BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan di Laboratorium Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Gorontalo (UNG). 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Timbangan analitik, oven, blender, rotary evaporator vakum, penyaring buchner, gelas ukur 10 ml, beacker glas 100 ml, tabung reaksi, pipet mikro, kertas saring, aluminium foil, alat kolom Spektrofotometer inframerah dan Spektrofotometer UV-Vis. 3.2.2 Bahan Tumbuhan Bahan tumbuhan (sampel) yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit dari buah manggis yang diperoleh dari pedagang buah di pasar Kota Gorontalo. 3.2.3 Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol, n- heksan, etilasetat, dietil eter, kloroform, aquades, HCl pekat, pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, pereaksi Hager, kloroform amoniakkal, aseton, silika gel, serbuk Mg, NaOH dan H 2 SO 4 pekat. 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode penelitian eksperimental dengan tahapan kerja sebagai berikut : 1. Pengolahan dan penetapan sampel penelitian 2. Ekstraksi dan fraksinasi 3. Uji fitokimia 4. Pemisahan dan pemurnian 5. Uji Kemurnian 6. Karakterisasi Isolat 7. Uji Antioksidan 23
3.3.1 Penyiapan Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah manggis. Kulit buah manggis dicuci sampai bersih kemudian dipotong kecil-kecil dan diangin-anginkan di udara terbuka yang terlindung dari sinar matahari secara langsung selama 3 hari kemudian dihaluskan dengan cara diblender sampai berbentuk serbuk. 3.3.2 Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel berupa serbuk halus dari kulit buah manggis sebanyak 500 gram diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan metanol. Maserasi dilakukan selama 3 kali 24 jam, dimana setiap 24 jam ekstrak disaring, dan dimaserasi lagi dengan metanol yang baru. Ekstrak disatukan, sehingga diperoleh filtrat metanol. Filtrat metanol dievaporasi pada suhu 30-40 o C dengan menggunakan penguap vakum, diperoleh ekstrak kental metanol. Ekstrak kental metanol disuspensi dengan metanol:air (1:2) dan dipartisi dengan menggunakan pelarut n-heksan, menghasilkan fraksi n-heksan. Fraksi n- heksan dievaporasi diperoleh ekstrak n-heksan. Fraksi air dipartisi dengan etil asetat sehingga diperoleh fraksi air dan fraksi etil asetat. Hasil partisi dari fraksifraksi tersebut dievaporasi pada suhu 30-40 o C sampai diperoleh ekstrak air dan etilasetat. Selanjutnya ekstrak yang diperoleh diuji fitokimia. 3.3.3 Uji Fitokimia Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung dalam sampel kulit buah manggis. Kulit buah manggis diuji fitokimia untuk melihat kandungan senyawa metabolit sekunder. Uji fitokimia meliputi uji flavonoid, uji alkaloid, uji steroid, uji terpenoid dan uji saponin. 3.3.3.1 Uji Flavonoid Ekstrak kental metanol sebanyak 0,1 gram dilarutkan dengan menggunakan 10 ml metanol dan hasilnya dibagi menjadi 4 tabung reaksi. Tabung pertama sebagai kontrol, tabung kedua ditambahkan H 2 SO 4 2 N, tabung ketiga ditambahkan serbuk Mg-HCl, dan tabung keempat ditambahkan NaOH pekat, jika ada perubahan warna menunjukkan (+) adanya flavonoid. 24
3.3.3.2 Uji Alkaloid 0,1 gram ekstrak metanol dilarutkan dengan 10 ml kloroform amoniakal dan hasilnya dibagi dalam dua tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan dengan asam sulfat (H 2 SO 4 ) 2 N. Lapisan asam dipisahkan, dibagi dalam dua tabung reaksi masing-masing tabung dilakukan pengujian dengan menggunakan pengujian dengan pereaksi Mayer dan Wagner. Tabung kedua dilakukan pengujian dengan pereaksi Hager, jika terbentuk endapan maka sampel tersebut positif (+) alkaloid. 3.3.3.3 Uji Steroid, Terpenoid dan Saponin Ekstrak kental metanol sebanyak 0,1 gram dilarutkan dengan 10 ml dietil eter. Ekstrak yang larut dalam dietil eter ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan ditambahkan 1 tetes H 2 SO 4 pekat. Jika terbentuk warna kebiruan, menunjukkan positif (+) adanya steroid, sedangkan warna merah kecoklatan menunjukkan positif (+) adanya terpenoid. Sisa yang tidak larut dalam dietil eter ditambah sedikit aquades panas, jika terbentuk busa/buih yang cukup stabil (15 menit) setelah ditambahkan aquades panas, menunjukan adanya saponin. Filtrat di bawah busa diambil dan ditempatkan dalam cawan penguap, ditambahkan dengan HCl dan diuapkan dalam penangas air sampai kering. Sampai terbentuk kerak, kerak yang terbentuk ditambah dietil eter dan diteteskan pada plat tetes, ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H 2 SO 4 jika terbentuk warna hijau kebiruan menunjukkan adanya positif (+) steroid, warna merah kecoklatan menunjukkan positif (+) adanya terpenoid dan jika terbentuk busa/buih menunjukkan positif (+) adanya saponin. 3.3.4 Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak metanol yang telah diuji fitokimia dianalisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk melihat berapa senyawa dalam sampel. Ekstrak metanol sebanyak 10 gram dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel GF 60 dan dielusi dengan eluen yang berbeda. Semua fraksi hasil pemisahan kromatografi kolom dianalisis dengan kromatografi lapis tipis untuk melihat pola noda yang sama untuk digabung. Isolat hasil kromatografi lapis tipis 25
yang memiliki faktor retensi (Rf) yang sama digabung dan diuapkan, serta diuji fitokimia. 3.3.5 Uji Kemurnian Isolat dari ekstrak metanol hasil kromatografi kolom diuji kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis menggunakan beberapa macam eluen. Jika isolat tetap menunjukkan pola noda runggal, maka dapat dikatakan isolat sudah murni. 3.3.6 Karakterisasi Isolat Isolat murni yang didapatkan kemudian diidentifikasi dengan spektrofotometer IR untuk mengetahui senyawa flavonoid yang terkandung dalam kulit buah manggis. 3.3.7 Aktivitas Antioksidan 3.3.7.1 Uji DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH atau dengan perendaman radikal bebas 1,1-diphenil-2-pikrihidrazil. Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat dan mudah untuk penapisan aktivitas penangkapan radikal beberapa senyawa, selain itu metode ini terbukti akurat, efektif dan praktis (Molyneux, 2003). DDPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) merupakan senyawa radikal bebas stabil. DPPH digunakan secara luas untuk menguji kemampuan senyawa untuk bereaksi sebagai penghambat radikal bebas atau donor hidrogen. DPPH akan bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH-2 tereduksi. DPPH tereduksi tidak memiliki absorpsi maksimum pada kisaran panjang gelombang sinar tampak, sedangkan DPPH itu sendiri berwarna ungu. Oleh karena itu, semakin kuat suatu senyawa dapat mendonorkan atom hidrogen maka semakin pudar warna ungu yang dihasilkan (Yulia, 2007). Uji DPPH pada penelitian ini menggunakan standar asam aksorbat. Dengan demikian satuan pengukuran dinyatakan sebagai AEAC (Ascobic Acid Equivalent Antioksidan Capacity). Pengujian larutan standar (asam aksorbat) yaitu : Larutan standar (asam aksorbat) dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu 25ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm dan 400ppm. Masing-masing konsentrasi 26
diambil 2,5 ml direaksikan dengan DPPH 2,5 mm dalam tabung reaksi. Campuran ini diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Diukur absorbansinya dengan menggunakan UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Pengujian larutan blanko (DPPH) yaitu : Larutan blanko (DPPH) 0,5 ml ditambahkan dengan metanol 4,5 ml. Diukur absorbansinya dengan menggunakan UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Pengujian antioksidan dari berbagai fraksi yaitu : Ekstrak dari berbagai fraksi dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, dan 400 ppm. Masing-masing konsentrasi diambil 4,5 ml direaksikan dengan DPPH 1Mm dalam tabung reaksi. Campuran ini diinkubasi pada 37 o C selama 30 menit. Diukur absorbansinya dengan menggunakan UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Kapasitas antioksidan (%inhibisi) untuk menghambat radikal bebas menurut Andayani dkk. (2008) ditentukan dengan persamaan : Keterangan : Abs. Kontrol = nilai serapan (Abs) larutan kontrol pada panjang gelombang 514 nm. Abs. Sampel = nilai serapan (Abs) larutan uji atau larutan pembanding pada panjang gelombang 514 nm. Nilai persen inhibisi yang diperoleh kemudian dibuat kurva terhadap konsentrasi larutan uji atau pembanding (µg/ml). Selanjutnya dari kurva ini dibuat regresi linier sehingga diperoleh persamaan (y=bx+a). 3.3.7.2 Metode IC 50 Nilai IC 50 sebagai parameter aktivitas antioksidan dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dengan memasukkan nilai 50% pada y, sehingga diketahui nilai konsentrasi efektifnya. Nilai IC 50 larutan uji dan larutan pembanding ditentukan dari persamaan yang diperoleh dari kurva masing-masing. 27