KULTIVASI MIKROORGANISME

KULTIVASI MIKROORGANISME

Organisme Waktu Penggandaan sel Bakteri dan khamir Kapang dan Alga Rumput Ayam Babi Sapi muda Manusia (muda) 20-120 menit 2-6 jam 1-2 minggu 2-4 mingu 4-6 mingu 1-2 bulan 3-6 bulan

Skema Umum Proses Kultivasi Pengembangan Inokulum Biomassa Kultur Stok Labu Kocok Bioreaktor Inokulum Cairan Fermentasi Pemisahan Sel Sterilisasi Media Supernatan Bebas Sel Formulasi Media Ekstraksi Produk Bahan Baku Media Bioreaktor Pemurnian Produk Penanganan Limbah Cair Pengemasan produk

CONTOH KULTIVASI PADA SUATU BIOINDUSTRI

CONTOH BIOREAKTOR

KULTUR CURAH/NIR SINAMBUNG Pelaksanaan kultivasi : Bioreaktor steril diisi dengan media segar steril lalu diinokulasi dengan inokulum KULTIVASI (merupakan sistem tertutup) Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk dilakukan pemanenan produk (proses hilir) Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk digunakan pada kultivasi berikutnya Penyiapan/pembersihan bioreaktor repot

Kultur Curah : 1. Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika kultivasi 2. Resiko kontaminasi rendah 3. Konsentrasi produk akhir lebih tinggi 4. Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi krn waktu kultivasinya pendek 5. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor yang sama (Contoh : pertumbuhan sel pd fase eksponensial & pembentukan produk pd fase stasioner = metabolit sekunder 6. Pada industri farmasi, semua bahan-bahan yang digunakan harus diketahui dengan tepat, sehingga lebih praktis dengan proses curah 7. Dari aspek rekayasa bioproses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil 8. Kelemahan : Terakumulasi produk yang dapat menghambat pertumbuhan

Kurva Pertumbuhan Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian Lag Eksponensial Stasioner Kematian Log Jml Sel/ml Ln X (g/l) Lisis sel, diikuti pertumbuhan kriptik Viable cell count dg lisis sel Waktu

Fase Eksponensial : Keterangan : X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering) µ = laju pertumbuhan spesifik (jam -1 ) t = waktu (jam) Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai Model Pertumbuhan Eksponensial

Plot antara ln[sel] vs waktu akan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase eksponensial (ingat pembelahan biner) (slope untuk menentukan μ)

Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial? Perhatikan sel tunggal di dalam bioreaktor Sel ini membelah diri tiap jam (pembelahan biner). Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb. Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel 2 4 8. dst 1 2 1 2 2 2 3 2 4.. 2 n = N (jumlah sel) Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi

Laju pertumbuhan spesifik(µ) : - Menggambarkan kecepatan reproduksi sel. - Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. - Pada saat sel tidak tumbuh, maka laju spesifik pertumbuhan = 0 Model Pertumb Eksponensial Pada saat fase eksponensial, laju spesifik pertumbuhan relatif tetap

Hasil integrasi : Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial antara konsentrasi biomassa vs waktu

Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik : Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus Slope = μ

Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = t D ) dengan laju spesifik pertumbuhan (μ) t d menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan populasi sel menggambarkan laju pertumbuhan sel Selama fase eksponensial t D relatif konstan Hubungan antara t D dengan laju pertumbuhan spesifik bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X 0 menjadi X 1 selama waktu penggandaan t D (= t 1 -t 0 ) : t d = 0,693 μ

Aplikasi Kultur Curah : Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder Untuk produksi biomassa digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai maksimal Untuk prodiksi metabolit primer kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesis produk Untuk produksi metabolit sekunder kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasioner

KULTUR SINAMBUNG Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan (Sistem Terbuka) Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor volume tetap Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah. Dapat menggunakan Sel mikroba imobil untuk memaksimumkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya. Imobilisasi sel : penempatan mikroba pada ruang/daerah tertentu, sehingga dapat mempertahankan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang (contoh : menumbuhkan/melekatkan mikroba pada carrier)

Kultur Sinambung Kelebihan : 1. Produktivitas lebih tinggi, penyebab : - lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor per satuan produk yang dihasilkan - laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol dengan mengatur laju dilusi - pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru) 2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama 3. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah (contohnya penanganan limbah cair) & produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan 4. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana 5. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat

Kultur Sinambung Dengan mengontrol laju dilusi dimungkinkan untuk mempertahankan laju pertumbuhan spesifik yang optimal untuk pembentukan produk Kelemahan : Aliran umpan yang lama resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik) Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus bisa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunakan pada waktu yang lama Terjadinya degenerasi galur mikroba yang digunakan akibat mutasi spontan menyebabkan penurunan produk yang dihasilkan Sebaiknya ada konsumen/permintaan yang tetap terhadap produk spy efisien

NERACA MASSA PADA KULTUR SINAMBUNG Biomassa : Akumulasi = Sel masuk Sel keluar + Pertumbuhan Sel mati dx dt = F V F X0 X + μx αx V Bila suplai medium steril (X 0 = 0) dan μ >> α, maka dx dt F = μx X V = μx DX = ( μ D)X Dalam keadaan setimbang (staedy state), dx dt = 0 dan μ = D D crit μ max D mendekati D crit tidak stabil D > μ max wash out

Substrat : Akumulasi = nutrisi masuk nutrisi keluar konsumsi untuk tumbuh konsumsi untuk pemeliharaan konsumsi untuk sintesis produk ds dt = F V S f F V S μx Y X S mx qpx Y P S Bila ds dt = mx << ( S) D S f μx Y X S Saat setimbang,, dan tidak ada μx Y ds dt X S = 0, sehingga x pembentukan produk, = Y X S ( S ) f S maka

Kultur Sinambung : Start-Up Kultivasi sinambung diawali dengan kultivasi curah Setelah kultur mencapai fase eksponensial, lalu umpan dimasukkan Bila komposisi media saat start-up sama dengan umpan, perubahan dari curah ke sinambung menyebabkan konsentrasi sel atau produk berosilasi (A) penyebab : kultur mikroba mengalami hambatan oleh substrat) dicegah dengan komposisi media saat start-up 1/2 umpan (B) Penambahan umpan dilakukan kira-kira setelah kons sel ½ kons sel saat steady-state (biomassa, substrat & produk tidak berubah dan laju metabolisme sel kontan) A B Kons Sel Kons Sel Dimulai kultivasi sinambung Waktu Waktu

Kultur Sinambung : Model hubungan laju pertumbuhan sel dgn konsentrasi substrat pada kultivasi sinambung Model MONOD µ = S µ maks K S + S Keterangan : µ = laju pertumbuhan spesifik (jam -1 ) µ maks = laju pertumbuhan spesifik maksimum (jam -1 ) S = konsentrasi substrat pembatas (g/l) K S = kons substrat (g/l) pada saat ½ laju pertumbuhan spesifik maksimum menggambarkan efisiensi mikroba dalam mengkonsumsi substrat

Model yang menghubungkan X, S dan D μ = μ K max s.s + S Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Biomassa Substrat dx dt ds dt = = = = ( μ D) μ K max s.s + S X ( S) D S D X X ( ) max f S YX KS + S D S f μx Y X S S μ.s

Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State) Substrat Bila Biomassa ds dt = 0, maka S = μ DK max S D D D = μ = μ K max S +.S S X = Y = Y X S X S ( S S) S fungsi dari D X fungsi dari f S f μ DK max S D dan S D f

D kritis D kritis D terendah saat mana wash out terjadi D D C C = = μ μ max max dan S = K Sf + S S f S f D C fungsi dari S f. Bila S f >> K S, maka D C = μ max

Aplikasi Kultur Sinambung : Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat pembatas dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambung Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan media diperkaya Untuk produksi biomassa, contoh ICI (Imperial Chemical Industries, kapasitas bioreaktor 3000 m 3, substrat metanol) Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower bioreactor)

KULTUR SEMI SINAMBUNG (FED-BATCH) Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor. Pada kultur fed batch, media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor secara kontinyu. Harus disediakan ruang dalam bioreaktor untuk penambahan media Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali. Dapat mengurangi efek represif sumber karbon akibat penggunaan kons substrat yang tinggi dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor Dapat mencegah efek toksik komponen media

Aplikasi Kultur Semi Sinambung (Fed-Batch) Untuk produksi antibiotika penisilin (metabolit sekunder) - kultivasi 2 tahap : fase pertumbuhan sel cepat dan fase produksi yang diatur dengan mengatur umpan substrat glukosa - Na-fenilasetat (prekursor) toksik thd Penicillium chrysogenum pengumpanan harus diatur Untuk memproduksi enzim yang rentan thd represi katabolit Contohnya : selulase oleh Trichoderma reesei

Perbandingan Berbagai Metode Kultivasi Kultur Curah Semi Sinambung Kultur Sinambung Aliran masuk (F in ) Aliran keluar (F out ) F in =F out = 0 F in > 0, F out = 0 F in =F out > 0 Volume kultur Konstan Meningkat Konstan Pengendalian kons substrat Tdk mungkin (menurun) Mungkin (konstan) Mungkin (konstan) Konsentrasi Sel Rendah Kons. tertentu Kons. tertentu (<5 g/l) (> 100 g/l) Konsentrasi produk Meningkat s.d tk rendah Meningkat s.d tk tinggi Konstan Kemudahan bagi pengguna Bahaya kontaminasi Mudah Agak mudah Sulit Tidak serius Tidak serius Serius

CONTOH PERHITUNGAN KINETIKA

Kinetika Curah (Batch) Produksi Etanol oleh bakteri Zymomonas mobilis Waktu (jam) Biomassa (g/l) Glukosa (g/l) Etanol (g/l) ln biomassa 5 0,05 247 1,5-2,99573 9 0,15 240 5-1,89712 14 0,45 225 12-0,79851 18 1,2 195 22 0,182322 22 2,8 130 47 1,029619 24 3,4 100 63 1,223775 26 3,8 75 74 1,335001 30 4,15 40 90 1,423108 35 4,2 25 100 1,435085

kurva pertumbuhan ln X (g/l) 2 1 0-1 -2-3 -4 5 9 14 18 22 24 26 30 35 Waktu (jam ) Fase eksponensial = 5 22 jam

Penent Laju Pertumb. Spesifik Ln Biomassa (g/l) 2 1 0-1 -2-3 -4 y = 0,2355x - 4,0992 R 2 = 0,9984 0 5 10 15 20 25 Waktu (jam ) Laju Pertumb. Spesifik maks (μ maks ) = 0,24 Jam -1

Waktu (jam) (X-Xo) (So-S) (P-Po) 5 0 0 0 9 0,1 7 3,5 14 0,4 22 10,5 18 1,15 52 20,5 22 2,75 117 45,5 24 3,25 147 61,5 26 3,75 172 72,5 30 4,1 207 88,5 35 4,15 222 98,5

Yp/s (P-Po) g/l 50 40 30 20 10 0 y = 0,3827x + 0,8447 R 2 = 0,9983 0 50 100 150 (So-S) g/l Yp/s = 0,38 g etanol/g substrat

Yx/s (X-Xo) g/l 4 3 2 1 0 y = 0,0273x + 0,4472 R 2 = 0,8583 0 50 100 150 (So-S) g/l Yx/s = 0,03 g etanol/g substrat

Yp/x (P-Po) g/l 60 40 20 0-20 y = 12,047x - 2,4313 R 2 = 0,8615 0 1 2 3 4 (X-Xo) g/l Yp/x = 12,047 g etanol/g biomassa