BIOTEKNOLOGI MIKROBA Teknik dasar kultur mikroba Perbaikan strain mikroba Pembuatan inokulum pupuk hayati Pertemuan ke 5 Mikroba = kel jasad hidup berukuran kecil dng kisaran ukuran sel sekitar 0,1 10 µm (1 µm = 10-6 ) Perbedaan mikroba dng jasad hidup lain<, satu sel mikroba adalah satu individu. Mikroba ada 3 kelompok utama : - Prokaryot - Eukaryot - Archaea Contoh prokaryot: bakteri Eschericia coli Contoh eukaryot: Khamir Saccharomyces cerevisiae TEKNIK DASAR KULTUR MIKROBA Dapat ditumbuhkan dlm medium padat (misal: tempe, tape, oncom, jamur konsumsi) dan medium cair (misal: untuk menghasilkan antibiotik, etanol, asam asam amino, nata de coco). Berdasarkan komposisi medium utk menumbuhkan mikroba : - medium lengkap - medium minimal Medium lengkap : bahan organik atau anorganik yg dapat memenuhi kebutuhan mikroba utk pertumbuhan dan aktivitas metabolismenya shg mikroba dpt tumbuh scr optimum. Contoh bahan organik: ekstrak daging, ekstrak taoge, ekstrak kentang, dll Medium minimal: suatu bahan kimia (umumnya bahan anorganik) dng komposisi terbatas yg digunakan utk pertmbhn mikroba. 1
Contoh Medium lengkap Komposisi media nutrien cair dan nutrien agar untuk bakteri: Nutrien cair: 2 g nutrien broth + aquades 250 ml Nutrien agar: Bahan medium: bahan kimia buatan pabrik atau bahan alami yang diproses untuk memenuhi kebutuhan C, unsur makro dan mikro serta senyawa lain yang dibutuhkan untuk pertumbuhan 2 g nutrien broth + aquades 250 ml + 3 g agar Media cair steril Komposisi media taoge cair dan taoge agar untuk jamur/khamir: Taoge cair: 25 g taoge + 15 g gula pasir + aquades 250 ml Taoge agar: 25 g taoge + 15 g gula pasir + aquades 250 ml + 3 g agar BAHAN MEDIUM BANYAK TERSEDIA, MUDAH DIDAPAT DAN MURAH HARGANYA: -SISA TANAMAN/HEWAN, LIMBAH ORGANIK, KOMPOS. -Bahan medium dianalisis kandungan C, N, P, K, apabila kandungan unsur tersebut kurang maka ditambah BAHAN KIMIA TEKNIS - Kebutuhan C, N, P, K untuk pertumbuhan mikroba dapat diketahui dengan perhitungan atau percobaan pendahuluan TEKNIK KULTIVASI MIKROBA 1. KULTUR BATCH (sekali panen) Mikroba ditumbuhkan dlm medium sampai mencapai fase pertumbuhn maksimal kemudian dipanen produknya (sel/biomassa atau produk metabolitnya) 2. KULTUR KONTINYU Mikroba ditumbuhkan terus menerus pada fase paling optimum (eksponensial) shg pemanenan produk dapat dilakukan berulang ulang tanpa mengulangi kultivasi dari awal. KULTUR BATCH Pola pertumbuhan SIGMOID - fase pertmbhn lag / adaptasi Belum ada penambhan jumlah sel lamanya tergtg : status fisiologis mikroba, macam mikroba, perbedaan kondisi pertumbhn sebelum mikroba ditumbuhkan dlm medium lengkap kemudian ke medium minimal. 2
Grafik pertumbuhan mikroba dalam satuan bilangan logaritma Kurva pertumbuhan mikroba dalam kultur tertutup (batch culture) -Fase pertmbhn dipercepat fase ini berlgs cepat karena mikroba kan masuk ke fase berikutnya. - Fase eksponensial pertambahan jumlah sel berlgs secara logaritmik mikroba mencapai status isiologis yg optimum. - Fase pertmbhn diperlambat nutrien berkurang karena digunakan untuk pertumbuhan - Fase stationer sebagian sel mengalami kematian shg rasio jumlah sel yg hidup dan yg mati seimbang dan jd jml sel total tdk meningkat. Skema dasar bioreaktor sistem batch 3
KULTUR KONTINYU Ada 2 cara : 1. KEMOSTAT : Menambahkan nutrien dlm suatu tangki shg komposisi nutrien di dlm fermentor tempat kultivasi mikroba selalu dlm keadaan tetap. 2. TURBIDOSTAT Menambahkan nutrien secara kontinyu shg kerapatan sel selalu dlm keadaan tetap. Dlm turbidostat aliran medium diatur berdasarkan kerapatan optik kultur mikrobia. Contoh bioreaktor kultur cair yang digunakan untuk kultur kontinyu: Fermentor skala laboratorium Kemostat untuk Bioreaktor sel kontinyu PEMANFAATAN MIKROBA DALAM INDUSTRI BIOTEKNOLOGI 1. Produk pangan yg dikonsumsi secara langsung 2. Produksi bahan baku utk pangan 3. Produksi bahan utk mendukung tahapan sebelum panen (misal biofertilizer, biopestisida, bioaktivator kompos) 4. Produksi bahan bahan utk pengelolaan kesehatan 5. Produksi bahan bahan pendukung utk industri yg lain Dlm industri bioteknologi semacam ini mikroba dapat digunakan sbg : 1. agensia produksi (untuk produksi alkohol, asam sitrat, keju, enzim, insulin, antibiotik, dll) 2. produk hasil akhir yang digunakan secara langsung (tempe, yogurt, biofertilizer, biopestisida) 4
PERBAIKAN STRAIN MIKROBA PENINGKATAN KEMAMPUAN FISIOLOGIS MIKROBA: 1.Teknik Konvensional a. Teknik mutagenesis secara acak - mutagenesis dg mutagen kimia - mutagenesis dg mutagen fisik - mutagenesis secara terarah. b. Fusi protoplas (dipelajari pada pertemuan ke 7) 2.Teknik modern (non-konvensional) Dipelajari setelah DNA rekombinan, pada bioteknologi mikroba penambat nitrogen (setelah mid) PEMBUATAN PUPUK HAYATI Merupakan sel mikroba yang dapat berfungsi sebagai pupuk. Sering disebut sebagai inokulum pupuk hayati Produknya berisi sel-sel mikroba dengan kemampuan khusus, misal: - mikroba penambat nitrogen - mikroba pelarut fosfat, dll Teknik Konvensional Pembuatan Pupuk Hayati Penambat Gas Nitrogen PRINSIP PEMBUATAN INOKULUM Bisakah menanam bakteri penambat N2? Jawabnya tentu bisa Mau mencoba? Caranya bagaimana? Mulai dari isolasi, kultur & perbanyakan Untuk apa? Untuk pupuk hayati pengganti pupuk N kimia I. ISOLASI, PEMILIHAN, DAN PEMELIHARAAN KULTUR II. TEKNIK PERBANYAKAN MIKROBA III. FORMULASI IV. PACKING DAN PENYIMPANAN Produknya disebut apa? Inokulum bakteri penambat nitrogen 5
PEMILIHAN MIKROBA UNGGUL METODE KIMIA: -N15 UNTUK FIKSASI N2 -P TERLARUT UTK PELARUT RP. -CO2 / HARA TERSEDIA UTK PEROMBAK BAHAN ORGANIK -SULFAT UNTUK OKSIDASI SO,dll METODE MIKROBIOLOGIS: -MEDIUM BEBAS NITROGEN -MEDIUM + BATU FOSFAT -MEDIUM + BAHAN ORGANIK YANG DIUJI -MEDIUM + SULFUR / Fe S (PIRIT) -MEDIUM + Mn SO4, dll PEMELIHARAAN KULTUR MIKROBA UNGGUL DIBUAT BIAKAN MURNI: -KULTUR STOK -KULTUR SEDIAAN PENYIMPANAN KULTUR: 1. JANGKA PENDEK/SEGERA DIGUNAKAN BIAKAN CAIR/PASTA, PADA SUHU 5-15OC TAHAN SAMPAI 1 BULAN BIAKAN AGAR MIRING/ DISIMPAN SUHU 5-15OC TAHAN 3-6 BULAN BIAKAN AGAR MIRING + LAPISAN GLISEROL, PADA SUHU 5-15OC TAHAN SAMPAI 1 TAHUN 2. JANGKA PANJANG/ UNTUK STOK YG TAHAN HIDUP SAMPAI BEBERAPA TAHUN BIAKAN DALAM MEDIUM PASIR ATAU TANAH BIAKAN LIOFILIK TEKNIK PERBANYAKAN MIKROBA PEMILIHAN MEDIUM PERBANYAKAN MIKROBA BAHAN MEDIUM BANYAK TERSEDIA, MUDAH DIDAPAT DAN MURAH HARGANYA MISAL SISA TANAMAN/HEWAN, LIMBAH ORGANIK, KOMPOS, dll + BAHAN KIMIA TEKNIS Sistem Fermentasi untuk Perbanyakan Sel FERMENTASI PADAT: DALAM NAMPAN/ KANTONG FERMENTOR KOLOM FERMENTOR DRUM PUTAR FLUIDIZED BED DEVICES FERMENTASI CAIR KULTUR GOJOK (SHAKE CULTURE) DALAM ALAT FERMENTOR KULTUR CAIR 6
TEKNIK ISOLASI MIKROBA TEKNIK KERJA ASEPTIS UNTUK PENANAMAN BAKTERI STERILISASI MEDIA DAN ALAT UNTUK KULTUR BAKTERI AUTOCALVE MEDIA: 121 O C 15 MENIT ALAT: 121 O C 30 MENIT SEMUA ALAT YANG DIGUNAKAN DISTERILISASI STERILISASI OSE SEBELUM DIGUNAKAN MENANAM BAKTERI PADA PETRIDISH di laminer air flow Bintil akar Isolasi Bakteri Penambat N2 Udara Pengenceran untuk teknik isolasi taburan Pengenceran sumber isolat dilakukan agar diperoleh koloni yang tumbuh terpisah Bintil akar disterilkan, dipecah, diambil cairannya menggunakan jarum ose Ose digoreskan di atas media agar Pada isolasi teknik goresan, sumber isolat bisa diencerkan terlebih dahulu menggunakan air steril, agar diperoleh koloni terpisah. Figure 6.15 7
Pembuatan kultur murni Rhizobium Koloni hasil kultur bintil akar yang terpisah diambil dengan ose DITANAM DI MEDIA AGAR MIRING Simpan dalam refrigerator (almari es tapi bukan di freezernya) Isolasi Mikroba Pelarut Fosfat Tanah risosfer dibuat seri pengenceran dengan air steril Masing2 pengenceran ditaburkan di medium yang mengandung P tak larut /Pikovskaya med Inkubasi suhu kamar selama 3-4 hari Mikroba yang membentuk zona jernih dimurnikan pada medium agar yg sama Dibuat biakan dalam agar miring CONTOH ISOLAT DARI TANAH VERTISOL GADING GUNUNG KIDUL Pemilihan mikroba pelarut fosfat a. Pelarutan P tidak larut pada medium agar Aspergillus JAMUR PELARUT FOSFAT (Sumarsih, 1986) Inokulasi titik koloni yg membentuk zona jernih pada medium pikovskaya agar dalam petri Inkubasikan 4-5 hari pada suhu kamar Ukur luas zona jernih di sekeliling koloni Zona jernih yang terluas menunjukkan kemampuan melarutkan P yg besar 8
Uji kimia :Media cair yang diberi bubuk Sulfur berubah menjadi jernih UJI PEMILIHAN MIKROBA PENGOKSIDASI SULFUR Uji mikrobiologis: Zona jernih di media tanda mampu mengoksidasi Sulfur BAKTERI PETROFILIK (PEROMBAK MINYAK BUMI) dapat membentuk biomassa dengan sumber karbon minyak bumi Sulfur yang semula ditandai dengan keruh menjadi jernih di media cair Minyak bumi Biomassa bakteri/warna minyak bumi berubah Uji Perombakan pati & selulosa Uji Perombakan pati Media diberi larutan Yod. Zona jernih menunjukkan pati telah terombak dipindah ke fermentor sederhana Perombakan CMC (Carboxy Methyl Cellulose) Uji perombakan selulosa mikrokristalin Agar hasil lebih banyak dari kultur gojok dipindah ke fermentor 9
TEKNIK PRODUKSI / PERBANYAKAN MIKROBA SECARA SEDERHANA Kultur murni ditanam dalam media cair bifase digojok Media dari bahan yang mudah didapat Skala produksi kecil menggunakan fermentor sederhana PERBANYAKAN JAMUR MENGGUNAKAN MEDIA PADAT Skala industri Perbanyakan mikroba menggunakan fermentor skala laboratorium Starter KULTUR SEDIAAN STARTER DIPERBANYAK DALAM FERMENTOR Kultur murni PERBANYAKAN BAKTERI DENGAN TEKNOLOGI MODERN DIPERBANYAK DALAM FERMENTOR MODERN 10
STARTER & PENGGANDAAN SKALA FERMENTASI STARTER UNTUK: (a) MENGADAPTASI MIKROBA DARI MEDIUM AGAR KE MEDIUM PERBANYAKAN (b) MEMBUAT INOKULUM DARI SKALA KECIL (BIAKAN MURNI DALAM TABUNG REAKSI) MENJADI SKALA YANG LEBIH BESAR PENGGANDAAN SKALA UNTUK: PRODUKSI SKALA LABORATORIUM SAMPAI SKALA PABRIK PENGATURAN PRODUKSI DAN KONTROL KUALITAS Kultur gojok dalam erlenmeyer 250 ml FERMENTOR SEDERHANA volume 20 liter Bioreaktor Skala Industri volume 1000 liter FORMULASI INOKULAN PACKING DAN PENYIMPANAN INOKULAN: CAMPURAN MIKROBA + CARRIER SIFAT BAHAN CARRIER/PEMBAWA: INERT MUDAH DICAMPUR MUDAH DIBENTUK FORMULASI INOKULAN: BAKTERI: INOKULAN UNTUK BIJI / TANAH, PADAT / CAIR JAMUR : FORMULASI VERMICULITE, TEPUNG/BUBUK, TABLET, PRIL, GEL PACKING: BENTUK CAIR / PADAT KEDAP UDARA/ TIDAK KEDAP UDARA INAKTIVASI/ LIOFILISASI / +ASAM MASA AKTIF / KEDALUARSA PENYIMPANAN: SUHU RUANG / SUHU DINGIN / REFRIGERATOR KELEMBABAN AERASI 11
Alur proses pembuatan inokulum bakteri secara industri Penggandaan skala produksi mikroba Setelah bakteri diperbanyak dicampur dengan carrier Beberapa bentuk produk inokulum 12