METODOLOGI PENELITIAN Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di lahan bekas tambang timah yang sudah direvegetasi oleh PT Koba Tin, Kabupaten Bangka Tengah, Propinsi Bangka Belitung (Tabel 1), laboratorium Ekologi dan Mikologi Departemen Biologi IPB. Analisis sifat fisika dan kimia tanah di Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanah dan Agroklimat Bogor dan identifikasi tumbuhan di Herbarium Bogoriense LIPI, Bogor. Penelitian dilaksanakan selama 12 bulan (Agustus 2007 Juni 2008). Tabel 1 Lokasi analisis vegetasi dan pengambilan contoh tanah No. Lokasi Kode Lokasi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Usia Revegetasi Jongkong 5E Hutan sekunder R 7 Jongkong 5E Overburden Jongkong 5 E Jongkong 24 overburden Jongkong 24 Jongkong 1 Overburden Jongkong 1 Nibung 2 Over burden Nibung 2 ROB-0 0 tahun 7 RTL-0 0 tahun 7 ROB-3 3 tahun 5 RTL-3 3 tahun 4 ROB-16 16 tahun 9 RTL-16 16 tahun 7 ROB-28 28 tahun 5 RTL-28 28 tahun 5 Ketinggian (m dpl) Koordinat Geografis S 02 32' 45.2" E 106 25' 32.9" S 02 32' 44.5" E 106 25' 38" S 02 32' 43.7" E 106 25' 40.0" S 02 33' 05.4" E 106 25' 43.3" S 02 33' 07.2" E 106 25' 38.8" S 02 33' 39.8" E 106 24' 07.7" S 02 33' 37.6" E 106 24' 15.5" S 02 32' 21.8" E 106 22' 46.4" S 02 32' 21.9" E 106 22' 57.6" Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah contoh tanah dan akar yang diambil dari hutan sekunder dan lahan bekas tambang timah di pulau Bangka, zeolit, PVLG, sukrosa 50% (b/v), alkohol 70% (v/v), anakan tumbuhan dari lapang, KOH 2.5% (b/v), 10% (b/v) dan 20% (b/v), H 2 O 2 alkalin, gliserin 50% (v/v) dan pewarna biru tripan.
19 Alat yang digunakan adalah kompas, GPS, Clinometer, pita meteran, tali rafia, bor tanah, kantong plastik, saringan tanah bertingkat berukuran 500, 250, 90 dan 63 µm, sentrifus, mikroskop stereo dan mikoroskop binokuler, cawan petri, gelas objek, gelas penutup, pinset, pinset spora, tabung film dan tabung reaksi. Metode Penelitian Secara garis besar penelitian dibagi menjadi dua bagian. Kegiatan di lapang meliputi analisis vegetasi, pengambilan contoh tanah dari rizosfir dan tumbuhan yang akan digunakan untuk biakan FMA dan analisa sifat fisika dan kimia tanah. Kegiatan di rumah kaca dan laboratorium meliputi analisis tanah, isolasi dan identifikasi FMA dengan menggunakan perbanyakan biakan pot dengan menggunakan anakan tanaman dari lapang sebagai inang. Analisis Vegetasi dan Pengambilan Contoh Tanah Luas minimum area sebesar 0.2 ha ditentukan dengan kurva spesies area (Setiadi & Muhadiono 2001). Analisis kuantitatif terhadap stuktur dan komposisi vegetasi dilakukan pada dua puluh petak (plot) dengan teknik pengambilan contoh kuadrat (Cox 2002). Plot yang dibangun berbentuk bujur sangkar yang berlainan ukurannya untuk setiap fase pertumbuhan vegetasi dengan menggunakan metode plot bersarang (nested plot method). Plot berukuran 1 m x 1 m, 5 m x 5 m, 10 m x 10 m dan 20 m x 20 m berturut-turut digunakan untuk menghitung vegetasi fase semai (seedling), sapihan (sapling), tiang (poles) dan pohon (trees) (Kusmana 1997). Dalam penelitian ini yang dimaksud dengan semai adalah permudaan tingkat kecambah sampai setinggi < 1.5 m, sapihan adalah permudaan dengan tinggi > 1.5 m sampai pohon muda berdiameter <10 cm, tiang adalah pohon muda berdiameter 10 20 cm, dan pohon adalah pohon yang berdiameter > 20 cm. Tingkat keragaman vegetasi akan diuji dengan menggunakan indeks Shanon (Shanon CE 1948, diacu dalam Brower et al. 1990). Parameter yang diamati meliputi jenis, jumlah individu yang ada dan diameter batang untuk tingkat tiang dan pohon. Selain itu juga dilakukan pendataan terhadap herba sebagai tumbuhan bawah. Jenis-jenis vegetasi yang belum diketahui, bagian tumbuhan diambil untuk kemudian diidentifikasi.
20 Pengamatan di lapang juga meliputi kajian faktor edafik. Untuk faktor edafik dilakukan pengambilan contoh top soil untuk memperoleh data sifat fisika dan kimia tanah. Sifat fisika meliputi kadar pasir, kadar debu, kadar liat (tekstur tanah). Sedangkan sifat kimia mencakup ph tanah, KTK, kadar N total, kadar C- organik, CN ratio, P 2 O 5, Ka, Ca, Mg, Na dan Al pada beberapa tingkat umur revegetasi lahan bekas tambang. Pengambilan contoh tanah dan tumbuhan mengikuti metoda kuadrat untuk analisis vegetasi. Tumbuhan yang digunakan untuk analisis kolonisasi FMA adalah tiga tumbuhan yang memiliki INP tertinggi pada fase pohon, kecuali pada ROB-3 dan RTL-3. Pada ke dua lokasi ini tumbuhan yang dianalisis FMA adalah tumbuhan pada fase sapihan. Nilai INP didapatkan dari hasil hasil analisis vegetasi yang dilakukan. 1 10 m 2 3 arah transek 20m 20m Gambar 3 Desain unit contoh vegetasi. d a b c Ket: a. Plot 1 m x 1m untuk semai dan tumbuhan bawah b. Plot 5 m x 5 m untuk sapihan. c. Plot 10 m x 10 m untuk tiang d. Plot 20 m x 20 m untuk pohon
21 Contoh tanah yang dianalisis adalah satu contoh komposit untuk masingmasing petak contoh. Contoh komposit tersebut diambil pada lima titik dari setiap plot. Contoh tanah diambil rata dari permukaan atas sampai kedalaman 20 cm sebanyak 1 kg per tumbuhan per plot dicampur dengan contoh dari plot lain, dari hasil mencampur tersebut diambil 1 kg komposit untuk dianalisis. Penyuburan (Trapping) Anakan yang diperoleh dari lapangan dengan cara diputar ditanam dalam pot berukuran 2 kg yang berisi zeolit steril. Selanjutnya tanaman dipelihara sekitar empat sampai enam bulan di dalam rumah plastik. Setelah berumur empat sampai enam bulan, dilakukan penyaringan spora dengan metode tuang saring basah bertingkat. Spora selanjutnya dihitung dan diidentifikasi menggunakan buku panduan identifikasi Shenck dan Peres (1990). Pewarnaan Akar Akar yang dibawa dari lapang dan hasil biakan pot dibersihkan dan direndam dalam larutan alkohol 50%. Selanjutnya dibuat 20 potongan akar dengan ukuran panjang 1 cm. Potongan-potongan akar diwarnai mengikuti metode pewarnaan biru tripan (Kormanik & McGraw 1982) yang dimodifikasi untuk mengetahui struktur koloni fungi mikoriza. Pertama-tama potonganpotongan akar direndam dalam KOH 2.5% dan dipanaskan sampai 90 C selama 30 60 menit. Kemudian buang larutan KOH dan jika akar masih berwarna gelap tambahkan larutan alkalin H 2 O 2. Setelah akar kelihatan jernih bilas dengan air lalu direndam dalam HCl 1% dan dipanaskan selama 15 menit pada suhu 70 C Setelah itu HCl dibuang dan akar diwarnai pewarna biru tripan. Selanjutnya akar direndam dalam asam gliserol 50% untuk mengurangi kelebihan zat warna. Setiap potongan akar diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100-400 kali untuk melihat ada tidaknya struktur kolonisasi fungi mikoriza arbuskula. Adanya kolonisasi FMA ditandai minimal oleh satu struktur berikut: hifa internal, arbuskula, vesikula atau hifa koil.
22 Isolasi Spora Isolasi spora dilakukan dengan metode tuang saring basah dan dilanjutkan dengan metode sentrifugasi (Brundrett et al. 1994). Media dari biakan pot dicampur sampai homogen, kemudian 100 gr media disuspensikan dalam 1 liter air steril. Setelah itu disaring dengan saringan bertingkat. Saringan yang digunakan berdiameter 500, 250, 90 dan 63 µm. Media yang tertinggal pada saringan yang berukuran 250, 90 dan 63 µm dimasukkan ke dalam cawan petri, selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensikan ke dalam larutan sukrosa 50% (b/v) dan disentrifus selama 2 menit pada kecepatan 2000 rpm. Supernatan dituang ke dalam saringan 63 µm, dibilas dengan air mengalir dan spora hasil penyaringan dimasukkan dalam cawan petri lalu diamati di bawah mikroskop disekting untuk diidentifikasi. Spora yang lengkap struktur morfologinya diisolasi. Beberapa spora yang sudah diisolasi selanjutnya dibuat preparat untuk diidentifikasi. Isolasi spora juga dilakukan pada rizosfir yang dibawa dari lapang. Identifikasi Spora Spora FMA dari hasil saringan diamati menggunakan mikroskop disekting. Spora yang baik dipilih dan diletakkan pada kaca objek dengan media polivinil asam laktat gliserol (PVLG). Identifikasi dilakukan berdasarkan kepada bentuk spora, warna spora, ukuran spora dan permukaan spora (Schenck & Perez 1988). Jenis dan Sumber Data Data yang digunakan dalam penelitian ini dibagi menjadi dua bagian yaitu data primer dan data sekunder. Data primer merupakan data yang diperoleh dari penelitian langsung di lapangan dan di laboratorium, sedangkan data sekunder merupakan data yang diperoleh dari sumber lain (PT Koba Tin, Pemda setempat, hasil penelitian lain, dan dari media massa).
23 Analisis Data Vegetasi Data vegetasi yang telah terkumpul kemudian dianalisis untuk mengetahui kerapatan jenis, kerapatan relatif, dominansi jenis, dominansi relatif, frekuensi jenis dan frekuensi relatif serta Indeks Nilai Penting menggunakan rumus sebagai berikut (Cox 2002) : Kerapatan jenis (K) = Jumlah individu suatu jenis Luas total petak contoh K suatu jenis K. Relatif (KR) = x 100% K total seluruh jenis Dominansi (D) = Luas penutupan suatu jenis Luas petak contoh D suatu jenis D. Relatif (DR) = x100% D seluruh jenis Frekuensi (F) Jumlah petak yang diduduki jenis = Jumlah seluruh petak contoh F suatu jenis F. Relatif (FR) = x100 F seluruh jenis Indeks Nilai Penting atau INP = KR + DR + FR Nilai penting merupakan penjumlahan dari kerapatan relatif, frekuensi relatif dan dominansi relatif yang berkisar antara 0 sampai 300 (Mueller-Dumbois & Ellenberg 1974). Untuk menentukan tingkat keanekaragaman jenis digunakan indeks Shannon dengan rumus sebagai berikut : (H) = - Σ Pi log Pi, dimana peluang kepentingan untuk tiap spesies (Pi) = Analisis Kolonisasi FMA berikut: INPi INP total Persentase kolonisasi FMA pada akar dihitung dengan rumus sebagai % kolonisasi FMA = Jumlahbidang pandang terkolonisasi Jumlah seluruhbidang pandang x 100 %