13 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Pengambilan sampel daging ayam dan daging sapi berasal dari pasar tradisional di 12 kabupaten/kota di Provinsi Jawa Barat (Tabel 1). Penelitian ini berlangsung dari bulan September sampai dengan Oktober 2009. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian adalah penangas air, autoklaf, lemari pendingin, freezer, timbangan analitik, inkubator 35 C 37 C, ose, pinset, gunting, scapel, cawan petri 100 x 12 mm, tabung reaksi 20 ml, pipet volumetrik 1 ml, tabung Durham, tube shaker (pengocok tabung), plastik bening, spidol, label, cool box, stomacher, dan tabung erlenmeyer. Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sampel daging ayam dan daging sapi, Plate Count Agar (PCA) (Acumedia Standard Methods Agar 7157A), Vogel Johnson Agar (VJA), media cair Lauryl sulfate tryptose broth (Pronadisa Cat.1310.00), Levine s eosine methylene blue agar (LEMB agar) (Oxoid CM 0069 B), Buffered Peptone Water (BPW) 0.1% (Pronadisa Cat.1402.00), Koser s citrate medium tryptone broth (Oxoid CM 0087 B), Methyl Red Voges-Proskauer broth (MRVP) (Oxoid CM 0043 B), dan Nutrien Agar (NA) (Oxoid CM 0003 B). Jumlah Sampel Jumlah sampel ditentukan secara purposif di pasar dari setiap kabupaten/kota, yaitu masing-masing dua sampel daging sapi dan tiga sampel daging ayam dari setiap kabupaten/kota. Rasio pengambilan sampel daging ayam dan sapi disesuaikan dengan rasio tingkat konsumsi daging tersebut pada masyarakat Provinsi Jawa Barat. Jumlah keseluruhan sampel yang diperiksa sebanyak 60 sampel daging, yang terdiri dari 24 sampel daging sapi dan 36
14 sampel daging ayam (Tabel 1). Setiap sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik steril, kemudian kantong plastik diberi label dan disimpan dalam cool box berisi es. Sampel diuji maksimum 24 jam setelah pengambilan. Tabel 1 Lokasi dan jumlah sampel daging sapi dan daging ayam yang diambil di Provinsi Jawa Barat No Kabupaten/Kota Daging sapi Daging ayam Jumlah total 1. Kota Bekasi 2 3 5 2. Kabupaten Purwakarta 2 3 5 3. Kabupaten Bogor 2 3 5 4. Kota Bogor 2 3 5 5. Kota Sukabumi 2 3 5 6. Kabupaten Bandung 2 3 5 7. Kota Bandung 2 3 5 8. Kabupaten Cianjur 2 3 5 9. Kabupaten Sumedang 2 3 5 10 Kabupaten Tasikmalaya 2 3 5 11. Kota Cirebon 2 3 5 12. Kabupaten Indramayu 2 3 5 24 36 60 Prosedur Pengujian Pengujian Jumlah Total Mikroorganisme dan Staphylococcus aureus dengan Metode Total Plate Count (TPC) Pengujian TPC dan S. aureus pada daging ayam dan daging sapi dilakukan dengan metode menurut Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food (Andrew et al. 2001). 1. Persiapan sampel Sampel sebanyak 25 gram ditimbang secara aseptis, dan ditambahkan 225 ml larutan BPW 0.1%, kemudian dihaluskan/diblender sampai halus menggunakan stomacher.
15 2. Pengenceran Pengenceran yang digunakan pada analisis TPC dan S. aureus adalah pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. 3. Pour Plating Masing-masing pengenceran dipipet 1 ml ke dalam cawan petri steril yang telah diberi label sebelumnya (sesuai dengan angka pengenceran). Media Plate Count Agar (PCA) untuk pengujian TPC dan media Vogel Johnson Agar (VJA) untuk penghitungan S. aureus, dituangkan ke dalam masingmasing cawan petri sebanyak 10-15 ml, lalu dihomogenkan dengan cara digeser-geser di meja membentuk angka 8 beberapa kali supaya media merata ke seluruh permukaan dan dibiarkan memadat. Cawan petri kemudian dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik. 4. Inkubasi Pengujian Metode Total Plate Count (TPC) Inkubasi cawan petri dilakukan dengan posisi terbalik pada suhu 35 o C selama 24 jam ± 2 jam. Pengujian Staphylococcus aureus Inkubasi cawan petri dilakukan dengan posisi terbalik pada suhu 35 sampai 37 o C selama 45-48 jam. 5. Pembacaan/perhitungan Pengujian Metode Total Plate Count (TPC) Penghitungan dilakukan pada semua koloni dalam cawan petri yang berisi 25-250. Pengujian Staphylococcus aureus Koloni khas S. aureus pada agar VJA yaitu bulat, licin/halus, konveks, basah, berwarna abu-abu sampai hitam pekat dengan dikelilingi oleh zona opak (opaque zone).
16 Gambar 1 Koloni S. aureus pada media VJA. Pengujian Most Probable Number (MPN) Escherichia coli Pengujian MPN Escherichia coli padaa daging ayam dan daging sapi dilakukan dengan metode menurut Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food (Andrew et al. 2001). a. Uji Presumtif Koliform 1. Tabung reaksi berisi media cair steril pada rak tabung (3 tabung setiap tingkat pengenceran). Pengenceran yang dilakukan sama dengan pengenceran pada metode TPC dan S. aureus. 2. Setiap tingkatt pengenceran (pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5 ) diinokulasikan ke dalam tiga tabung berisi media cair steril. Rasio volume contoh dan volume media yang biasa digunakan adalah 1:10 (1 bagian contoh dimasukkan ke dalam 10 bagian media). Larutan contoh dari setiap pengenceran dimasukkan ke dalam tiga tabung berisi 10 ml lauryl sulfate broth steril yang dilengkapi dengan tabung Durham. 3. Tabung-tabungg tersebut kemudian diinkubasikan pada suhu 35 o C selama 48± ±2 jam. Tabung yang menunjukkann hasil positif (keruh dan terdapat gas) diambil untuk dilakukan uji lanjutan konfirmasi koliform. b. Uji Konfirmasi Koliform 1. Setiap tabung positif dari pengujian presumtif koliform dipindahkan satu ose penuh ke dalam tabung berisi 10 ml briliant green lactose bile broth steril yang dilengkapi dengan tabung durham. 2. Tabung-tabungg tersebut diinkubasi pada suhu 35 o C selama 48±2 jam. Tabung yang menunjukkan n hasil positif (keruh dan terdapat gas) diambil untuk dilakukan uji lanjutann konfirmasii koliform fekal.
17 c. Uji Konfirmasi Koliform fekal 1. Setiap tabung positif dari pengujian presumtif koliform dipindahkan satu ose penuh ke dalam tabung berisi 10 ml EC broth steril yang dilengkapi dengan tabung durham. 2. Tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 35 o C selama 48±2 jam. Tabung yang menunjukkan hasil positif (keruh dan terdapat gas) diambil untuk dilakukan uji lanjutan konfirmasi Escherichia coli. Gambar 2 Tabung yang menunjukkan hasil positif (keruh dan terdapat gas) pada EC broth. d. Uji Konfirmasi Escherichia coli 1. Setiap tabung EC broth yang positif dari pengujian konfirmasi koliform fekal diambil satu ose penuh kemudian digoreskan pada Levine s eosine methylene blue agar dan diinkubasi selama 24±2 jam pada suhu 35 o C. 2. Dua koloni spesifik E. coli (bulat, berwarna gelap di bagian tengah, dengan atau tanpa kilauan hijau) diambil dari setiap cawan petri, dengan menyentuhkan ujung ose di bagian tengah koloni dan digoreskan pada agar miring PCA. Agar miring diinkubasi pada suhu 35 o C selama 18-24 jam, dan dilanjutkan pada pengujian IMViC, pembentukan gas (dengan lauryl sulfate tryptose broth), dan pewarnaan gram. 3. Ditentukan hasil yang positif setelah dilakukan pengujian IMViC, pembentukan gas (dengan lauryl sulfate tryptose broth), dan pewarnaan gram kemudian ditentukan hasil yang positif. Hasil yang menunjukkan bakteri kokus atau kokoid, gram negatif, membentuk gas dari fermentasi laktosa, dan mempunyai pola + + - - atau - + - - pada uji IMViC dinyatakan sebagai E. coli kemudian dihitung MPN E. coli per ml/gram.