BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Bagian Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor pada bulan April-November 2011. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah larutan NaCl fisiologis (0,9%), Normal Buffered Formaldehide (NBF), akuades, dan ekstrak tempe. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah kandang tikus berpenutup kawat kasa, timbangan Triple Beam Balance, penggaris, gelas objek, cotton bud, mikroskop, spuit 3 ml, seperangkat sonde lambung, timbangan analitik, kertas saring, peralatan bedah (alas, pisau, pinset, gunting), dan tisu. Materi Penelitian A. Hewan Coba Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah tikus Rattus norvegicus galur Sprague Dawley betina berumur 16 minggu pada awal penelitian dan tikus jantan yang juga berumur 16 minggu untuk mengawini. Tikus dipelihara di Fasilitas Hewan Coba, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Kandang yang digunakan dalam penelitian berukuran 30 x 20 x 12 cm, berbahan dasar plastik, dan berpenutup kawat kasa pada bagian atasnya. Setiap kandang dialasi oleh sekam yang diganti secara periodik. Pakan dan air minum tikus diberikan ad libitum. Tikus bunting didapatkan melalui perkawinan alamiah antara tikus jantan dan tikus betina dengan perbandingan jantan dan betina sebesar 1:2. Tikus-tikus tersebut ditempatkan dalam satu kandang. Setiap pagi, dilakukan ulas vagina pada masing-masing tikus betina yang telah dikawinkan. Preparat ulas vagina kemudian diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 kali. Bila pada preparat ulas vagina tersebut ditemukan sel-sel sperma maka tikus betina telah
22 melakukan perkawinan dan pada umumnya dinyatakan bunting hari pertama (H1). Tikus betina yang telah dinyatakan bunting dikandangkan secara individu. B. Fitoestrogen Sumber fitoestrogen yang digunakan dalam penelitian berasal dari tempe yang diekstrak oleh ethanol 70% di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro). Setiap 100 gram ekstrak tempe mengandung 87.55 mg isoflavon yang terdiri dari 83.30 mg daidzein dan 4.25 mg genestein (hasil analisis Laboratorium Pengujian - Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian - Kementrian Pertanian). Metode Penelitian A. Pengelompokan Hewan Coba Sebanyak 12 ekor tikus betina bunting dibagi ke dalam empat kelompok percobaan yang masing-masing kelompok berjumlah tiga ekor yaitu: 1) kelompok K merupakan kelompok kontrol, adalah hewan yang tidak diberi ekstrak tempe, 2) kelompok A adalah kelompok hewan yang dicekok ekstrak tempe pada usia awal kebuntingan (H2 sampai H11), 3) kelompok B adalah kelompok hewan yang dicekok ekstrak tempe pada akhir kebuntingan (H12 sampai H21), dan 4) kelompok C adalah kelompok hewan yang diberi ekstrak tempe pada masa laktasi (P2 sampai P11). Ekstrak tempe dengan dosis 4.72 gr/kgbb dilarutkan terlebih dahulu dalam 4 ml akuades dan diberikan secara force feeding dengan sonde lambung. Pemberian ekstrak tempe pada setiap tikus bunting dilakukan setiap hari selama 10 hari dan dilaksanakan setiap sore hari. B. Pelaksanaan Penelitian Tikus-tikus betina bunting pada masing-masing kelompok dibiarkan melahirkan secara alami. Anak tikus yang dilahirkan dibiarkan menyusu pada induknya. Anak tikus yang berjenis kelamin betina tersebut merupakan objek penelitian. Penentuan jenis kelamin anak tikus dilihat dari jarak celah anogenitalnya. Tikus betina memiliki jarak celah anogenital yang lebih pendek dibandingkan dengan tikus jantan. Saat tikus-tikus tersebut melahirkan, lama kebuntingan dan jumlah anak dalam sekali melahirkan dihitung. Pada hari kedua kelahiran, bobot anak
23 ditimbang untuk menyatakan rataan bobot lahir. Pada hari ke-15 dan ke-21 setelah kelahiran dilakukan penimbangan bobot badan masing-masing anak dan pengukuran jarak celah anogenital. Penimbangan bobot badan dilakukan dengan menggunakan timbangan Triple Beam Balance dan pengukuran celah anogenital dilakukan dengan menggunakan penggaris. Penetapan usia pubertas pada anak betina dilakukan dengan melihat hadirnya Vaginal Opening (VO = pembukaan vagina) (Zhou et al. 2007). VO diamati sejak anak betina tersebut berusia 18 hari. Pada saat anak berusia 28 dan 42 hari dilakukan penimbangan bobot badan dengan menggunakan timbangan Triple Beam Balance dan kemudian dinekropsi untuk diambil ovarium, uterus, dan vaginanya. Anak betina tersebut ditidurkan dengan menggunakan eter. Organ ovarium dan uterus-vagina didapatkan dengan menggunakan peralatan bedah. Bobot basah ovarium dan uterus-vagina ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik dan dinyatakan dalam satuan gram. Diagram bagan penelitian disajikan pada Gambar 5. Parameter yang Diambil dan Teknik Pengukurannya A. Kinerja Induk 1. Lama Kebuntingan Lama kebuntingan dihitung sejak ditemukannya sel sperma pada preparat ulasan vagina sampai induk betina tersebut melahirkan dengan satuan hari. 2. Jumlah Anak dalam Sekali Melahirkan dan Bobot Badan Anak Jumlah anak dalam sekali melahirkan dari setiap induk dihitung melalui jumlah total anak pada hari pertama kelahiran. Bobot anak dihitung pada hari kedua setelah partus. B. Kinerja Reproduksi Anak Betina 1. Jarak Anogenital Jarak anogenital pada anak didapatkan dengan mengukur jarak celah yang dibentuk oleh anus dan alat genital dalam skala sentimeter pada usia 15 dan 21 hari.
24 2. Usia Pubertas Pubertas pada tikus betina ditandai dengan hadirnya Vaginal Opening (VO). Pemeriksaan pubertas dilakukan setiap hari sejak umur anak 18 hari sampai didapatkan VO. 3. Bobot Badan, Bobot Ovarium dan Bobot Uterus-Vagina Bobot badan, bobot ovarium, dan bobot uterus-vagina ditimbang pada saat anak berusia 28 dan 42 hari dan dinyatakan dalam satuan gram. Bobot badan diukur dengan menggunakan timbangan Triple Beam Balance. Bobot ovarium dan bobot uterus-vagina yang diukur dengan menggunakan timbangan analitik merupakan bobot basah organ. Bobot basah didapat melalui pengkuran segera setelah organ dikeluarkan dari tubuh. Analisis Statistik Hasil parameter yang telah diukur dinyatakan dalan rataan ± simpangan baku. Perbedaan antar kelompok perlakuan diuji secara statistika melalui analisa sidik ragam (ANOVA) dengan pola rancangan acak lengkap dan dilanjutkan dengan pengujian Duncan pada selang kepercayaan 95% (α=0.05) (Steel & Torrie 1991).
Gambar 5 Diagram bagan penelitian. 25