METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini berlangsung selama 9 bulan, mulai April 2009 hingga Desember 2009 bertempat di Laboratorium SEAFAST IPB. Penelitian dilakukan dengan 2 kali ulangan. Bahan dan Alat Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah NDRPO yang diperoleh dari SEAFAST CENTER. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah bahan kima yang dibutuhkan dalam analisa kadar tokoferol, kadar total β- karotena, kadar air, komposisi asam lemak, asam lemak bebas, uji nilai peroksida, TBA, dan kadar dien terkonjugasi. Alat-alat yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah gas kromatografi, spektrofotometer uv-vis, inkubator, dan alat-alat lainnya yang dibutuhkan dalam analisa kadar kadar tokoferol, kadar total karotena, kadar air, asam lemak bebas, komposisi asam lemak, uji nilai peroksida, TBA, dan kadar dien terkonjugasi. Metode Penelitian Metode percobaan terdiri atas tiga tahap yang tersaji dalam Gambar 10 yaitu tahap pertama dilakukan karakterisasi NDRPO. Produk NDRPO dikaraktersisasi sifat-sifat kimianya dengan analisa kadar tokoferol, kadar β-karotena, kadar air, komposisi asam lemak, asam lemak bebas, uji nilai peroksida, TBA, dan kadar dien terkonjugasi. Pada tahap kedua dilakukan oksidasi pada NDRPO menggunakan panas pada suhu 60, 75, 90 o C. Suhu oksidasi dipilih lebih tinggi dari 60 o C karena kerusakan β-karotene mulai signifikan pada suhu lebih dari 60 o C (Muchtadi 1992). Kemudian diambil contoh untuk dilakukan karakterisasi. Karakterisasi yang dilakukan meliputi komposisi asam lemak, asam lemak bebas, bilangan
31 peroksida, dan kadar β-karotena. Dari uji asam lemak bebas dapat diketahui asam lemak yang terputus dari rantai gliserolnya. Dari uji nilai peroksida dapat diketahui perubahan jumlah peroksida selama oksidasi. Setelah didapatkan data model kinetika oksidasi NDRPO, dilakukan tahap ketiga yaitu analisa model hubungannya, sehingga didapatkan karakteristik oksidasi NDRPO. NDRPO Karakterisasi NDRPO Karakteristik NDRPO bahan baku Oksidasi dan karakterisasi selama oksidasi, dan analisa model kinetika stabilitas oksidasi Model kinetika stabilitas oksidasi NDRPO Analisa hubungan antara parameter oksidasi Karakteristik Stabilitas Oksidasi NDRPO Gambar 10 Alur metode penelitian Analisa kimiawi Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah: 1. Analisa kadar air dan bahan mudah menguap metode modifikasi (AOCS Official Method Ca 2f-93) Mula-mula contoh ditimbang 15-25 gram contoh ke dalam labu dengan stirrer yang telah ditare, bila contoh tidak cair, harus dipanaskan, tidak melebihi 10 o C dari titik lelehnya. Kemudian ditambahkan aseton 5 ml. labu ditutup dan diletakkan dalam gliserol, yang dipanaskan dengan hot plate. Dengan pengadukan
32 yang berkelanjutan, tabung divakum, kemudian dipanaskan maksimum 100 o C, kemudian dipertahankan pada suhu 100 o C selama 20 menit. Labu dipindahkan dari gliserol, kemudian didinginkan hingga suhu ruang dalam water bath, setelah melepaskan vakumnya, labu dikeringkan, diletakkan dalam desikator selama beberapa menit dan ditimbang Kehilangan berat, g Kadar air dan bahan mudah menguap, %= 100 berat contoh, g 2. Analisa total tokoferol metode spektrofotometri (Wong 1988) Mula-mula ditimbang 200±10 mg contoh kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml. Selanjutnya ditambahkan toluena 5 ml, 3.5 ml 2,2 bipiridin (0.07% w/v dalam etanol 95%), 0.5 ml FeCl 3 (0.2% w/v dalam etanol), 1 ml etanol lalu didiamkan selama 1 menit dan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Konsentrasi total tokoferol dihitung dengan membandingkan serapan contoh dengan serapan standar. 3. Penentuan kadar β-karotena metode spektrofotometri (PORIM 1995) Sebanyak 0.1 gram contoh dilarutkan dengan heksan dalam labu ukur 25 ml sampai tanda tera, lalu dikocok hingga benar-benar homogen. Selanjutnya serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 446 nm. Total β- karotena dihitung menggunakan rumus : Kadar β-karotena = 25 x absorbansi x 383 100 x berat sampel(g) 4. Analisa komposisi asam lemak dengan gas kromatografi (AOCS Official Method Ce 1-62) Contoh yang akan akan dianalisa asam lemaknya ditimbang dalam tabung reaksi tertutup, kemudian ditambahkan larutan standar internal (asam margarat, C17) sebanyak 1 mg. kemudian ditambahkan 2 ml NaOH dalam metanol 0.5N dan dihembuskan gas N 2 untuk mencegah oksidasi lemak. Tabung reaksi dipanaskan selama 15 menit dalam waterbath dengan suhu 80 o C dan didinginkan. Kemudian ditambahkan BF 3 metanol 14% sebanyak 22 ml dan dihembuskan
33 denan gas N 2, dipanaskan kembali 15 menit pada suhu 50 o C. selanjutnya ditambahkan 1 ml n-heksan, dihembuskan dengan N 2 dan divortek. Selanjutnya ditambahkan NaCl jenuh sebanyak 3 ml dan divortek. Kemudian dibiarkan hingga terpisah menjadi dua fase. Lapisan atas diambil (asam lemak dalam heksan) dan disaring dengan Na 2 SO 4 anhydrous dan ditampung dalam vial. Metil ester siap disuntikkan pada gas kromatografi. Sebelum dilakukan penyuntikan, gas kromatografi di konsisikan terlebih dahulu. Suhu injector diatur pada suhu 225 o C, suhu detektor 225 o C, dan suhu kolom 100 o C dengan tekanan gas helium 1 kg/cm 2. Detector dinyalakan dengan tekanan udara dan tekanan hidrogen masing-masing 0.5 kg/cm 2. Suhu diprogram pada 120 o C selama 6 menit kemudian dinaikkan secara gradient linier dengankecepatan kenaikan suhu 3 o C/ menit sehingga suhu mencapai 230 o C dan ditahan selama 20 menit. Contoh disuntikkan sebanyak 1 μl dengan tehnik split pada rasio 1:30. Pengkondisian selesai saat base line yang terbentuk lurus, tanpa terbentuk peak-peak tertentu. Selanjutnya disuntikkan standar eksternal FAME Mix C8-C22 dan contoh yang akan dianalisa. Kromatogram yang diperoleh dari hasil analisa asam- asam lemak diidentifikasi dengan membandingkan dengan kromatogram standar eksternal. Kemudian dihitung respon faktor dari setiap asam lemak pada standar eksternal dengan rumus: Asam lemak pada contoh dihitung dengan rumus: Area AL mg C17 RF Kadar asam lemak (mg AL / g contoh) = area C g contoh 17 5. Analisa bilangan peroksida metode asam asetat-chloroform (AOCS Official method Cd 8-53) Ditimbang contoh kedalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 30 ml asam asetat-kloroform (3:2), digoyang hingga larut, kemudian ditambahkan 0.5 ml KI jenuh, dibiarkan dengan penggoyangan selama 1 menit tepat, kemudian segera
34 ditambahkan 30 ml aquadest. Selanjutnya dititrasi dengan sodium tiosulfat 0.1 N. titrasi dilanjutkan hingga warna iod kuning hampir hilang. Kemudian ditambahkan 2 ml indikator pati, titrasi dilanjutkan hingga warna biru baru hilang. Dilakukan titrasi dengan blanko. Titrasi blanko tidak boleh melebihi 0.1 ml dari 0.1N larutan sodium tiosulfat. Kemudian dihitung dengan cara PV= B= ml titrasi blanko S= ml titrasi contoh N=normalitas sodium tiosulfat Bila titrasi membutuhkan kurang dari 0.5 ml dengan 0.1N sodium tiosulfat, maka digunakan 0.01N sodium tiosulfat 6. Analisa TBA metode langsung dengan spektrofotometer (AOCS Official method Cd 19-90) Uji TBA yang dilakukan menggunakan metode langsung (direct method). Metode ini dapat dilakukan untuk menentukan kandungan TBARS (TBA Reactive Substances) dalam lemak dan minyak tanpa isolasi awal dari produk oksidasi sekunder. Metode ini dapat digunakan bagi minyak dan lemak nabati dan hewani, termasuk sam lemak, ester glikol dan ester parsial. Bahan dan alat yang digunakan dalam uji ini adalah contoh, 1-Butanol (kadar air <0.5%), ACS kualitas spektrofotometrik, 0.2% (w/v) 2-asam thiobarbiturat (TBA) dalam 1-butanol, kemudian disonifikasi untuk melarutkan TBA dan disimpan paling lama 1 minggu pada suhu 4 o C; 0.2mM TMP dalam 1- butanol, 25 ml labu ukur, tabung reaksi dengan tutup ulir, dan waterbath 95 o C. Prosedur uji TBA dimulai dengan persiapan contoh, mula-mula contoh ditimbang dengan akurat (kemudian dicatat) 50-200 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. lalu dilarutkan ke dalam sedikit 1-butanol, kemudian labu dipenuhi dengan 1-butanol sampai batas tera. Dicampur dengan baik. Bila tersedia ultrasonik waterbath, labu dapat disonik untuk menghasilkan campuran yang sempurna. Proses ini perlu diperharikan karena paparan 1-butanol dapat menyebabkan sakit kepala dan berkunang-kunang, sehingga uji disarankan dilakukan di dalam ruang asam.
35 Setelah contoh siap reaksi TBA dapat dilakukan mula-mula 5.0 ml contoh dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup yang kering. Ditambahkan 50 ml 0.2% TBA dalam 1 butanol dan tabung ditutup. Disiapkan juga blanko (5 ml 1-butanol dan 5 ml 0.2% TBA) pada waktu yang sama. Sebagai catatan bahwa contoh harus disiapkan duplo. Kemudian contoh divortek dan diinkubasi selama 2 jam dalam waterbath 95 o C. Setelah selesai tabung diambil dari waterbath dan didinginkan di bawah air mengalir selama 10 menit (sampai mencapai suhu ruang). Kemudian spektrofotometer dihidupkan dan diset panjang gelombang pada 532 nm. Spektrofotometer dipanaskan minimum selama 30 menit sebelum dilakukan pembacaan. Spektrofotometer dinolkan dengan blanko kemudian diukur serapannya menggunakan kuvet. Bila A 532 dari contoh >1, harus digunakan contoh yang lebih sedikit, atau dilakukan pengenceran dan uji diulangi. Nilai TBA dapat dihitung dengan metode AOCS, dengan mengekspresikan hasil sebagai peningkatan penyerapan pada panjang gelombang 532 nm karena reaksi contoh 1 mg eqivalent per 1 ml volume dengan TBA. Nilai TBA dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Nilai TBA = (50 x A 532 )/m Faktor 50 berdasar pada volume 25 ml dari labu ukur dan panjang kuvet 1 cm. A532 adalah penyerapan contoh (yang telah dikoreksi menggunakan blanko). m adalah berat (mg) dari contoh. 7. Analisa jumlah asam lemak bebas (ALB) metode spektrofotometri (Lowry dan Tinsley, 1975) Contoh sebanyak 0.0693 g ditimbang, kemudian ditambahkan benzena 5 ml, kemudian divorteks selama 30 detik. Selanjutnya ditambahkan 1 ml larutan kupri asetat piridin 5% (ph 6.0-6.2). Campuran divorteks kembali. Setelah didiamkan akan terbentuk dua lapisan terpisah. Lapisan atas diambil untuk dilakukan pengukuran pada panjang gelombang 715 nm. Kurva standard dibuat dengan asam palmitat.
36 8. Analisa dien terkonjugasi metode penyerapan UV (Wrolstad et al. 2005) Uji ini dilakukan untuk mengetahui pembentukan dien terkonjugasi (CD) selama oksidasi minyak. Uji ini dilakukan dengan mengukur perubahan penyerapan UV. Peningkatan penyerapan menadakan adanya oksidasi. Dua metode yang digunakan untuk mengungkapkan hasil pengukuran ini dijelaskan sebagai nilai CD, dinyatakan dalam µmol CD/g contoh, dan sebagai nilai extinction CD. Bahan dan alat yang digunakan dalam uji ini adalah contoh, 2,2,4- trimetilpentana (isooctana), ACS spectrophotometric grade (contoh Fisher Scientific), labu ukur 25 ml, spektrofotometer dengan lampu UV, kuvet quartz, dengan panjang jalur 1.00±0.01-cm. Untuk melakukan uji dien terkonjugasi mula-mula contoh sebanyak 0.01-0.03 ditimbang dengan akurat (dan dicatat) kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Sebagai catatan bahwa setiap contoh harus diuji minimal duplo. Contoh kemudian dilarutkan dalam 2.2.4-trimetilpentana hingga batas tera. Lalu larutan dicampur hingga homogen. Untuk membantu pelarutan contoh dapat dilakukan dengan bantuan ultrasonic bath. Selanjutnya spektrofotometer dihidupkan dengan panjang gelombang 233 nm untuk pengukuran CD. Alat tersebut dipanaskan 30 menit sebelum digunakan untuk pembacaan. Lalu spektrofotometer dikalibrasi dengan larutan blanko (2,2,4-trimetilpentana) menggunakan kuvet quartz. Serapan minyak terlarut diukur menggunakan kuvet quartz, bila A233 contoh >1, contoh harus dilarutkan lagi dengan pelarut yang sama dan diukur lagi. Nilai CD dihitung menggunakan persamaan berikut A c CD = ( 233 ε ) [ccd x(2.5 10 nilai CD= W 4 )] c CD = konsentrasi CD dalam mmol/ml (konsentrasi molar), A 233 = adalah penyerapan larutan lemak pada panjang gelombang 233nm, ε = penyerapan molar (koefisien eksitasi) dari asam linoleik hidroperoksida (2.525x10 4 M -1.cm -1 )
37 l=panjang jalur kuvet dalam cm (1 cm) 2.5x10 4 = faktor yang menyebabkan 2,2,4-trimetilpentana (25 ml) yang digunakan untuk melarutkan contoh seperti sebuah pengubah satuan (1000 µmol/mmol) sehingga CD dapat dinyatakan dalam µmol W= berat contoh dalam g Analisa data Untuk mengetahui model dan karakteristik perubahan parameter yang digunakan dilakukan analisa data dengan cara: 1. Analisa Model Perubahan Parameter Oksidasi Perubahan parameter oksidasi seperti jumlah β-karotena, asam lemak bebas, komposisi asam lemak dibuat modelnya menggunakan persamaan Arrhenius dengan software Microsoft Excel 2007. Mula-mula data perubahan parameter oksidasi NDRPO yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai konstanta kecepatan reaksi. Kemudian dari tiga pasang nilai konstanta kecepatan reaksisuhu tersebut dibangun persamaan Arrhenius. Untuk membuat persamaan Arrhenius dang mengetahui nilai Ea suatu reaksi dibutuhkan minimal dua set nilai konstanta kecepatan (k) dan suhu (T) (Keii 2004). Perubahan bilangan peroksida dibuat modelnya menggunakan persamaan Aragao et al. (2008). 2. Analisa Korelasi Perubahan Antar Parameter Oksidasi Analisa korelasi perubahan antar parameter oksidasi dilakukan dengan analisa korelasi Pearson menggunakan software SPSS 17. 3. Principal Componen Analysis (PCA) Parameter Oksidasi (Mazlum et al 1999) PCA dilakukan untuk mengetahui parameter mana yang lebih berpengaruh dalam oksidasi NDRPO dilakukan dengan analisa Faktorial PCA dengan rotasi varimax menggunakan software SPSS 17.