35 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Jenis penelitian ini adalah eksperimen murni sesungguhnya (True Experimental Research) dengan menggunakan metode The post test Only Control Group Design. Hal ini dapat dibuktikan dengan dipakai rancangan posttest dengan kelompok kontrol (The post test Only Control Group Design). Randomisasi dilakukan pada penelitian untuk menentukan kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Tahap akhir penelitian, sampel dilakukan penilaian terhadap penyembuhan luka sayat yang dilakukan setiap hari secara makroskopik. Berdasarkan permasalahannya, rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL). Penelitian ini terdapat 5 perlakuan (3 perlakuan uji dan 2 perlakuan kontrol) dan perlakuan diulang 5 kali. Berikut denah RAL pada tabel 3.1: A1(4) A5(1) A3(4) A4(2) A4(4) A2(3) A5(3) A5(5) A4(1) A3(1) A4(3) A2(5) A1(3) A3(4) A1(5) A3(5) A5(4) A2(1) A3(3) A2(2) A5(2) A1(1) A4(4) A1(2) A3(3) Tabel 3.1 Denah Rancangan Acak Lengkap (RAL)
36 Keterangan: A1-A5 adalah perlakuan, (1)-(5) adalah ulangan Pembagian kelompoknya adalah sebagai berikut: Kelompok A1 : Kelompok kontrol positif dengan pemberian betadine Kelompok A2 : Kelompok kontrol negatif tanpa pemberian perlakuan Kelompok A3 : Kelompok perlakuan menggunakan ekstrak daun cengkeh 10% Kelompok A4 : Kelompok perlakuan menggunakan ekstrak daun cengkeh 15% Kelompok A5 : Kelompok perlakuan menggunakan ekstrak daun cengkeh 20% Rancangan Penelitian yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL). Ciri-ciri rancangan jenis ini adalah dilakukan di laboratorium dimana lingkungan laboratorium tersebut dianggap homogen. Rancangan ini merupakan rancangan yang perlakuannya diletakkan dan dilakukan secara acak pada setiap percobaan, hal ini berarti seluruh unit percobaan memiliki peluang yang sama untuk menerima perlakuan. Penelitian diperlukan suatu ulangan dalam perlakuan dikarenakan dibutuhkan derajat ketelitian terhadap suatu penelitian dengan jumlah ulangan yang dianggap cukup baik apabila memenuhi syarat berikut: (t-1) (r-1) 15 Keterangan r : Replikasi (jumlah ulangan) t : Treatment (jumlah perlakuan) (t-1) (r-1) 15 (5-1) (r-1) 15 4 (r-1) 15 4r 4 15 4r 19 r 4,75 atau dibulatkan r 5 Berdasarkan rumus diatas didapatkan jumlah pengulangan yang diperlukan adalah sebanyak 5 kali.
37 3.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Universitas Muhammadiyah Malang. Waktu penelitian dilaksanakan pada tanggal 5-18 April 2017. 3.3 Populasi, Sampel dan Teknik Sampling 3.3.1 Populasi Penelitian Populasi merupakan keseluruhan subyek penelitian. Populasi adalah totalitas semua nilai yang mungkin hasil menghitung ataupun pengukuran, kuantitatif maupun kualitatif mengenai karakteristik tertentu dari semua anggota kumpulan yang lengkap dan jelas yang ingin dipelajari sifat-sifatnya (Sudjana, 1996). Populasi dalam penelitian ini adalah semua tikus putih (Rattus norvegicus), dengan berat badan rata-rata 180-300 gram dan berumur 2-3 bulan. Penelitian ini mengunakan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) karena memiliki struktur kulit dan homeostatis yang serupa dengan manusia (Ratih, 2009). 3.3.2 Sampel Penelitian Sampel adalah sebagian subyek/ objek dari populasi yang diteliti. Sampel keseluruhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) yang dibagi menjadi 5 kelompok dan tiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus putih. 3.3.3 Teknik Sampling Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah simple random sampling (acak sederhana), yaitu cara pengambilan sampel dari unit anggota populasi mempunyai kesempatan yang sama untuk dipilih menjadi sampel.
38 Peneliti menggunakan 25 ekor tikus yang dibagi dalam 5 kelompok yaitu 2 kelompok kontrol dan 3 kelompok perlakuan ekstrak daun cengkeh dengan konsentrasi 10%, 15% dan 20%. 3.4 Jenis Variabel 3.4.1 Variabel Bebas Variabel bebas adalah variabel yang mempengaruhi atau yang menjadi sebab perubahannya atau timbulnya variabel dependen (terikat). Variabel bebas dalam penelitian ini adalah berbagai konsentrasi ekstrak daun cengkeh (Syzygium aromaticum). 3.4.2 Variabel Terikat Variabel terikat adalah variabel yang dipengaruhi atau yang menjadi sebab akibat, karena adanya variabel bebas. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah penyembuhan luka sayat. 3.4.3 Variabel Kontrol Variabel kontrol adalah variabel yang dikendalikan atau dibuat konstan sehingga hubungan variabel independen terhadap dependen tidak dipengaruhi faktor luar yang tidak diteliti. Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah jenis tikus, berat badan, pakan tikus, dan suhu lingkungan (suhu ruang) serta kandang. 3.5 Definisi Operasional Variabel 1. Konsentrasi ekstrak daun cengkeh adalah angka banding volume zat terlarut terhadap volume zat pelarut atau larutan yang dinyatakan secara khusus.
39 Pelarut yang digunakan dalam ekstrak daun cengkeh dengan menggunakan pelarut etanol 96%. 2. Penyembuhan luka sayat merupakan suatu proses yang kompleks dan dinamis karena merupakan suatu kegiatan bioseluler dan biokimia yang terjadi saling berkesinambungan. Penyembuhan luka sayat waktu yang diperlukan untuk penyembuhan mulai dari hari pertama dilakukan pembuatan luka sampai dengan kulit kembali seperti semula, dengan melalui 3 fase sebagai berikut: Fase inflamasi adanya eritema dan edema jaringan sekitar luka Fase proliferasi adanya granulasi jaringan pada luka Fase maturasi adanya jaringan parut dan luka kering 3. Jenis tikus pada penelitian ini yang digunakan adalah tikus putih dari spesies Rattus norvegicus. 4. Berat badan tikus merupakan berat badan rata-rata dari tikus yang akan digunakan dalam penelitian yaitu berat badan rata-rata adalah 180-300 gram. 5. Umur tikus merupakan umur rata-rata dari tikus yang akan digunakan dalam penelitian yaitu tikus berumur rata-rata 2-3 bulan. 6. Jenis pakan adalah suatu yang bisa dimakan sebagai sumber energi yang dibutuhkan oleh makhluk hidup. Pakan yang digunakan dari jenis BR-1. 7. Jenis minum adalah cairan yang dibutuhkan untuk membantu proses metabolisme tubuh. Jenis minuman yang digunakan adalah air mineral. 8. Alas adalah suatu bahan yang terbuat serbuk kayu yang berfungsi untuk menghangatkan tubuh tikus.
40 9. Jenis kandang tikus adalah suatu tempat yang digunakan untuk memelihara tikus. Kandang yang digunakan berasal dari nampan plastik yang yang ditutup dengan kawat berlubang, jumlah tikus harus sesuai dan tidak terlalu banyak karena bila tikus berdesak-desakan dapat menyebabkan suhu badan meningkat di atas normal sehingga dapat mengakibatkan hipertermia. 3.6 Metode Pengumpulan Data Metode yang digunakan untuk pengambilan data dalam penelitian ini menggunakan metode observasi setelah eksperimen (posttest) yaitu teknik pengambilan data secara langsung dengan prosedur berencana yang melibatkan kegiatan melihat dan mencatat aktivitas atau kegiatan tertentu. Observasi dilakukan di laboratorium terhadap obyek perlakuan yaitu variabel terikat yang diberi perlakuan, baik perlakuan kontrol maupun perlakuan ekstrak daun cengkeh konsentrasi 10%, 15% dan 20%, kemudian data yang diperoleh diaplikasikan ke dalam bentuk tabel. Observasi dilakukan terhadap kecepatan penyembuhan luka sayat yang ditunjukkan pada tabel 3.2 berikut: Tabel 3.2 Rata-rata penyembuhan luka sayat (dalam hari) pada tikus putih (Rattus norvegicus) akibat pemberian berbagai konsentrasi ekstrak daun cengkeh (Syzygium aromaticum) No Perlakuan Ulangan ke- Total Rerata 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
41 3.7 Prosedur Penelitian Prosedur penelitian dibagi menjadi tiga tahapan yaitu tahap persiapan, tahap pelaksanaan, dan tahap pengamatan. 3.7.1 Tahap Persiapan 1. Menyiapkan alat yang akan digunakan dalam penelitian. Adapun alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1) Handscoon : 2 pasang 2) Sarung tangan : 2 pasang 3) Gunting : 2 buah 4) Blender : 1 buah 5) Timbangan analitik : 1 buah 6) Oven : 1 buah 7) Corong Buchner : 1 buah 8) Erlenmeyer 1000 ml : 4 buah 9) Rotaty Evaporator : 1 buah 10) Silet cukur : 2 buah 11) Silet golt : 2 buah 12) Kamera : 1 buah 13) Pipet tetes : 3 buah 14) Penggaris : 1 buah 15) Kandang : 5 buah 16) Masker : 1 pack 17) Botol flakon : 3 buah
42 18) Spatula : 1 buah 19) Beaker glass 1000 ml : 1 buah 20) Kertas saring : 1 lembar 21) Vacum : 1 buah 22) Alumunium foil : 1 lembar 2. Menyiapkan bahan yang akan digunakan dalam penelitian. Adapun bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1) Daun cengkeh : 800 gram 2) Tikus Putih : 25 ekor 3) Alkohol 70% : 500 ml 4) Pakan : 8 kg 5) Air mineral : 1 galon 6) Etanol 96% : 2 liter 7) Kertas label : 1 lembar 8) Aquades : 5 liter 9) Betadine 10% : 30 ml 3.7.2 Tahap Pelaksanaan 1. Pembuatan Serbuk Daun Cengkeh (Syzygium aromaticum) lihat lampiran 1 1) Mengambil bagian tanaman yang digunakan untuk pembuatan ekstrak adalah daun cengkeh (Syzygium aromaticum) 2) Memilih masing-masing daun yang bagus berwarna hijau tua 3) Mencuci daun cengkeh sebanyak 800 gram dengan air untuk menghilangkan debu dan kotoran lain.
43 4) Meniriskan daun, lalu dikeringkan di bawah sinar matahari langsung, tujuan pengeringan adalah untuk mendapatkan ekstrak yang tidak mudah rusak sehingga dapat disimpan lebih lama atau dioven pada suhu 40 sampai kadar airnya hilang. Menghaluskan daun yang sudah kering dengan menggunakan blender sampai menjadi serbuk halus, kemudian disimpan dalam erlemenyer 1000 ml. 2. Pembuatan Ekstrak dari serbuk Daun Cengkeh (Syzygium aromaticum) dengan pelarut etanol 1) Merendam serbuk daun cengkeh (Syzygium aromaticum) yang sudah halus direndam dalam etanol 96% secukupnya. Sebanyak 800 g serbuk daun cengkeh dibagi menjadi empat yaitu masing-masing sebanyak 200 g direndam dalam 500 ml etanol 96%. Kemudian menutup erlenmeyer dengan alumunium foil. 2) Menyimpan dalam lemari bahan selama 24 jam, untuk proses maserasi. 3) Menyaring ekstrak menggunakan corong buchner dan kertas saring yang kemudian diambil filtratnya. 4) Filtrat dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator. Hasil evaporasi dimasukkan dalam oven pada suhu 40 hingga diperoleh ekstrak kental. 5) Mengencerkan ekstrak secara berseri dengan pelarut aquades sehingga didapat konsentrasi ekstrak 10%, 15%, dan 20%. Perhitungan pembuatan konsentrasi ekstrak daun cengkeh menggunakan rumus sebagai berikut: N1. V1 = N2. V2
44 Keterangan: N1 = Konsentrasi awal V1 = Volume yang dicari N2 = Konsentrasi yang diinginkan V2 = Volume yang diinginkan Konsentrasi 10% didapatkan dari: N1. V1 = N2. V2 100. V1 = 10. 20 V1 = 200/100 = 2 ml Jadi, 2 ml ekstrak + 18 ml aquadest Konsentrasi 15% didapatkan dari: N1. V1 = N2. V2 100. V1 = 15. 20 V1 = 300/100 = 3 ml Jadi, 3 ml ekstrak + 17 ml aquadest Konsentrasi 20% didapatkan dari: N1. V1 = N2. V2 100. V1 = 20. 20 V1 = 400/100 = 4 ml Jadi, 4 ml ekstrak + 16 ml aquadest 3. Aklimatisasi (pengkodisian) Tikus Putih Tahapan aklimatisasi atau pengkondisian tikus putih dimulai dengan menyiapkan 25 ekor tikus putih jantan, yang dibagi secara acak menjadi 5
45 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor, kemudian tikus putih jantan ditempatkan pada kandang dan diaklimasi selama 3 hari untuk pengkondisian habitat dan agar tikus tidak stres, rutin diberi makan dan minum serta pengantian alas agar kandang tetap bersih. 4. Penyayatan Tikus Putih (Rattus norvegicus) 1) Membagi tikus menjadi 5 kelompok. Masing-masing kelompok disebut kelompok A1, A2, A3, A4, A5 yang sesuai dengan matrik penelitian. 2) Menempatkan didalam kandang yang berbeda dengan memberikan makan dan minum. 3) Mencukur bulu tikus menggunakan silet cukur tepatnya di daerah punggung dan kulit diolesi dengan alkohol. 4) Melakukan perlakuan pada punggung tikus putih dengan membuat sayatan dengan panjang ± 2 cm dengan kedalaman ± 2 mm menggunakan silet golt yang tajam. 5) Mengambil ekstrak daun cengkeh secukupnya dengan kadar konsentrasi yang berbeda yaitu 10%, 15%, 20% dengan menggunakan pipet tetes yang steril. 6) Meneteskan ekstrak daun cengkeh sebanyak 3 tetes pada setiap tikus putih dengan konsentrasi 10%, 15%, 20% dan betadine (kontrol) pada bagian punggung tikus yang mengalami luka sayat setiap harinya. 7) Mengamati hasil yang diperoleh dengan cara melihat panjang luka sayat yang telah diberi berbagai konsentrasi ekstrak daun cengkeh. 8) Melakukan perlakuan yang berikan sampai luka sayat dinyatakan sembuh.
46 3.7.3 Tahap Pengamatan Pengamatan dilakukan pada hari berikutnya mendokumentasikan kondisi luka sayat. Dilakukan setiap hari pagi jam 09.00 WIB. Pengkajian luka yaitu sebagai berikut: Mengamati panjang luka dan mengamati secara makroskopis dari tiap perlakuan yaitu pengamatan dilakukan dengan melihat morfologi dari penyembuhan luka mulai dari pertama dilakukan pembuatan luka sampai luka sembuh dengan melihat 3 fase sebagai berikut: Fase inflamasi adanya eritema dan edema jaringan sekitar luka Fase proliferasi adanya granulasi jaringan pada luka Fase maturasi adanya jaringan parut dan luka kering 3.8 Teknik Analisis Data Teknik analisis data yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: uji normalitas yang berfungsi untuk mengetahui apakah data yang diperoleh berdistribusi normal, dan uji homogenitas yang berfungsi untuk mengetahui apakah varian datanya homogen, maka data yang diperoleh di uji dahulu dengan normalitas (Liliefors) dan uji homogenitas (Barlett) dan diteruskan dengan uji One Way Anova yang berfungsi untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan pengaruh dari perlakuan yang diberikan lihat lampiran 4.