aman jika sample yang dianalisa memerlukan referensi tersebut. 7. Memperkirakan jumlah sampel (volum/berat) yang perlu ditampung pada saat pengambilan sampel yang disesuaikan dengan sample size dari metode teretentu. Seorang mikrobiologiwan sebaiknya mampu memprediksi jumlah sel mikroba dalam suatu sampel tertentu atau yang disebut dengan cell density sebelum menganalisanya. Densitas sel sangat tergantung dari jenis sample. Kemampuan mengira-ira ini dapat diperoleh dari pengalaman, membaca atau bahkan bagi yang expert didapat dari perasaan. Fungsi utama memperkirakan densitas sel ini adalah untuk menentukan perlu atau tidaknya dilakukan pengenceran atau untuk menentukan jumlah sampel yang akan dianalisa. Keputusan ini adalah sangat penting. Sebagai pijakan awal, harus diketahui bahwa hasil yang paling baik adalah antara 30-300 koloni per cawan, ada juga yang menyebutkan 25-250 koloni per cawan. Mengapa dipilih range jumlah koloni seperti itu?... Hal ini ditujukan untuk meminimalisir kemungkinankemungkinan kesalahan dalam proses analisa, terutama statistical error. Untuk lebih jelasnya: Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka: - Kesalahan statistik tinggi. - Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk, besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan). - Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti. solusi : memperbesar ukuran sampel. Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka : - Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan. - Perebutan nutrisi/ kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi. - Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni. - Memperbesar kemungkinan kesalahan (human error) dalam menghitung koloni. Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan. Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang mempengaruhi hasil akhir ini, seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode apakah yang cocok untuk sampel tersebut. Disarankan sebelum menghitung atau menganalisa yang sebenarnya, dilakukan perkiraan (analisa pendahuluan) terlebih dahulu dengan mencoba memplatingnya pada ukuran sampel atau pengenceran yang berbeda-beda. Misalnya: 1. Sampel X tidak dapat diperkirakan jumlah densitas selnya, tetapi sepertinya jumlah ml/cawan adalah lebih dari 300. Perlu dilakukan pemplatingan awal dahulu supaya
diperoleh tingkat pengenceran yang cocok sehingga menghasilkan 30-300 koloni per cawan. Contohnya, didapatkan 10-4 yang menghasilkan koloni dengan kisaran tersebut, maka selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat mengulanginya dengan tingkat pengenceran yang sama (tanpa sampai pengenceran yang lebih tinggi). 2. Sample X diperkirakan memiliki jumlah mikroba yang sangat sedikit +/-30 koloni/100ml. Perlu dilakukan penentuan sample size yang tepat terlebih dahulu supaya dihasilkan 30-300 koloni per cawan atau paling tidak mendekati. Misal, jika dengan ukuran sampel: 100 ml dihasilkan 10 koloni, 200 ml dihasilkan 22 koloni, 500 ml dihasilkan 49 koloni, maka sample size yang paling sesuai adalah 500 ml atau lebih. Penentuan sample size ini juga dipengaruhi sifat sampel itu sendiri dan keterbatasan metode yang dipakai. Selanjutnya dengan sampel yang sama kita dapat menganalisa dengan sample size 500 ml atau lebih. Yang dimaksud mendekati disini adalah jika misalnya ditemukan data analisa pendahuluan seperti berikut: 50 ml dihasilkan 0 koloni/cawan, 100 ml dihasilkan 1 koloni/cawan, 200 ml dihasilkan 5 koloni/cawan, 400 ml dihasilkan 11 koloni/cawan, 500 ml dihasilkan 16 koloni/cawan,
Sedangkan dengan keterbatasan metode (misalnya metode filtrasi membran tidak sanggup untuk menyedot sampel seperti air teh hasil pasteurisasi sampai lebih dari 500 ml karena akan menghambat pori pada membran tersebut sehingga membran macet) maka digunakan ukuran sampel yang paling mendekati batas bawah kisaran yaitu 30 koloni per cawan. Pemilihan metode dengan benar. Berbagai metode umum untuk uji enumerasi bakteri yang ditanamkan dalam cawan petri antara lain: - Plate count dengan teknik penanaman spread plate dan pour plate - Membrane filtration Pemilihan metode yang benar tergantung kepada : - Jenis sampel - Densitas sel (perkiraan dari analisa pendahuluan) - Spesifikasi standar baku / standar lolos uji Telah diuraikan didepan bahwa sebagai patokan sebaiknya didapatkan 30-300 koloni per cawan dengan alasan utama adalah kesalahan statistik. Kita tidak perlu mengetahui secara dalam mengenai mengapa harus dalam kisaran itu, atau mengapa tidak 100-500 koloni per cawan, dan alasan-alasan berbau statistik lainnya. Namun sebagai microbiologist yang baik, seharusnya mampu memilih metode yang tepat berdasarkan acuan kisaran itu, karena kisaran 30-300 koloni ini digunakan secara internasional. Berikut adalah penjelasan singkat metode-metode beserta ukuran sampel yang disarankan: Spread plate: teknik penanaman ini didasarkan pada penyebaran sel pada permukaan agar. Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan dengan diameter +/- 9 cm. Jika digunakan volume: <0,1 ml: kemungkinan kesalahannya adalah sel tidak tersebar merata (tidak tersapu oleh batang L) karena volume pelarut kurang walaupun dengan pengenceran yang tepat. Semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) sangat besar pengaruhnya pada hasil yang diperoleh. 0,1 ml
0,1 ml : volume yang tepat untuk disebarkan diatas permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga tidak menggenangi permukaan agar. Secara peluang, sel bakteri dapat terambil dengan acak dan seragam dari tabung. >0,1 ml : volume yang lebih besar otomatis air di permukaan agar lebih banyak sehingga sulit mengering dan dapat menyebabkan pertumbuhannya memenuhi seluruh permukaan agar karena sel dapat disebarkan oleh air (inilah kekurangan dari metode spread plate). Penggunaan teknik penanaman ini sebaiknya dari jenis sampel yang memiliki densitas sel yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu yang sesuai. Lebih baik tidak menganalisa jenis sampel seperti air mineral dalam kemasan dengan teknik ini karena dikhawatirkan jika terdapat pertumbuhan maka pertumbuhan tersebut kemungkinan besar adalah kontaminan. Hal ini disebabkan oleh sedikitnya jumlah sel per satuan volum dalam air mineral tersebut, dan jika dari sekian ratus ml sampel hanya diambil 0,1 ml-nya maka secara nalar peluang untuk terambil sangat kecil. Permasalahan ini dapat dijelaskan dalam kasus berikut: Hasil perhitungan koloni dari ilustrasi di atas adalah sangat tidak representatif dan jika tetap diambil 0,1 ml dan diplating maka kemungkinan besar adalah tidak ada pertumbuhan. Misalnya saja didapati ada pertumbuhan hanya satu koloni, maka dapat timbul pertanyaan apakah koloni ini berasal dari sampel atau kontaminan. Pour Plate : teknik pour plate adalah teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar) sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan agar atau di dalam agar. Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang
dipakai untuk teknik ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300 koloni/cawan. Jika digunakan volume: <1ml : Sel kemungkinan tidak tersebar merata karena sel terlarut pada volume yang terlalu kecil sehingga saat bercampur dengan agar akan sulit tersebar. Seperti teknik spread plate semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) dapat berpengaruh terhadap hasil yang diperoleh. 1-2 ml : volume sampel yang cocok tentunya dengan densitas sel >30sel/ml. > 2 ml : semakin besar ukuran sampel maka kekuatan agar semakin berkurang dan lama memadat sehingga dapat mempertinggi resiko kesalahan teknis seperti agar jatuh ke tutup cawan. Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama. Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang menjadi keterbatasan metode pour plate. Teknik penanaman ini lebih tepat untuk jenis sampel yang tidak dapat untuk difiltrasi dan sulit sulit untuk diratakan di permukaan agar seperti jus buah. Lalu jika timbul pertanyaan bagaimana cara yang tepat untuk menganalisa jenis sampel jus jeruk atau jus apel hasil pasteurisasi yang diperkirakan memiliki densitas sel <10 sel/200ml? Permasalahannya adalah jenis sampel seperti ini tidak dapat difiltrasi dan hanya dapat dilakukan dengan teknik pour plate. Hal ini akan dibahas pada bagian selanjutnya. Membrane filtration : Prinsip teknik ini adalah dengan melewatkan sejumlah volume sampel pada saringan dengan diameter pori lebih kecil dari pada sel mikroba. Hal inilah yang menjadi keterbatasan teknik filtrasi membran, dan dapat berpengaruh kepada jenis sampel dan ukuran sampel yang akan dianalisa. Metode filtrasi membran sebaiknya digunakan hanya pada sampel yang memiliki perkiraan jumlah sel yang kecil dan metode ini merupakan metode yang paling baik untuk menganalisa cairan dengan volume yang besar, tetapi dibatasi jumlah koloninya pada kisaran 100 CFU/membran.
Beberapa pengaruh tersebut adalah: - Viskositas / kekentalan sampel : semakin kental cairan maka semakin sulit difiltrasi sehingga volume yang dibutuhkan tidak terlalu besar. Misalnya sirup, kecap, madu dll. - Bahan-bahan yang terlarut dalam sampel : suatu bahan-bahan mikroskopis yang dapat menghambat pori-pori sehingga semakin sedikit jumlah pori yang dapat melewatkan larutan tersebut. Misalnya air teh, kopi dll. Ciri-ciri dari jenis sampel yang seperti ini adalah terdapat bekas pada membran filter setelah dilakukan penyaringan. Ukuran sampel yang dipakai dalam teknik membran filtrasi tergantung kepada jenis sampel, standar lolos uji / jumlah maksimum aman, ukuran pori-pori membran filter dan acuan 30-300 koloni. -Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat tinggi: maka dapat diambil sampel dengan ukuran sampel yang kecil (misalnya 1 ml). Setelah difiltrasi maka ditambahkan air steril secukupnya (20 ml) supaya sel tersebar merata pada membran filter. Jika tidak ditambahkan air steril maka pertumbuhannya akan mengelompok di pinggir yang disebabkan oleh adanya pengumpulan air sampel pada pangkal filter funnel (corong) dan juga kemungkinan masih ada sel yang menempel pada dinding filter funnel (fungsi membilas). Selain cara tersebut sampel dapat terlebih dulu diencerkan sampai tingkat yang sesuai. -Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang mengandung jumlah bakteri sangat sedikit maka ukuran sampel sebaiknya diperbesar. -Jika akan menghitung bakteri pada sampel yang memiliki kekentalan yang tinggi, maka sampel dapat ditambah dengan air steril. Tujuannya yaitu menurunkan kekentalan sampel tersebut sehingga lebih mudah difiltrasi. Perhitungannya tetap mengacu pada volume sampel yang dianalisa bukan volume total setelah ditambah air steril karena air steril ini bukan bagian dari sampel.. Studi kasus : - Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air sungai / kali tercemar? - Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air mineral / AMDK (Air Minum Dalam Kemasan)? - Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air teh dalam botol hasil pasteurisasi? - Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel jus buah yang mengandung ampas buah hasil pasteurisasi?
1. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air sungai / kali tercemar? Permasalahannya: air sungai memiliki perkiraan densitas sel yang sangat tinggi misalnya dapat mencapai 10 8 sel/ml. Sampel air sungai dapat diencerkan secara bertingkat (1:9) atau yang disebut teknik gradual dilution. Dari tingkat pengenceran yang tepat dapat ditanam dengan metode spread plate, pour plate ataupun dengan teknik membrane filtrasi. Perlu diingat bahwa tetap mengacu pada kisaran 30-300 koloni per cawan sehingga misalnya pada tabung (10ml) pengenceran yang menghasilkan kira-kira 10 3 sel/ml, maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan spread plate yaitu diambil 0,1 ml (didapatkan +/- 100 koloni) lalu pada tingkat pengenceran 10 2 sel/ml, maka penanaman sebaiknya dilakukan dengan pour plate yaitu diambil 1 ml (+/- 100 koloni), sedangkan dari tingkat pengenceran yang diperkirakan menghasilkan 10 sel/ml maka seluruh volume dalam tabung dapat difiltrasi sehingga didapatkan +/- 100 koloni. Tiap pengenceran yang tepat beserta teknik penanamannya tersebut hanyalah opsi yang dapat disesuaikan dengan tujuan dan alat yang tersedia. Jika akan dianalisa dengan filtrasi membran dan transfer cairannya hanya 1 ml atau lebih maka sebaiknya setelah disaring, ditambahkan air steril secukupnya (+/- 20 ml) untuk menyebarkan sel-sel pada kertas membran (dapat dilihat pada gambar).
2. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air mineral? Permasalahannya adalah bahwa sampel ini memiliki jumlah bakteri yang sangat sedikit yang terlarut dalam air dengan volume yang banyak. Lalu bagaimana cara menghitungnya? Air mineral dalam kemasan merk tertentu dibuat sedemikian rupa sehingga sebisa mungkin bebas dari bakteri. Perkiraan jumlah per 500 ml air adalah <10CFU, oleh karena itu untuk menghitung bakteri yang sangat sedikit secara akurat maka ukuran sampel sebaiknya diperbesar. Memperbesar ukuran sampel untuk dianalisa, berarti memperbanyak sel (koloni) untuk dihitung. Perhatikan ilustrasi berikut:
3. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel air teh dalam botol hasil pasteurisasi? Permasalahnnya hamper sama dengan menghitung mikroba pada air minum dalam kemasan yaitu jumlah bakteri yang sedikit, tapi yang menjadi titik kelemahan disini yaitu sifat dari sampel itu sendiri yang tidak dapat disaring dengan teknik filtrasi membran dalam volume yang besar. Hal ini disebabkan adanya zat-zat yang terkandung dalam teh yang dapat menghambat pori membran sehingga jika lebih dari 100ml (pada umumnya) proses filtrasi akan macet. Volume sampel yang disarankan sebaiknya dengan volume yang besar (misalnya 500ml). Namun dalam volume 500 ml itu disaring pada beberapa membran filter sehingga membran tidak terlalu mampat oleh zat-zat di dalam teh. Kemudian penjumlahannya tetap dijumlahkan total dari beberapa membran filter tersebut. Tidak dapat satu-satu. 4. Bagaimana menghitung sel mikroba dalam sampel jus buah yang mengandung ampas buah hasil pasteurisasi? Permasalahan disini yaitu jumlah bakteri yang sangat sedikit dalam volume yang banyak dan juga adanya ampas buah yang dapat menghambat pori membran filter ataupun ujung pipet ukur. Jika dianalisa dengan teknik penanaman spread plate, maka ukuran sampel yang diambil terlalu sedikit (0,1ml) sehingga kesalahan statistiknya sangat tinggi. Jika dianalisa dengan teknik filtrasi membran, maka ampas buah dapat menghambat membran filter. Cara analisa yang tepat adalah dengan teknik pour plate, tetapi kekurangannya adalah ukuran sampel yang kecil (1 ml). Namun hal ini dapat disiasati dengan memperbesar ukuran sampel (misalnya menjadi 5 ml) dan ditambah dengan media pertumbuhan yang konsentrasinya lebih besar (misalnya 2 kali resep) sehingga saat dicampur dengan sampel maka konsentrasi media dapat menjadi 1X. Misal dalam botol 350 ml jus stroberi hasil pasteurisasi merk tertentu diperkirakan terdapat <10CFU /350ml. Untuk benar-benar menghitung bakteri di dalam jus tersebut terpaksa harus dilakukan skrining, yaitu memplatingnya memakai teknik penanaman
pour plate masing-masing 5 ml pada tiap cawan (d: 9 cm) dengan konsentrasi media 2X (penambahan media +/-5 ml). Hal ini jelas membutuhkan cawan minimal 70 buah dan dengan konsumsi media yang lebih boros. Mengapa media yang ditambahkan konsentrasinya lebih besar? Karena dalam teknik yang tidak biasa ini membutuhkan sampel 5 ml, sedangkan perbandingan antara sampel dan media adalah 1:1. Jadi hal ini ditujukan untuk mengimbangi ukuran sampel yang besar sehingga konsentrasi media setelah dicampur menjadi 1X. Jika hal ini dilakukan maka akan membutuhkan teknik aseptis yang sangat teliti.
Kesimpulan dari uraian di atas adalah : INTINYA ADALAH MELIPATGANDAKAN ATAU MENYEDIKITKAN (MENGENCERKAN) SAMPEL DAN MEMILIH CARA ANALISA YANG PALING TEPAT SUPAYA DIPEROLEH PERHITUNGAN YANG MEMENUHI SYARAT SECARA STATISTIK DEMI KEAKURATAN HASIL ANALISA DAN MEMINIMALKAN KESALAHAN-KESALAHAN. Bersambung ke bagian 2