7 METODOLOGI Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Analitik Departemen Kimia dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor sejak bulan Januari sampai dengan Juni tahun 2011. Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan adalah daun sirih merah (Piper cf. fragile) yang diperoleh dari BALITTRO Bogor, pakan standar dan pakan kolesterol dibuat di PT Indofeed, tikus jantan galur Sprague dawley serta kandang diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka IPB, dan bahan kimia untuk fraksinasi diperoleh dari laboratorium Kimia Analitik IPB. Peralatan yang digunakan adalah neraca analitik, oven, distilator stahl, kromatografi kolom, pelat KLT (kromatografi lapis tipis), pelat KLTP (kromatografi lapis tipis preparatif), timbangan berat badan tikus, dan instrument GC-MS (Gas Chromatograph-Mass Spectrometer) Agilent Technologies 6890. Metode Penelitian ini dilakukan dua tahap. Tahap pertama adalah pengumpulan bahan, isolasi minyak atsiri daun sirih merah dengan alat distilator stahl dan fraksinasi minyak atsiri dengan kromatografi kolom. Pada tahap ini penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia Analitik IPB. Tahap kedua menguji aktivitas minyak atsiri dan fraksinya secara in vivo pada hewan uji selama 5 minggu dan dilakukan analisis uji profil lipid dari serum darah hewan uji. Selain itu juga dilakukan pengukuran bobot badan setiap seminggu sekali dan pengukuran bobot feses dilakukan dua kali dalam satu minggu serta penimbangan jumlah pakan dan sisa pakan tikus dilakukan setiap hari. Tahap kedua penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka dan Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata, LPPM-IPB. Adapun rangkaian penelitian yang akan dilakukan secara umum dapat dilihat pada Gambar 2.
8 Pengumpulan bahan dan determinasi Isolasi minyak atsiri dengan destilasi air Fraksinasi dengan kromatografi kolom Inhalasi Penentuan komposisi senyawa minyak atsiri (distilat kasar, fraksi 1, fraksi 2) dg GC-MS Uji aktivitas pelangsing secara in vivo pada tikus Sprague dawley Gambar 2. Bagan alir penelitian Preparasi dan Identifikasi Bahan Tanaman (Muchtaridi et al. 2004) Sampel daun sirih merah yang digunakan adalah sampel sirih merah segar dari BALITRO Bogor. Bahan tanaman yang akan diteliti diambil bagian ranting, daun, dan akar. Selanjutnya spesimen ini diidentifikasi di Laboratorium Herbarium Bogoriense LIPI Cibinong Bogor (hasil determinasi disajikan pada Lampiran 5). Sampel ditentukan kadar air dan kadar abunya. Setelah itu, bahan sampel basah didestilasi dengan distilator Stahl. Isolasi Minyak Atsiri dengan Destilasi (Anggraeni 2010) Bahan daun segar yang telah diiris halus ditimbang sebanyak 250 g dan ditambahkan 1250 ml akuades (perbandingan sampel : akuades; 1 : 5) kemudian didestilasi selama 3 jam dengan distilator Stahl, pada suhu berkisar antara 95-105 o C. Distilat minyak atsiri yang diperoleh disimpan di dalam refrigerator, diuji KLT untuk mencari eluen terbaik dan diidentifikasi dengan GC-MS. Selanjutnya distilat kasar disimpan untuk diuji aktivitas secara in vivo terhadap tikus putih galur Sprague dawley. Fraksinasi Minyak atsiri dengan Kromatografi Kolom Fraksinasi dilakukan setelah penentuan eluen terbaik dengan menggunakan KLT. Setelah diperoleh eluen terbaik, selanjutnya dilakukan
9 pemisahan minyak atsiri secara bertahap. Sebanyak 2.24 gram ekstrak minyak atsiri, difraksinasi dengan kromatografi kolom dengan menggunakan metode elusi gradien (heksana-kloroform-metanol). Setiap eluat ditampung dalam tabung reaksi dengan volume masing-masing 3 ml dan diuji dengan kromatografi lapis tipis menggunakan eluen terbaik hasil penentuan dengan KLT yaitu heksana : kloroform, 7:3. Eluat dengan pola spot yang sama digabungkan menjadi satu fraksi. Fraksi 1 dan 2 diidentifikasi dengan GC-MS. Selanjutnya fraksi 1 dan fraksi 2 diuji aktivitas secara in vivo terhadap tikus putih galur Sprague dawley. Pengujian Aktivitas Pelangsing Aromaterapi terhadap Tikus Putih dengan Metode Inhalasi (Anggraeni, 2010). Sebanyak 40 ekor tikus Sprague dawley dikelompokkan menjadi 5 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 8 ekor tikus. Kelompok I (kelompok normal) diberi pakan standar dengan dosis 18 g/ekor/hari dan diberi akuades sebagai air minum. Kelompok II (kelompok kontrol negatif) diberi pakan kolesterol tinggi dengan dosis 18 g/ekor/hari dan diberi akuades sebagai air minum (tanpa perlakuan). Sedangkan untuk kelompok III, IV dan V diberi pakan yang sama dengan kelompok II dan diberi perlakuan yang berbeda (komposisi pakan standar dan pakan kolesterol tinggi untuk tikus pada penelitian ini disajikan pada Lampiran 1 dan 2). Kelompok III diinhalasi minyak atsiri kasar, kelompok IV diinhalasi fraksi 1 dan kelompok V diinhalasi fraksi 2 hasil fraksinasi minyak atsiri sirih merah. Perlakuan ini dilakukan selama 5 minggu. Bobot pakan dan sisa pakan masing-masing kelompok ditimbang setiap hari bobot feses ditimbang 2 kali per minggu dan bobot badan ditimbang setiap minggu. Pada akhir minggu ke-5, dilakukan analisis profil lipida darah meliputi kadar kolesterol total, trigliserida dan kolesterol HDL. Kemudian dilakukan pembedahan terhadap hewan uji, untuk dianalisis warna hati dan ditimbang bobot hati serta deposit lemaknya. Secara umum pengujian aromaterapi secara in vivo dengan metode inhalasi dapat dilihat pada Gambar 3.
10 Hewan uji (40 ekor) Masa adaptasi selama 1 minggu I (n=8) Pakan standar II (n=8) III (n=8) IV (n=8) V (n=8) Pakan kolesterol tinggi Masa perlakuan selama 5 minggu I II III Tanpa inhalasi Inhalasi destilat kasar IV Inhalasi Fraksi 1 V Inhalasi Fraksi 2 Tahap Analisis Bobot pakan ditimbang tiap hari Penentuan bobot feses Setiap 2 kali per minggu Bobot badan ditimbang tiap 1 minggu Minggu ke-6 Analisis darah ( TC, TG, HDL) Analisis warna, bobot hati dan penentuan bobot deposit lemak hewan uji Gambar 3. Bagan alir pengujian aktivitas pelangsing aromaterapi secara in vivo Pengukuran Kadar Kolesterol Total Darah tikus diambil dengan memotong ujung ekor tikus dan ditampung dengan lubang sentrifus. Darah didiamkan selama 2 jam dan disentrifuga selama 5 menit dengan kecepatan 3424 g ( 3500 rpm dengan jari-jari sentrifuse 1 cm).
11 Sebanyak 10 µl serum dimasukan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan pereaksi kolesterol sebanyak 1000 µl lalu dicampur dengan menggunakan vortex dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Serapan diukur pada panjang gelombang 500 nm terhadap blangko. Sebagai blangko digunakan pereaksi kolesterol 1000 µl dan akuades 10 µl. Pengukuran serapan standar sama dengan pengukuran serapan kolesterol total, tetapi serum darah diganti dengan standar kolesterol. Kadar kolesterol total dihitung dengan rumus sebagai berikut: A Sampel C = x Cst A Standar Keterangan : C = kadar kolesterol (mg/dl), A = Serapan, Cst = kadar kolesterol standar (200 mg/dl) Pereaksi kolesterol diperoleh dari PT. Rajawali Nusindo, terdiri dari buffer fosfat ph 6.5, 4-aminofenazon, fenol, peroksidase, kolesterol esterase, kolesterol oksidase, natrium azida dan kolesterol. Pengukuran Kadar Trigliserida Serum diambil sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan larutan pereaksi trigliserida sebanyak 1000 µl lalu larutan dicampur dengan vortex, kemudian biarkan 20 menit pada suhu kamar dan diukur serapan pada panjang gelombang 500 nm terhadap blangko. Pengukuran serapan standar dilakukan dengan cara yang sama dengan pengukuran serapan sampel. Kadar trigliserida dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: A Sampel C = x Cst A Standar Keterangan : C = kadar trigliserida (mg/dl) A = Serapan Cst = kadar trigliserida standar (200 mg/dl) Pereaksi trigliserida diperoleh dari PT rajawali Nusindo terdiri dari buffer ph 7.5, 4-klorofenol, gliserolkinase, peroksidase, lipase, ATP, 4-aminoantipirin, gliserol-3-fosfat oksidase, trigliserida.
12 Pengukuran Kadar Kolesterol HDL Sejumlah 200 µl serum dalam tabung reaksi ditambahkan 0,5 ml larutan pengendap (reagen pengendap yang digunakan adalah asam fosfotungstat dan magnesium klorida), dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar dan disentrifuga selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 g atau 10 menit pada 4000 g. Kemudian supernatan diambil sebanyak 100 µl dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan pereaksi kolesterol sebanyak 1000 µl. Selanjutnya campuran ini dihomogenkan dengan vortex, diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar dan diukur serapan pada λ = 500 nm. Hasil serapan yang diperoleh dihitung dengan menggunakan rumus: A Sampel C = x Cst 175 mg/dl A Standar ( ) Keterangan: C = serapan kolesterol HDL (mg/dl) A = serapan Cst = kadar kolesterol standar (175 mg/dl) Pereaksi kolesterol diperoleh dari PT. Rajawali Nusindo, terdiri dari buffer fosfat ph 6.5, 4-aminofenazon, fenol, peroksidase, kolesterol esterase, kolesterol oksidase, natrium azida dan kolesterol. Analisis Warna Hati, Penentuan Bobot Hati dan Penentuan Bobot Deposit Lemak Pada Hewan Uji Pada minggu ke-5 masa perlakuan, masing-masing tikus kelompok I, II, III, IV dan V dibedah dan dikeluarkan hati serta deposit lemaknya. Warna hati dari masing-masing kelompok tikus diamati. Warna hati merah gelap menunjukkan bahwa hati tikus tersebut sehat sedangkan warna hati pucat menunjukkan bahwa hati tikus tersebut rusak. Setelah diamati warnanya, masingmasing hati tikus tersebut ditimbang bobotnya. Deposit lemak yang diambil adalah deposit lemak pada testis dan perut. Deposit lemak ini kemudian ditimbang untuk ditentukan bobot deposit lemaknya.
13 Metode Analisis Data Data yang diperoleh dari percobaan dianalisis dengan metode rancangan acak lengkap (RAL) dan ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% (taraf α 0.05). Nilai P<0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata terhadap respon yang diukur. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Semua data dianalisis dengan program SPSS 16.