METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Bagian Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung pada bulan Maret - September 2010. Materi Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini berupa kultur starter Bakteri Asam Laktat (BAL) yang berasal dari Kefir dan bakteri hasil isolasi dari produk olahan susu sapi yaitu B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 yang merupakan bakteri koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Bakteri patogen yang digunakan adalah S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, dan S. Typhimurium ATCC 14028. Bahan-bahan lain yang dipergunakan adalah media tumbuh bakteri dan bahan kimia diantaranya meliputi susu skim, deman s Rogosa Sharpe Agar (MRSA), deman s Rogosa Sharpe Broth (MRSB), Buffer Pepton Water (BPW), Phosphate Buffered Saline (PBS), Eosin Methilen Blue Agar (EMBA), Salmonella Shigella Agar (SSA), Mueller Hinton Agar (MHA), HCl, NaOH, NaCl, bile salt, antibiotik (amoksisilin dan kloramfenikol), alkohol 70%, kristal violet, iodin, safranin, minyak imersi, aquadestilata, alumunium foil dan kapas. Alat Peralatan yang digunakan meliputi ruang steril, tabung reaksi, cawan petri, pipet, botol Scott, labu Erlenmeyer, inkubator, autoclave, spektrofotometer, penangas air, mikroskop, ph meter, timbangan digital, pemanas Bunsen, jangka sorong, lemari es, jarum Öse, sentrifuse, oven, gelas ukur, vortex, panci, cork borer, jangka sorong, kompor, sendok pengaduk dan flux laminaire (ruang steril).
Prosedur Pemeriksaan Kultur Bakteri Asam Laktat dan Patogen (Pelczar dan Chan, 2007) Kultur BAL kefir, B. longum Y-01, L. acidophilus Y-01 dan bakteri patogen S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 dan S. typhimurium ATCC 14028 diperiksa karakteristik morfologinya. Pengujian morfologi dilakukan dengan pewarnaan Gram diikuti dengan pengujian katalse. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara pengolesan preparat bakteri pada gelas objek, dilanjutkan dengan fiksasi di atas api. Setelah itu kristal violet diteteskan di atas preparat, didiamkan selama ±1 menit, kemudian dibilas dengan akuadestilata. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin selama ±1 menit dan dibilas kembali dengan akuadestilata. Preparat kemudian dikeringudarakan, selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ±5 detik, dibilas kembali dengan akuadestilata dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ±30 detik dan dibilas kembali dengan akuadestilata, lalu preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 100 dengan bantuan minyak imersi. Uji katalase menggunakan bahan kimia H 2 O 2. Satu Öse preparat bakteri dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan satu tetes H 2 O 2. Jika dihasilkan gelembung gas O 2, maka bakteri yang diuji termasuk kelompok bakteri katalase positif (+), sebaliknya bila bakteri yang diuji tidak menghasilkan gelembung gas maka bakteri tersebut termasuk kelompok bakteri katalase negatif (-). Penentuan Standar Populasi Bakteri Asam Laktat (Waluyo, 2008) Tahap ini bertujuan untuk menentukan jumlah populasi BAL selama diberikan perlakuan (ketahanan dalam lingkungan ph yang berbeda, keberadaan garam empedu dan adanya antibiotik) yang dihitung dengan pendekatan dua metode yaitu metode pour plate (hitungan cawan) dan metode turbidimetrik dengan spektrofotometer. Metode pour plate digunakan untuk penentuan populasi BAL sebelum dan sesudah perlakuan, sedangkan metode turbidimetri digunakan untuk penentuan perubahan populasi BAL selama perlakuan. 17
Metode Hitungan Cawan (Bakteriological Analytical Manual, 2001). Tahap ini diawali dengan pengenceran yang dilakukan dengan mengambil 1 ml sampel yang sudah homogen menggunakan pipet steril, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml laruran pengencer yaitu BPW, sehingga terbentuk pengenceran 10-1. Pengenceran terus dilakukan sampai pada pengenceran 10-9. Pengambilan sampel dilakukan menggunakan pipet steril pada pengenceran 10-6, 10-7, 10-8 dan 10-9 sebanyak 1 ml dan dipindahkan ke dalam cawan Petri steril secara duplo. Media MRSA ditambahkan ke dalam cawan Petri dengan metode tuang (pour plate) sebanyak 12-15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan Petri digerakkan dengan arah membentuk angka delapan. Cawan Petri diinkubasikan setelah agar mengeras, dengan posisi terbalik pada suhu 37 C selama 24 48 jam. Koloni mikroba yang terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC) dengan rumus sebagai berikut : Populasi (cfu/ml) = N Cawan [n 1 + (0,1 x n 2 )] x d Keterangan : N = Jumlah koloni yang berbeda dalam kisaran hitung (25-250 koloni) n 1 = Jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung n 2 = Jumlah cawan kedua yang koloninya dapat dihitung d = Tingkat pengenceran pertama yang dihitung Metode Turbidimetrik (Waluyo, 2008). Tahap ini diawali dengan penentuan korelasi antara nilai optical density (OD) dengan populasi bakteri hasil pemupukan dengan metode pour plate. Semakin tinggi nilai OD maka jumlah populasi bakteri yang dipupukkan juga semakin banyak, sehingga membentuk persamaan linier y = a + bx (y jumlah populasi BAL, x nilai OD bakteri dan a dan b konstanta persamaan). Persamaan linier yang didapat (Tabel 3) digunakan dalam penentuan populasi BAL kefir, B. Longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 pada pengujian ketahanan terhadap ph yang berbeda, garam empedu, dan antibiotik yang berbeda. Nilai R 2 merupakan nilai detrminan dari persamaan linier yang didapat, nilai R 2 yang 18
mendekati nilai 1 maka persamaan linier akan semakin akurat dengan populasi yang dipupukkan. Tabel 3. Persamaan Linier BAL Indigenous Kefir dan Produk Olahan Susu Sapi No. Bakteri Persamaaan Linier R 2 1. Bakteri Asam Laktat Kefir y = 7,1955 + 0,7034x 0,9246 2. B. longum Y-01 y = 6,6840 + 1,093x 0,9579 3. L. acidophilus Y-01 y = 7,2057 + 1,812x 0,9768 Penelitian Utama Persiapan Sel-sel Kultur Bakteri Asam Laktat Sel-sel kultur BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 yang berumur 24 jam masing-masing dalam MRSB dipanen melalui sentrifugasi pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit dalam suhu 4 0 C. Bagian presipitat atau endapan dipisahkan dari bagian supernatannya. Presipitat selanjutnya distandarisasi dengan populasi awal ±10 7 cfu/ml ke dalam larutan PBS. Uji Ketahanan terhadap ph yang Berbeda (Chou dan Weimer, 1999) Presipitat sel-sel kultur BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 yang sudah distandarisasi dengan populasi awal ±10 7 cfu/ml dimasukkan ke dalam larutan PBS yang telah dikondisikan pada ph 2,0 dengan bantuan HCl dan NaOH. Kultur bakteri dalam PBS diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 180 menit. Penghitungan populasi awal sebelum (t 0 ) dan sesudah diinkubasi selama 180 menit (t 180 ) dihitung dengan metode hitungan cawan. Perubahan populasi BAL selama perlakuan dalam ph yang berbeda diamati setiap 30 menit, melalui pengukuran nilai absorbansi ( 620 nm) dengan menggunakan spektrofotometer. Nilai OD (x) yang diperoleh dikonversikan dalam persamaan y a bx (Tabel 3) yang ada untuk memperoleh penyetaraan populasi BAL. Uji ketahanan kultur BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 terhadap ph yang berbeda ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri, yaitu bila kultur starter BAL mampu mempertahankan populasinya hingga 50% dinyatakan sebagai probiotik. 19
Penelitian ini mengamati kemampuan bertahan atau tumbuh BAL pada saluran pencernaan. Kondisi keasaman lambung mempunyai kisaran ph antara 2-3,5 sehingga nilai ph yang diamati adalah 2; 2,5; 3,2. Kondisi ph pada usus adalah netral sehingga pengamatan dilakukan pada ph 7,2. Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu (Lin et al., 2006) Uji ketahanan terhadap garam empedu dilakukan terhadap isolat bakteri BAL kefir, B. longum Y-01 atau L. acidophilus Y-01 yang dapat tumbuh pada ph 2,0. Pengujian disesuaikan dengan kadar garam empedu pada saluran pencernaan yaitu dengan menggunakan bile salt sebanyak 0,3% oxgall b/v dalam media PBS dengan ph 7,2. PBS yang telah ditambahkan garam empedu dengan konsentrasi 0,3% pada ph 7,2, kemudian disterilisasi pada suhu 121 o C selama 15 menit. Presipitat sel-sel kultur BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 yang sudah distandarisasi dengan populasi awal ±10 7 cfu/ml diinokulasikan pada media PBS yang telah ditambahkan garam empedu 0,3% steril. Kultur diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Penghitungan populasi awal sebelum (t 0 ) dan sesudah diinkubasi selama 24 jam (t 24j ) dihitung dengan metode hitungan cawan. Perubahan populasi BAL selama perlakuan dengan penambahan garam empedu 0,3% oxgal diamati setiap 1 jam selama 24 jam, melalui pengukuran nilai absorbansi ( 620 nm) dengan menggunakan spektrofotometer. Nilai OD (x) yang diperoleh dikonversikan dalam persamaan y a bx (Tabel 3) untuk memperoleh penyetaraan populasi BAL. Uji ketahanan kultur BAL kefir, B. longum Y-01 atau L. acidophilus Y-01 terhadap garam empedu ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri, yaitu bila kultur starter BAL mampu mempertahankan populasinya hingga 50% dinyatakan sebagai probiotik. Uji Ketahanan terhadap Antibiotik (Modifikasi Liasi et al., 2009) Uji ketahanan terhadap antibiotik dilakukan terhadap isolat BAL dapat bertahan tumbuh pada ph 2,0 dan adanya garam empedu 0,3%. Bakteri selanjutnya diuji berdasarkan sensitifitasnya terhadap antibiotik. Presipitat distandarisasi dengan populasi awal ±10 7 cfu/ml, lalu diinokulasikan ke dalam media MRSB yang telah ditambahkan antibiotik (amoksisilin atau kloramphenikol) sebanyak 30 μg/ml. 20
Pengukuran populasi awal dihitung dengan metode pemupukan sebelum diinkubasi (t 0 ). Kultur diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Penghitungan populasi awal sebelum (t 0 ) dan sesudah diinkubasi selama 24 jam (t 24j ) dihitung dengan metode hitungan cawan. Perubahan populasi BAL selama perlakuan dalam ph yang berbeda diamati setiap 1 jam, melalui pengukuran nilai absorbansi ( 620 nm) dengan menggunakan spektrofotometer. Nilai OD (x) yang diperoleh dikonversikan dalam persamaan y a bx (Tabel 3) untuk memperoleh penyetaraan populasi BAL. Uji ketahanan kultur BAL kefir, B. longum Y-01 atau L. acidophilus Y-01 terhadap ph yang berbeda ditentukan berdasarkan jumlah kematian bakteri, yaitu bila kultur starter BAL mampu mempertahankan populasinya hingga 50% dinyatakan sebagai probiotik. Uji Sifat Antimikroba terhadap Bakteri Patogen (Modifikasi Maheswari, 2008) Persiapan Filtrat Bebas Sel (FBS) dan FBS Terkonsentrasi. Kultur bakteri yang sudah disegarkan (populasi 10 7 CFU/ml) diinokulasikan dalam MRSB ( 5% v/v), lalu diinkubasi pada 37 o C selama 18 jam. Filtrat bebas sel (FBS) diperoleh dengan penyaringan steril menggunakan filter 0,22 m (Millipore). FBS dikonsentrasikan dengan cara menambahkan ke dalam FBS metanol (MeOH) dengan rasio 1:1, kemudian dievaporasi dalam rotary evaporator pada suhu 40-45 0 C selama ± 60 menit atau hingga mencapai 1/5 volume awal, dengan tujuan untuk meningkatkan aktivitas antimikroba dari BAL. FBS terkonsentrasi segera disimpan dalam refrigerator (4 o C) sebelum digunakan. Persiapan Bakteri Indikator. Bakteri uji (BAL dan bakteri patogen) yang digunakan adalah bakteri yang berumur 24 jam. Bakteri patogen dengan populasi awal minimal 10 8 cfu/ml (standar Mc Farland no.2) dalam media NB terlebih dahulu diencerkan dalam media NaCl fisiologis hingga populasi mencapai 10 5 cfu/ml. Konfrontasi Filtrat Bebas Sel dengan Bakteri Indikator. Pengujian aktivitas antimikroba kultur BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 terhadap bakteri patogen dilakukan dengan metode difusi agar sumur. Sebanyak masingmasing 1 ml kultur bakteri patogen yang telah diencerkan dengan populasi 10 5 cfu/ml dipipet ke dalam cawan petri, lalu ditambahkan media Muller Hinton Agar dengan suhu 50 o C sebanyak 20 ml/cawan, lalu dihomogenkan dengan cara digerakkan 21
membentuk angka delapan. Media MHA berisi bakteri indikator dibiarkan memadat, kemudian dibuat sumur difusi berdiameter 7 mm dengan alat pelubang atau cork borer, lalu bagian bawah sumur dilapisi dengan media Bacteriological Agar untuk menghindari filtrat merembes di dasar sumur. Sebanyak 50 l FBS terkonsentrasi dipipet ke dalam sumur, lalu cawan beserta isi diletakkan dalam refrigerator untuk memberi kesempatan FBS berdifusi ke dalam agar. Cawan selanjutnya diinkubasi pada 37 o C selama 24 jam. Diameter penghambatan berupa zona bening di sekeliling sumur diukur dengan jangka sorong pada empat tempat yang berbeda, lalu hasil pengukuran dirata-ratakan. Percobaan dilakukan dengan 2 kali ulangan. Diameter rata-rata (mm) = (A-7) + (B-7) + (C-7) + (D-7) 4 d c a b Area bakteri patogen Zona hambat/bening Lubang sumur (d=7 mm) Gambar 3. Skema Pengukuran Zona Hambat 22
Diagram Alir Penelitian Stok Kultur Bakteri Pemeriksaan Kultur Bakteri BAL (BAL Kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01) Bakteri Patogen Indikator (S. Typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 25922, dan S. aureus ATCC 25923) Standarisasi Populasi Kultur Starter (10 7 cfu/ml) Standarisasi Populasi Bakteri Patogen Indikator (standar Mc Farland no.2 yaitu 10 8 cfu/ml) Pengujian Ketahanan ph (2; 2,5; 3,2 dan 7,2) Pengujian Ketahanan Garam empedu (0,3% oxgall) Pengujian Ketahanan Antibiotik (Amoksisilin dan Kloramfenikol) Persiapan FBS dan FBS Terkonsentrasi 5x Tahan Tidak Tahan Konfrontasi (difusi agar sumur) Menghasilkan zona penghambatan Tidak Menghasilkan zona penghambatan Bakteri Probiotik Bukan Bakteri Probiotik Gambar 4. Diagram Alir Proses Penelitian 23
Rancangan Percobaan Uji t. Data ketahanan BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 terhadap perlakuan ph yang berbeda (2; 2,5; 3,2 dan 7,2), keberadaan garam empedu 0,3% dan antibiotik yang berbeda (amoksisilin dan kloramfenikol) dianalisis dengan uji t. Data populasi BAL kefir, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 dianalisis dengan membandingkan populasi masing-masing BAL sebelum diberi perlakuan (t 0 ) dan setelah diberi perlakuan (t x ). Analisis data dipergunakan untuk melihat pengaruh perlakuan terhadap peubah yang diamati dengan masing-masing perlakuan terdiri atas tiga ulangan. Rumus yang digunakan dalam Uji t adalah sebagai berikut : Keterangan : μi = rata-rata perlakuan ke-i μj = rata-rata perlakuan ke-j s = simpangan baku n = jumlah data Rancangan Acak Lengkap (RAL) Rancangan Acak Lengkap digunakan untuk menganalisis aktivitas antimikroba BAL terhadap bakteri patogen yang berbeda (S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 dan S. typhimurium ATCC 14028) dan untuk menganalisis persentase bakteri yang hidup pada kondisi ph yang berbeda, garam empedu dan antibiotik berbeda. Persamaaan model rancangannya menurut Gaspersz (1994). Yij = μ + δ i + ε ij Keterangan : Y ij = Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j μ = Rataan Umum δ i = Pengaruh perlakuan ke-i ε ij i = Pengaruh galat percobaan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j = BAL uji yang berbeda 24
j = Ulangan 1, 2, dan 3 Data hasil kedua rancangan selanjutnya dianalisis dengan Analysis of variance (ANOVA). Apabila pada analisis ragam didapatkan hasil yang berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut dengan uji Tukey (Gaspersz, 1994). 25