UJI TOKSISITAS EKSTRAK ETANOL. DAUN DANDANG GENDIS (Clinacanthus nutans) DENGAN MENGGUNAKAN METODE BST (Brine Shrimp Lethality Test)

Transkripsi

1 UJI TOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN DANDANG GENDIS (Clinacanthus nutans) DENGAN MENGGUNAKAN METODE BST (Brine Shrimp Lethality Test) KARYA TULIS ILMIAH OLEH NADIA PUTRI AYUNINGTYAS NIM AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG AGUSTUS 2012

2 UJI TOKSISITAS EKSTRAK ETANOL DAUN DANDANG GENDIS (Clinacanthus nutans) DENGAN MENGGUNAKAN METODE BST (Brine Shrimp Lethality Test) KARYA TULIS ILMIAH Diajukan kepada Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam menyelesaikan program D III bidang Analis Farmasi dan Makanan OLEH NADIA PUTRI AYUNINGTYAS NIM AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG AGUSTUS 2012

3

4 LAKUKAN APA YANG ingin KAMU LAKUKAN KARENA SEMUA ITU AKAN MENJADI PENGALAMAN DALAM HIDUPMU DAN PENGALAMAN HIDUP MERUPAKAN GURU TERBAIK YANG KAMU MILIKI Terima kasih terdalam kepada... Allah SWT., atas rahmat dan kemudahan dalam pembuatan karya tulis ini Kedua orang tua, atas dukungan baik moral maupun materi, semangat, dan doa yang tiada henti Keluarga besar, atas doanya Sahabatku Maria Evarista Asri, atas semua bantuan dan semangat yang diberikan kepadaku Bu Wahyu, atas bimbingannya selama ini Akafarma 09, atas kebersamaan yang tak terlupakan selama tiga tahun Keluarga besar PIM dan semua pihak, atas semua yang dierikan kepadaku selama ini Ku ucapkan terima kasih dari lubuk hatiku yang terdalam... karena bantuan dari mereka semua aku dapat menjadi seperti ini...

5 ABSTRAK Ayuningtyas, Nadia Putri Uji toksisitas ekstrak etanol daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dengan menggunakan metode BST (Brine Shrimp Lethality Test). Karya tulis Ilmiah. Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Pembimbing Dra. Wahyu Wuryandari, M. Pd. Kata kunci :Clinacanthus nutans Folium, toksisitas, Brine Shrimp Lethality Test. Daun dandang gendis mempunyai khasiat sebagai antikanker (Andriani, 2008). Untuk membuktikan khasiat tersebut maka dilakukan uji pendahuluan yaitu dengan melakukan uji toksisitas ekstrak daun dandang gendis. Daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) mengandung senyawa metabolit sekunder saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid yang mempunyai efek toksik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui toksisitas ekstrak daun dandang gendis serta nilai LC 50 dari ekstrak tersebut. Untuk mengetahui efek toksik dilakukan uji toksisitas terhadap larva udang dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach sebagai bioindikatornya. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan dimonitor aktivitasnya dengan BST menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker. Ekstrak daun dandang gendis yang digunakan untuk pengujian dibuat dalam 6 konsentrasi yaitu 1µg/mL, 10µg/mL, 100µg/mL, 500µg/mL, 1000µg/mL, 1500µg/mL. Tiap konsentrasi menggunakan 10 larva udang begitu juga dengan kontrol negatif. Pengujian tersebut diulang sebanyak 2 kali. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun dandang gendis memiliki efek toksik terhadap larva udang Artemia salina Leach. Nilai LC 50 dari ekstrak daun dandang gendis adalah 10,5901µg/mL. Disarankan untuk melakukan penyeleksian daun dandang gendis yang akan digunakan dan memperkecil rentang konsentrasi larutan uji. i

6 KATA PENGANTAR Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah yang berjudul Uji Toksisitas Ekatrak Etanol Daun Dandang Gendis (Clinacanthus nutans) Dengan Menggunakan Metode BST (Brine Shrimp Lethality Test) tepat pada waktunya. Adapun tujuan Karya Tulis Ilmiah ini adalah sebagai persyaratan untuk menyelesaikan program Diploma III di Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Sehubungan dengan selesainya penulisan Karya Tulis Ilmiah ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Hendyk Krisna Dani, S.Si selaku Direktur Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. 2. Ibu Dra. Wahyu Wuryandari, M. Pd. selaku Dosen Pembimbing 3. Ibu Misgiati, A. Md. selaku Dosen Penguji I 4. Ibu Dra. Nurkhulaili, Apt. selaku Dosen Penguji II 5. Bapak dan Ibu Dosen Akademi Analis Farmasi dan Makanan serta semua staff 6. Kedua orang tua yang memberikan do a dan motivasi. 7. Teman-teman mahasiswa, dan semua pihak yang telah memberikan bimbingan, bantuan, dan arahan secara langsung maupun secara tidak langsung. Penulis menyadari sepenuhnya bahwa Karya Tulis Ilmiah ini masih mempunyai beberapa kekurangan. Oleh karena itu, kritik dan saran akan sangat diharapkan. Semoga Karya Tulis Ilmiah ini dapat berguna dan bermanfaat. Malang, Agustus 2012 Penulis ii

7 DAFTAR ISI ABSTRAK... KATA PENGANTAR DAFTAR ISI... DAFTAR LAMPIRAN... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... i ii iii v vi vii BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Kegunaan Penelitian Asumsi Penelitian Ruang Lingkup dan Ketebatasan Penelitian Definisi Istilah... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Toksikologi Brine shrimp Lethality Test (BST) Klasifikasi Artemia salina Leach Clinacanthus nutans Teknologi Ekstraksi Metode Ekstraksi Kerangka Teori iii

8 2.8 Hipotesis BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Populasi dan Sampel Definisi Operasional Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Instrumen Penelitian Pengumpulan Data Analisis Data BAB IV HASIL PENELITIAN 4.1 Determinasi Tanaman Hasil Pengekstrakan Daun Dandang Gendis Hasil Uji Organoleptis Ekstrak Daun Dandang Gendi Hasil Pengamatan Uji Toksisitas Nilai LC BAB V PEMBAHASAN BAB VI PENUTUP 6.1 Kesimpulan Saran DAFTAR RUJUKAN LAMPIRAN iv

9 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1 Gambar 1.1 Daun Dandang Gendis Gambar 1.2 Daun Kering Gambar 1.3 Serbuk Daun Dandang Gendis Gambar 1.4 Proses Ekstraksi Gambar 1.5 Ekstrak daun dandang gendis Gambar 1.6 Proses Evaporasi Lampiran 2 Gambar 1.7 Ekstrak Pekat Gambar 1.8 Larutan Induk Gambar 1.9 Telur Artemia salina Gambar 1.10 Penetasan Telur Gambar 1.11 Larutan Uji Gambar 1.12 Penguapan Larutan Uji Lampiran 3 Gambar 1.13 Larutan Uji + Larva Lampiran 4 Surat Determinasi Daun Dandang Gendis Lampiran 5 Tabel Probit Lampiran 6 Hasil Penimbangan Ekstrak Lampiran 7 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji Lampiran 8 Perhitungan Tingkat Toksisitas v

10 DAFTAR TABEL Tabel 3.1 Definisi Operasional Tabel 3.2 Tabel Data Hasil Pengamatan Tabel 4.1 Hasil Pengekstrakan Daun Dandang Gendis Tabel 4.2 Hasil Uji Organoleptis Ekstrak Daun Dandang Gendis Tabel 4.3 Hasil Perhitungan Jumlah Larva Udang Artemia salina Leach Yang Mati Batch I Tabel 4.4 Hasil Perhitungan Jumlah Larva Udang Artemia salina Leach Yang Mati Batch II Tabel 4.5 Hasil Perhitungan Jumlah Larva Udang Artemia salina Leach Yang Mati Batch III Tabel 4.6 Nilai LC 50 Masing-Masing Batch vi

11 DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Tahap penetasan telur Artemia salina Leach... 9 Gambar 2.2 Morfologi nauplius Artemia salina Leach Gambar 2.3 Daun dandang gendis vii

12 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Daun dandang gendis merupakan tanaman semak belukar yang sering dijadikan sebagai tanaman obat kencing manis, susah buang air kecil, dan disentri. Tanaman dandang gendis juga disebut memiliki potensi sebagai antimalaria dan memiliki potensi sebagai antikanker (Andriani, 2008). Untuk membuktikan khasiat tersebut maka peneliti merasa perlu melakukan uji pendahuluan yaitu dengan melakuakan uji toksisitas ekstrak daun dandang gendis. Toksikologi merupakan disiplin ilmu yang mempelajari sifat-sifat racun zat kimia terhadap makhluk hidup dan lingkungan. Setiap zat kimia pada dasarnya bersifat racun, tetapi setiap keracunan ditentukan oleh banyak faktor terutama dosis. Setiap zat kimia yang akan digunakan harus diuji toksisitas dan keamanannya. Setiap zat kimia, bila diberikan dengan dosis yang cukup besar akan menimbulkan gejala-gejala toksik. Untuk mengetahui sifat toksisitas ini pertama-tama harus ditentukan pada hewan coba melalui penelitian toksisitas akut dan subkronik (Hendrawati, 2009). Brine shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan dimonitor aktivitasnya dengan BST menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker. BST (Brine Shrimp Lethality Test) 1

13 2 merupakan salah satu metode skrining bahan yang berpotensi sebagai tanaman berkhasiat. Metode penelitian ini menggunakan larva udang (Artemia salina Leach) sebagai bioindikator (Harmita, 2005). Larva udang merupakan organisme sederhana dari biota laut yang sangat kecil dan mempunyai kepekaan yang cukup tinggi terhadap toksik (Suhirman dkk, 2006). Daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) mempunyai beberapa senyawa metabolit sekunder antara lain alkaloid, triterpenoid/steroid, glikosida, tanin, saponin, flavonoid dan minyak atsiri. Selain itu juga mengandung sulfur (anonim). Menurut Wasim (2010) golongan flavonoid yang terdapat pada daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) positif terhadap flavon dan flavonol. Kandungan kimia daun dandang gendis berkhasiat dalam pengobatan adalah saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid. Saponin memiliki efek menurunkan kadar gula darah. Flavonoid berfungsi sebagai antimikroba dan triterpenoid sebagai antifagus atau insektisida dan mempengaruhi sistem saraf. Senyawa alkaloid, triterpenoid, saponin, dan flavonoid diduga dapat bersifat toksik pada kadar tertentu. Ekstraksi saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid dari tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar seperti etanol (Cahyadi, 2009). Dalam penelitian ini untuk dapat mengekstrak saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid maka digunakan etanol 70% sebagai pelarut. Mekanisme kematian larva berhubungan dengan fungsi senyawa alkaloid, triterpenoid, saponin, dan flavonoid yang dapat menghambat daya makan larva (antifedant). Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva (Cahyadi, 2009).

14 3 1.2 Rumusan Masalah Apakah ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) mempunyai aktifitas toksik terhadap larva udang (Artemia salina Leach)? Berapa nilai LC 50 ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) terhadap larva udang (Artemia salina Leach)? 1.3 Tujuan Penelitian Mengetahui toksisitas ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) pada larva udang (Artemia salina Leach) Mengetahui nilai LC 50 ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) terhadap larva udang (Artemia salina Leach). 1.4 Kegunaan Penelitian Memberi informasi tentang efek toksik ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) terhadap larva udang (Artemia salina Leach) yang dapat diteliti lebih lanjut tentang kegunaannya Memberikan informasi tentang konsentrasi awal yang dapat digunakan peneliti selanjutnya. 1.5 Asumsi Ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dapat membunuh larva udang (Artemia salina Leach).

15 Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) dapat digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui aktivitas antikanker ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dengan melihat efek toksiknya. 1.6 Ruang Lingkup dan Keterbatasan Penelitian Ruang lingkup Ruang lingkup dalam penelitian ini yaitu uji ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) dengan larva udang (Artemia salina Leach) sebagai hewan ujinya. Parameter yang digunakan dalam menentukan efek toksik daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) yaitu nilai LC Keterbatasan penelitian Keterbatasan dalam penelitian ini yaitu pengambilan daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) untuk replikasi dari tanaman dandang gendis tidak dilakukan secara bersamaan dengan pengambilan daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) untuk perlakuan pertama, pengulangan perlakuan (replikasi) tidak dilakukan pada saat itu juga (saat perlakuan pertama), pemilihan daun dandang gendis tidak diseleksi satu persatu dengan kata lain baik daun dandang gendis yang muda maupun yang tua digunakan dalam penelitian ini.

16 5 1.7 Definisi Istilah Toksisitas adalah daya bunuh dari sediaan ekstrak terhadap larva udang (Artemia salina Leach) dengan indikasi bahwa larva udang (Artemia salina Leach) telah mati/tidak bergerak setelah diberi perlakuan Ekstrak etanol adalah sediaan ekstrak dari simplisia nabati daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dengan cara mengekstraksi daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) menggunakan pelarut etanol 70% dengan metode sokhletasi Daun dandang gendis adalah daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) segar yag diperoleh dari Materia Medika Batu Larva Udang adalah sejenis udang yang digunakan sebagai hewan uji percobaan pada uji toksisitas akut dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Usia larva udang (Artemia salina Leach) yang digunakan dalam penelitian ini adalah 48 jam dengan media hidup yaitu air laut LC 50 adalah konsentrasi zat yang menyebabkan terjadinya kematian pada 50% hewan coba larva.

17 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Toksikologi Toksikologi merupakan disiplin ilmu yang mempelajari sifat-sifat racun zat kimia terhadap makhluk hidup dan lingkungan. Setiap zat kimia pada dasarnya bersifat racun, tetapi setiap keracunan ditentukan oleh banyak faktor terutama dosis. Setiap zat kimia yang akan digunakan harus diuji toksisitas dan keamanannya. Setiap zat kimia, bila diberikan dengan dosis yang cukup besar akan menimbulkan gejala-gejala toksik. Untuk mengetahui sifat toksisitas ini pertama-tama harus ditentukan pada hewan coba melalui penelitian toksisitas akut dan subkronik. Selanjutnya, perlu ditentukan NEL (No Effect Level) yaitu jumlah atau konsentrasi suatu zat kimia yang ditemukan melalui penelitian atau observasi, yang tidak menimbulkan kelainan buruk, perubahan morfologi atau fungsi organ, pertumbuhan, perkembangan, maupun mengurangi lama hidup hewan coba. Selanjutnya, ditentukan pula ADI (Acceptable Daily Intake) yaitu dosis suatu zat kimia yang terbesar, yang dinyatakan dalam satuan mg/kgbb/hari, yang dapat diberikan setiap hari seumur hidup, dan diperkirakan tidak menimbulkan efek kesehatan yang buruk pada manusia, berdasarkan pengetahuan yang ada pada waktu itu. Manfaat lain dari pengukuran toksisitas dalam berbagai bidang adalah dapat digunakan sebagai skrining ekstrak tumbuhan untuk kepentingan pengobatan, menentukan pertahanan anti-herbivora pada tumbuhan, 6

18 7 menilai potensi dan efek bahaya dari pestisida baru, menilai toksisitas yang mungkin ditimbulkan oleh sumber polusi (Hendrawati, 2009). Pengujian toksisitas biasanya dibagi menjadi tiga kelompok yaitu : 1. Uji toksisitas akut Uji ini dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji sebanyak satu kali, atau beberapa kali dalam jangka waktu 24 jam (Harmita, 2005). 2. Uji toksisitas jangka pendek (sub kronik) Uji ini dilakukan dengan memberikan bahan tersebut berulang-ulang, biasanya setiap hari, atau lima kali seminggu, selama jangka waktu kurang lebih 10% dari masa hidup hewan; yaitu 3 bulan untuk tikus dan (1 atau 2) tahun untuk anjing. Tetapi beberapa peneliti menggunakan jangka waktu yang lebih pendek, misalnya pemberian zat kimia selama (14 dan 28) hari (Harmita, 2005). 3. Uji toksisitas jangka panjang (kronik) Percobaan jenis ini mencakup pemberian obat secara berulang selama (3-6) bulan atau seumur hewan, misalnya untuk 18 bulan untuk mencit, 24 bulan untuk tikus, dan (7-10) tahun untuk anjing dan monyet. Memperpanjang percobaan kronik untuk lebih dari 6 bulan tidak akan bermanfaat, kecuali untuk percobaan karsinogenik (Harmita, 2005). 2.2 Brine shrimp Lethality Test (BST ) Brine shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil

19 8 diisolasi dan dimonitor aktivitasnya dengan BST menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker (Harmita, 2005). Penggunaan BST sebagai bioassay pertama kali dilaporkan oleh Tarpley untuk menentukan keberadaan residu insektisida dan menentukan tingkat toksisitas air laut. Selanjutnya Meyer, dkk., menggunakan BST dalam penapisan senyawa-senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak tanaman yang ditunjukkan sebagai toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach. Toksisitas ditentukan dengan melihat harga LC 50 yang dihitung berdasarkan analisis probit. Ekstrak ditentukan dengan melihat LC 50 -nya lebih kecil atau sama dengan 1000µg/mL (LC 50 < 1000µg/mL) (Harmita, 2005). 2.3 Klasifikasi Artemia salina Leach Klasifikasi Divisi : Animal Phuylum : Arthropoda Kelas : Crustaceae Subkelas : Branchiopoda Ordo : Anostraca Famili : Arthemidae Genus : Artemia Species : Artemia salina Leach

20 Morfologi Artemia salina Leach diperdagangkan dalam bentuk telur istirahat yang dinamakan kista. Kista ini berbentuk bulatan-bulatan kecil berwarna kelabu kecoklatan dengan diameter berkisar ( ) µm. Kista dikatakan berkualitas baik apabila kista diinkubasi dalam air berkadar garam (5-70) permil akan menetas sekitar (18-24) jam. Artemia salina Leach yang baru menetas disebut nauplius, berwarna orange, berbentuk bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron, lebar 170 mikron dan berat 0.002mg. Nauplius berangsur-angsur mengalami perkembangan dan perubahan morfologis dengan 15 kali pergantian kulit hingga menjadi dewasa. Pada setiap pergantian kulit disebut instar. Ada beberapa tahap penetasan Artemia salina Leach yaitu tahap hidrasi, tahap pecah cangkang, dan tahap payung atau tahap pengeluaran. Tahap hidrasi terjadi penyerapan air sehingga kista yang diawetkan dalam bentuk kering tersebut akan menjadi bulat dan aktif bermetabolisme. Tahap selanjutnya adalah tahap pecah cangkang dan disusul dengan tahap payung yang terjadi beberapa saat sebelum nauplius keluar dari cangkang (Kusuma dkk, 2010). Gambar 2.1 Tahap penetasan telur Artemia salina Leach

21 10 Artemia salina Leach dewasa biasanya berukuran panjang (1-2) cm yang ditandai adanya tangkai mata yang jelas terlihat pada kedua sisi bagian kepala, antena sebagai alat sensori, saluran pencernaan yang terlihat jelas, dan 11 pasang thorakopoda. Pada Artemia salina Leach jantan, antena berubah menjadi alat penjepit, sepasang penis terdapat dibagian belakang tubuh, sedangkan pada Artemia salina Leach betina antena mengalami penyusutan. Sepasang indung telur atau ovarium terdapat di kedua sisi saluran pencernaan, dibelakang thorakopoda (Kusuma dkk, 2010). Gambar 2.2 Morfologi nauplius Artemia salina Leach Lingkungan hidup Artemia salina Leach hidup planktonik di perairan garam tinggi antara (15-30) permil, suhu yang dikehendaki bekisar antara 25 0 C C, oksigen terlarut sekitar 3mg/L, dan ph antara 7,3-8,4. Artemia salina Leach tidak dapat mempertahankan diri dari musuhnya karena tidak mempunyai alat untuk membela diri. Salah satu cara menghindarkan diri dari pemangsa hewan lain yaitu dengan berpindah ke kondisi alam berupa lingkungan hidup berkadar garam tinggi. Pada umumnya pemangsa tidak dapat hidup dikondisi tersebut. Makanan Artemia salina Leach terdiri atas ganggang renik, bakteri dan

22 11 cendawan. Dalam pemeliharaanya, makanan yang diberikan yaitu katul padi, tepung terigu, tepung kedelai, dan ragi (Kusuma dkk, 2010) Penetasan telur Artemia salina Leach Penetasan telur dilakukan pada wadah bening seperti gelas kimia atau toples yang diberi bahan plastik, negatif film, atau kaca dengan menggunakan media air laut (brine=saline). Wadah penetasan dibagi menjadi dua bagian yaitu terang dan gelap oleh suatu sekat berlubang. Bagian gelap digunakan untuk meletakkan telur yang akan ditetaskan. Sekat berlubang akan menjadi jalan bagi larva yang telah lahir untuk bergerak secara alamiah ke arah terang. Selama penetasan diberi penerangan dengan cahaya lampu pijar/neon (40-60) watt agar suhu penetasan 25 o C - 30 o C tetap terjaga (Kusuma dkk, 2010). Sebagai media penetasan telur digunakan air laut buatan dengan kadar garam (NaCl) 15g/L. Kadar oksigen yang dibutuhkan selama penetasan harus lebih dari 3mg/L, sehingga media air laut harus diberi udara, baik dengan acrator, kompressor, maupun blower. Dalam waktu (24-36) jam biasanya telurtelur sudah menetas menjadi larva yang disebut naupli. Naupli aktif yang telah berumur 48 jam digunakakan sebagai hewan uji dalam penelitian (Kusuma dkk, 2010) Penggunaan Artemia salina Leach Suatu metode uji hayati yang tepat dan murah untuk skrining dalam menentukan toksisitas suatu ekstrak tanaman aktif dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach. Artemia salina Leach sebelumnya telah digunakan dalam bermacam-macam uji hayati seperti uji pestisida, polutan, mikotoksin, anestetik, komponen seperti morfin, kekarsinogenikan dan toksikan dalam air

23 12 laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan Artemia salina Leach memiliki beberapa keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana. Penelitian dengan Artemia salina Leach telah digunakan oleh pusat Kanker Purdue, Universitas Purdue di Lafayette untuk senyawa aktif tanaman secara umum dan tidak spesifik untuk zat anti kanker. Namun demikian hubungan yang signifikan dari sampel yang bersifat toksik terhadap larva Artemia salina Leach ternyata juga mempunyai aktifitas sitotoksik. Berdasarkan hal tersebut maka larva Artemia salina Leach dapat digunakan untuk uji toksisitas (Kusuma dkk, 2010). 2.4 Clinacanthus nutans Morfologi dandang gendis (Clinacanthus nutans) Tumbuhan dandang gendis (Clinacanthus nutans) merupakan tanaman perdu yang biasanya berfungsi sebagai tanaman pagar. Tanaman ini memliki tinggi kurang lebih 2,5m dan batang yang beruas berwarna hijau. Daunnya mempunyai bentuk tunggal dan berhadapan satu sama lain. Panjang daun antara (8-12) cm dan lebar (4-6) cm. Daun tersebut berbentuk tulang menyirip dan berwarna hijau. Tanaman ini memiliki bunga yang tumbuh di ketiak daun dan di ujung batang. Mahkota daun berbentuk tabung dengan panjang (2-3) cm dan memiliki warna merah muda. Buah yang dihasilkan tanaman yang termasuk dalam famili Acanthae ini berwarna coklat dengan bentuk bulat memanjang (Wasim, 2010).

24 13 Gambar 2.3 Daun dandang gendis Klasifikasi dandang gendis (Clinacanthus nutans) Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi Divisi Sub divisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis Sinonim : Spermatophyta (Menghasilkan biji) : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) : Angiospermae : Dicotyledonae : Malvales : Acanthaceae : Clinacanthus : Clinacanthus nutan Lindau : Clinacanthus burmani Ness., Ki tajam (sunda), Gendis (jawa) Kandungan kimia dandang gendis (Clinacanthus nutans) Senyawa metabolit sekunder yang ada pada daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) yaitu alkaloid, triterpenoid/steroid, glikosida, tanin, saponin, flavonoid dan minyak atsiri. Selain itu juga mengandung sulfur

25 14 (anonim). Menurut Wasim (2010) golongan flavonoid yang terdapat pada daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) positif terhadap flavon dan flavonol. Kandungan kimia daun dandang gendis berkhasiat dalam pengobatan adalah saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid. Saponin memiliki efek menurunkan kadar gula darah. Flavonoid berfungsi sebagai antimikroba dan triterpenoid sebagai antifagus atau insektisida dan mempengaruhi sistem saraf. Senyawa alkaloid, triterpenoid, saponin, dan flavonoid diduga dapat bersifat toksik pada kadar tertentu (Cahyadi, 2009) Pengambilan/Pengumpulan Bahan baku daun dandang gendis Kadar bahan aktif dalam simplisia bergantung pada : 1. Bagian tanaman yang digunakan 2. Usia tanaman atau bagian tanaman saat panen 3. Waktu panen 4. Lingkungan tumbuh Pedoman panen daun yaitu dengan dipilih yang telah membuka sempurna dan terletak dibagian cabang atau batang yang menerima sinar matahari sempurna. Pucuk yang sudah tua atau muda dipetik dengan tangan satu persatu (Agoes, 2007). Bila menggunakan bahan tumbuhan segar, setelah cuplikan dipilih sebagai tanda bukti, disarankan untuk mengeringkan sisanya cepat-cepat (untuk mencegah kerja enzim) dalam tanur bersuhu kira-kira 100 o C (Markham, 1988). Bahan simplisia dapat dikeringkan pada suhu 30 o sampai 90 o C, tetapi suhu yang terbaik

26 15 adalah tidak melebihi 60 o C (Depkes RI, 1985). Selanjutnya bahan tumbuhan yang telah dikeringkan dapat disimpan dalam kantung plastik yang ditutup rapat untuk digunakan kemudian, atau digiling menjadi serbuk halus untuk diekstraksi dengan pelarut (Markham, 1988) Mekanisme Kematian Larva Udang Beberapa senyawa yang terkandung dalam daun dandang gendis adalah alkaloid, triterpenoid, saponin dan flavonoid. Saponin adalah suatu kelas gabungan senyawa kimia, salah satu senyawa metabolit sekunder yang ditemukan dari sumber alami dan dari berbagai macam spesies tanaman. Secara spesifik, saponin merupakan glikosida amphiatik dengan struktur seperti busa sabun yang dihasilkan bila dikocok pada larutan berair dan strukturnya terdiri dari satu atau lebih glikosida hidrofilik dikombinasikan dengan derivat triterpene lipofilik. Senyawa flavonoid atau bioflavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa ini merupakan persenyawaan glucoside yang terdiri dari gula yang terikat dengan flavon. Alkaloid secara umum mengandung paling sedikit satu buah atom nitrogen yang bersifat basa dan merupakan bagian dari cincin heterosiklik. Kebanyakan alkaloid berbentuk padatan kristal dengan titik lebur tertentu atau mempunyai kisaran ekomposisi. Alkaloid dapat juga berbentuk amorf atau cairan. Beberapa alkaloid diketahui beracun terhadap organisme lain. Sedangkan triterpenoid merupakan senyawa kimia yang tersusun dari 4 atau 5 konfigurasi cincin dari 30 atom karbon dan beberapa oksigen. Triterpenoid dibentuk oleh unit C5 isoprene melalui jalur mevalonat sitosolik untuk membentuk C30 dan merupakan senyawa steroid di alam. Kolesterol merupakan salah satu contok triterpenoid (Cahyadi, 2009).

27 16 Pada kadar tertentu, senyawa-senyawa tersebut dapat bersifat toksik, yang dalam hal ini dapat menyebabkan kematian terhadap hewan coba yaitu Artemia salina Leach. Mekanisme kematian larva berhubungan dengan fungsi senyawa alkaloid, triterpenoid, saponin dan flavonoid dalam daun dandang gendis yang dapat menghambat daya makan larva (antifedant). Cara kerja senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena itu, bila senyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya. Akibatnya, larva mati kelaparan (Cahyadi, 2009). 2.5 Teknologi ekstraksi Proses pembuatan serbuk simplisia dan klasifikasinya Proses awal pembuatan ekstrak adalah tahapan pembuatan serbuk simplisia kering (penyerbukan). Dari simplisia dibuat serbuk simplisia dengan peralatan tertentu sampai derajat kehalusan tertentu. Proses ini dapat mempengaruhi mutu ekstrak dengan dasar beberapa hal sebagai berikut : a. Makin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi makin efektif-efisien, namun makin halus serbuk, maka makin rumit secara teknologi peralatan untuk tahapan filtrasi. b. Selama penggunaan peralatan penyerbukan dimana ada gerakan dan interaksi dengan benda keras (logam dan lain-lain) maka akan timbul panas (kalori) yang dapat berpengaruh pada senyawa kandungan

28 17 (Depkes RI, 2000) Cairan pelarut Cairan pelarut dalam pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisah dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan. Dalam hal ekstrak total maka cairan pelarut dipilih yang melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : a. Selektif b. Kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut c. Ekonomis d. Ramah lingkungan e. Keamanan Untuk penyarian Farmakope Indonesia menetapkan bahwa sebagai cairan penyari adalah air, etanol-air atau eter. Penyarian pada perusahaan obat tradisional masih terbatas pada penggunaan cairan penyari air, etanol, atau etanol air (Depkes RI, 2000) Air Air dipertimbangkan sebagai penyari karena : a. Murah b. Stabil c. Tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar d. Tidak beracun

29 18 e. Alamiah Kerugian penggunaan air sebagai penyari : a. Tidak selektif b. Sari dapat ditumbuhi kapang dan kuman serta cepat rusak c. Untuk pengeringan diperlukan waktu lama (Ditjen POM, 1986) Etanol Etanol dipertimbangkan sebagai penyari karena : a. Lebih selektif b. Kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas c. Tidak beracun d. Netral e. Absorbsinya baik f. Etanol dapat bercapur dengan air pada segala perbandingan g. Panas yang digunakan untuk pemekatan lebih sedikit Sedangkan kerugiannya adalah etanol mahal harganya. Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak, malam, tanin dan saponin hanya sedikit larut. Dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas (Ditjen POM, 1986). Ekstraksi saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid dari tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar yaitu etanol 70%. Bahan segar dapat diekstraksi dengan alkohol absolut. Namun untuk bahan kering dan kayu diekstraksi menggunakan alkohol berair (Arini, 2003).

30 Separasi dan pemurnian Tujuan dari tahap ini adalah menghilangkan (memisahkan) senyawa yang tidak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa berpengaruh pada senyawa kandungan yang dikehendaki, sehingga diperoleh ekstrak yang lebih murni. Proses-proses pada tahap ini adalah pengendapan, pemisahan dua cairan tak campur, sentrifugasi, dekantasi, filtrasi serta proses adsorbsi dan pertukaran ion (Depkes RI, 2000) Pemekatan / Penguapan (vaporasi dan evaporasi) Pemekatan berarti peningkatan jumlah partikel solute (senyawa terlarut) secara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kondisi kering, ekstrak hanya menjadi kental atau pekat (Depkes RI, 2000) Pengeringan ekstrak Pengeringan berarti menghilangkan pelarut dari bahan sehingga menghasilkan serbuk, masa kering-rapuh, tergantung proses dan peralatan yang digunakan. Ada berbagai proses pengeringan ekstrak yaitu dengan cara : a. Pengeringan evaporasi b. Pengeringan vaporasi c. Pengeringan sublimasi d. Pengeringan konveksi e. Pengeringan kontak f. Pengeringan radiasi g. Pengeringan dielektrik (Ditjen BPOM, 2000).

31 Rendemen Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal. (Ditjen BPOM, 1986) 2.6 Metode ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain. Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain. Struktur kimia yang berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa-senyawa tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat, dan derajat keasaman. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang terkandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Ditjen BPOM, 2000) Ekstraksi dengan menggunakan pelarut Cara dingin a. Maserasi Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Cairan

32 21 penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau penyari lain. Bila cairan penyari yang digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan awal penyarian (Ditjen POM, 1986). b. Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna yang umunya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya (1-5) kali bahan (Ditjen BPOM, 2000) Cara panas a. Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai (3-5) kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna (Ditjen BPOM, 2000). b. Soxhlet Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakuakan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Ditjen BPOM, 2000). Untuk cara kerja sokletasi yaitu pertama-tama yang harus dilakukan adalah serbuk sampel dibungkus dengan kertas saring atau tempat tertentu. Kemudian

33 22 dimasukkan ke dalam alat soklet. Pelarut etanol ditambahkan dari bagian atas sampai tumpah ke dalam labu. Ditambahkan pelarut lagi kira-kira sampai setengahnya. Labu yang sudah berisi pelarut tersebut dipanaskan pada suhu tertentu sampai mendidih. Pada proses ini uap pelarut akan naik dan bersentuhan dengan kondensor. Dimana uap akan terkondensasi dan menetes di atas sampel dan selanjutnya merendam sampel tersebut. Selama proses ini serbuk sampel akan terekstraksi. Apabila ekstrak sudah sampai pada batas pipa u maka ekstrak akan turun ke labu dan akan mendidih kembali. Proses ini akan berjalan kontinu sampai semua ekstrak terekstraksi. file:///d:/bab-i-pendahuluan-1.html c. Digesti Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur (40-50) o C (Ditjen BPOM, 2000). d. Infundasi Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96 o C - 98 o C) selama waktu tertentu (15-20) menit (Ditjen BPOM, 2000). e. Dekok Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama ( 30 o C) dan temperatur sampai titik didih air (Ditjen BPOM, 2000) Destilasi uap Destilasi uap adalah ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial senyawa kandungan menguap dengan fase uap air dari ketel secara

34 23 kontinu sampai sempurna dan diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran (senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi) menjadi desitlat air bersama senyawa kandungan yang memisah sempurna atau memisah sebagian. Destilasi uap, bahan (simplisia) benar-benar tidak tercelup ke air yang mendidih, namun dilewati uap air sehingga senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi (Ditjen BPOM, 2000). 2.7 Kerangka teori Daun dandang gendis diekstrak menggunakan etanol 70% dengan metode sokhletasi. Etanol 70% merupakan pelarut polar sehingga dapat digunakan untuk menarik alkaloid, triterpenoid, saponin dan flavonoid dari daun dandang gendis. Ekstrak daun dandang gendis diuji dengan menggunakan metode BST (Brine Shrimp Lethality Test). Brine shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam (Harmita, 2005). BST (Brine Shrimp Lethality Test) menggunakan hewan uji larva udang Artemia salina Leach karena larva udang merupakan organisme sederhana dari biota laut yang sangat kecil dan mempunyai kepekaan yang cukup tinggi terhadap toksik (Suhirman dkk, 2006). Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui toksisitas daun dandang gendis terhadap larva udang Artemia salina Leach dan mengetahui nilai LC 50 dari ekstrak tersebut. Mekanisme kematian larva berhubungan dengan fungsi senyawa alkaloid, triterpenoid, saponin, dan flavonoid yang dapat menghambat daya makan larva (antifedant). Cara kerja senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena itu, bila senyawa ini

35 24 masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya. Akibatnya, larva mati kelaparan (Cahyadi, 2009). Ekstrak daun dandang gendis Alkaloid Triterpenoid Saponin Flavonoid dengan cara Menghambat daya makan larva Menghambat reseptor perasa mulut larva terjadi terjadi Stomach poisoning (racun perut) Stimulus rasa gagal menyebabkan Alat pencernaan terganggu menyebabkan Tidak mampu mengenali makanan Kematian larva Artemia salina Leach

36 Hipotesis Ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dapat membunuh larva udang (Artemia salina Leach) pada metode BST yang digunakan sebagai uji pendahuluan antikanker.

37 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental yang dilakukan untuk mengetahui aktivitas dari ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans). Tahap pertama adalah tahap persiapan yaitu persiapan telur-telur larva udang (Artemia salina Leach), persiapan daun dandang gendis (Clinacanthus nutans), dan persiapan alat-alat yang akan digunakan. Tahap kedua adalah tahap pelaksanaan yang terbagi menjadi beberapa proses yaitu proses pertama merupakan proses penetasan dan pemeliharaan hingga larva udang (Artemia salina Leach) berumur empat puluh delapan jam. Proses kedua yaitu pembuatan ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) menggunakan pelarut etanol 70% dengan metode sokhletasi. Proses ketiga yaitu perhitungan nilai rendemennya dan dibuat beberapa konsentrasi yang telah ditetapkan yaitu 1500µg/mL, 1000µg/mL, 500µg/mL, 100µg/mL, 10µg/mL, dan 1µg/mL. (Harmita, 2005) Kemudian masing-masing konsentrasi diujikan pada larva udang (Artemia salina Leach). Tahap ketiga adalah tahap akhir yaitu pengamatan terhadap larva udang (Artemia salina Leach) tentang mati tidaknya larva udang (Artemia salina Leach) setelah diberi ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans), menghitung harga LC 50 dan menyimpulkan dari hasil pengamatan. 26

38 Populasi dan Sampel Populasi adalah keseluruhan elemen atau unsur yang akan diteliti. Populasi dalam penelitian ini yakni ekstrak daun dandang gendis. Sampel adalah sebagian dari populasi. Sampel dalam penelitian ini yakni ekstrak daun dandang gendis dengan konsentrasi 1µg/mL, 10µg/mL, 100µg/mL, 500µg/mL, 1000µg/mL, dan 1500µg/mL. 3.3 Definisi Operasional Dalam penelitian ini ada variabel bebas dan variabel terikat. Variabel bebas dari penelitian ini yakni konsentrasi ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dan variabel terikat dalam penelitian ini yakni kematian larva udang. Definisi Operasional Variabel dalam penelitian ini dapat diklasifikasikan sebagai berikut: Tabel 3.1 Difinisi Operasional Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Hasil Ukur Ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) Aktivitas toksik pada larva udang Cairan kental yang diperoleh melalui penyarian daun dandang gendis dengan menggunakan metode sokhletasi Kemampuan zat untuk membunuh 50% populasi larva udang Visual Visual Warna Bau Rasa Bentuk Jumlah larva udang yang mati

39 Lokasi dan Waktu Pelaksanaan Pada proses ekstraksi daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dengan metode sokhletasi dan uji aktivitas larva udang (Artemia salina Leach) dilaksanakan di laboratorium farmakognosi Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Waktu penelitian ini dilaksanakan mulai penyusunan proposal bulan Desember 2011 sampai Agustus Instrumen Penelitian Instrumen penelitian dan bahan dalam penelitian ini digunakan untuk mengumpulkan data. Alat dan bahan yang dibutuhkan antara lain : Alat Seperangkat aquarium; tabung glass; batang pengaduk; cawan penguap 250ml; rotari evaporator, gelas ukur 100mL, 10mL; rak tabung; loyang; blender; water bath; pipet volume 1mL, 3mL, 5mL; botol semprot; beacker glass 400mL, 100mL; bola hisap; labu ukur 10mL, 25mL, 50mL, 100mL; lampu 40 watt Bahan Daun dandang gendis (Clinacanthus nutans); telur larva udang (Artemia salina Leach); etanol 70%; air laut; ragi ; aquades.

40 Pengumpulan Data Persiapan Bahan Daun dandang gendis segar sebanyak 0,5kg dikeringkan dengan menggunakan oven. Bahan simplisia dapat dikeringkan pada suhu 30 o C sampai 90 o C, tetapi suhu yang terbaik adalah tidak melebihi 60 o C (Depkes RI, 1985). Selanjutnya dilakukan proses pengekstrakan daun dandang gendis kering Pengekstrakan dengan metode soxhletasi Serbuk sampel dibungkus dengan kertas saring atau tempat tertentu. Kemudian dimasukkan ke dalam alat soklet. Pelarut etanol ditambahkan dari bagian atas sampai tumpah ke dalam labu. Ditambahkan pelarut lagi kira-kira sampai setengahnya. Labu yang sudah berisi pelarut tersebut dipanaskan pada suhu tertentu sampai mendidih. Pada proses ini uap pelarut akan naik dan bersentuhan dengan kondensor. Dimana uap akan terkondensasi dan menetes di atas sampel dan selanjutnya merendam sampel tersebut. Selama proses ini serbuk sampel akan terekstraksi. Apabila ekstrak sudah sampai pada batas pipa u maka ekstrak akan turun ke labu dan akan mendidih kembali. Proses ini akan berjalan kontinu sampai semua ekstrak terekstraksi. file:///d:/bab-i-pendahuluan-1.html Prosedur diatas merupakan pembuatan ekstrak kering daun dandang gendis batch I, ulangi pembuatan ekstrak kering daun dandang gendis dengan menggunakan serbuk daun dandang gendis yang baru sehingga diperoleh batch II, begitu juga dengan pembuatan batch III.

41 Pemilihan telur Artemia salina Leach Pemilihan telur udang dilakukan dengan merendam dalam aquadest selama satu jam. telur yang baik akan mengendap sedangkan telur yang kurang baik akan mengapung (Cahyadi, 2009) Penyiapan larva Artemia salina Leach Penyiapan larva udang dilakukan dengan menetaskan telur udang 48 jam sebelum dilakukan uji. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur tersebut dalam air laut secukupnya dengan menerangi bagian wadah yang tidak ditempati telur udang dengan sinar lampu (Cahyadi, 2009). Aliri udara dengan menggunakan aerator selama proses penetasan (Suhirman, 2006) Pembuatan Konsentrasi ekstrak etanol Pembuatan larutan induk sampel 5000µg/mL a. Ditimbang 500mg ekstrak kental daun dandang gendis. b. Dilarutkan ekstrak tersebut dengan etanol 70%. c. Di-add-kan pada labu ukur 100mL Pembuatan larutan induk sampel 100µg/mL a. Dipipet 1ml dari larutan induk sampel 5000µg/mL b. Di-add-kan pada labu ukur 50mL Pembuatan larutan kerja sampel a. Konsentrasi 1µg/mL - Dipipet 1ml larutan induk 100µg/mL - Di-add-kan pada labu ukur 100mL

42 31 b. Konsentrasi 10µg/mL - Dipipet 1ml larutan induk 100µg/mL - Di-add-kan pada labu ukur 10mL c. Konsentrasi 100µg/mL - Dipipet 1ml larutan induk 5000µg/mL - Di-add-kan pada labu ukur 50mL d. Konsentrasi 500µg/mL - Dipipet 1ml larutan induk 5000µg/mL - Di-add-kan pada labu ukur 10mL e. Konsentrasi 1000µg/mL - Dipipet 5ml larutan induk 5000µg/mL - Di-add-kan pada labu ukur 25mL f. Konsentrasi 1500µg/mL - Dipipet 3ml larutan induk 5000µg/mL - Di-add-kan pada labu ukur 10mL

43 Pelaksanaan Uji Toksisitas Larva Udang Larva Udang umur 48 jam 10 larva 10 larva 10 larva 10 larva 10 larva 10 larva 10 larva larutan A larutan B larutan C larutan D larutan E larutan F air laut kontrol + 1 tetes ragi (18mg dalam 30ml air laut) Ad hingga volume 5ml dengan air laut Biarkan selama 24 jam Dihitung larva yang mati (tidak bergerak) Keterangan : Dihitung harga LC 50 Larutan A = konsentrasi 1µg/mL Larutan D = konsentrasi 500µg/mL Larutan B = konsentrasi 10µg/mL Larutan E = konsentrasi 1000µg/mL Larutan C = konsentrasi 100µg/mL Larutan F = konsentrasi 1500µg/mL

44 Perhitungan Harga LC 50 Menggunakan analisis probit. 3.7 Analisis Data Tabel 3.2 Tabel Data Hasil Pengamatan Konsentrasi Jumlah larva Rata-rata ekstrak Log yang mati kematian % Konversi etanol konsentrasi (ekor) larva Kematian probit (µg/ml) I II III (ekor) Kontrol Keterangan : Jumlah larva yang digunakan pada setiap tabung sebanyak 10 ekor Harga LC 50 dari ekstrak etanol Perhitungan persentase kematian Persentase kematian = x 100%

45 34 Tes : jumlah kematian larva udang larutan uji Kontrol : jumlah kematian larva udang kontrol Total : jumlah larva udang yang digunakan Persamaan garis linear : Y= a + bx Y = nilai probit X = konsentrasi ekstrak Cari nilai x=... dimana y = 5,00 (kematian 50%) LC 50 ditentukan dengan analisis probit pada taraf kepercayaan 95% (Harmita, 2005).

46 BAB IV HASIL PENELITIAN Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan mengenai uji toksisitas ekstrak daun dandang gendis pada larva udang Artemia salina Leach dengan menggunakan metode BST diperoleh hasil sebagai berikut : 4.1 Determinasi Tanaman Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Bangsa : Malvales Suku : Acanthaceae Marga : Clinacanthus Jenis :Clinacanthus nutans L 35

47 Hasil pengekstrakan daun dandang gendis Di bawah ini terdapat tabel 4.1 yang menunjukan hasil pengekstrakan daun dandang gendis. Tabel 4.1 Hasil Pengekstrakan Daun Dandang Gendis No Batch Berat (gram) I 20,3408 II 18,3439 III 17, Hasil Uji Organoleptis Ekstrak Daun Dandang Gendis Di bawah ini terdapat tabel 4.2 yang menunjukan hasil uji organoleptis ekstrak daun dandang gendis. Tabel 4.2 Hasil Uji Organoleptis Ekstrak Daun Dandang Gendis Organoleptis Warna Bentuk Bau Rasa Hasil Hijau kecoklatan Kental Berbau khas daun Pahit

48 Hasil pengamatan uji toksisitas Di bawah ini terdapat tabel 4.3 yang menunjukan hasil perhitungan jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati batch I. Tabel 4.3 Hasil perhitungan jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati batch I Konsentrasi ekstrak etanol (µg/ml) Log konsentrasi Jumlah larva yang mati (ekor) I II III Rata-rata Kematian larva (ekor) % kematian Konversi probit 1,0074 3,2x ,333 43,33 4,82 10,074 1, ,00 100,74 2, ,333 53,33 5,08 503,7 2, , ,4 3, ,667 66,67 5, ,1 3, ,333 73,33 5,61 Kontrol Keterangan : Jumlah larva yang digunakan pada setiap tabung sebanyak 10 ekor. Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun dandang gendis maka semakin tinggi juga pesentase kematian larva udang Artemia salina Leach. Pada kontrol negatif tidak ditemukan adanya kematian larva udang Artemia salina Leach.

49 38 probit 5,8 6 5,6 5,4 5,2 4,8 5 4,6 batch 1 3,2x10-3 1,0032 2,0032 2,7022 3,0032 3,1793 log dosis Grafik 4.1 Hubungan antara log konsentrasi dengan persentase kematian larva udang Di bawah ini terdapat tabel 4.4 yang menunjukan hasil perhitungan jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati batch II. Tabel 4.4 Hasil perhitungan jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati batch II Konsentrasi ekstrak etanol (µg/ml) Log konsentrasi Jumlah larva yang mati (ekor) I II III Rata-rata Kematian larva (ekor) % Kematian Konversi probit 1,0046 1,9x ,75 10,046 1, ,00 100,46 2, ,667 56,67 5,18 502,3 2, ,333 63,33 5, ,6 3, , ,9 3, ,84 Kontrol Keterangan : Larva yang digunakan pada setiap tabung sebanyak 10 ekor.

50 39 Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun dandang gendis maka semakin tinggi juga pesentase kematian larva udang Artemia salina Leach. Pada kontrol negatif tidak ditemukan adanya kematian larva udang Artemia salina Leach. probit 6 5,8 5,6 5,4 5,2 5 4,8 4,6 batch 2 1,9x10-3 1,002 2,002 2,701 3,002 3,1781 log dosis Grafik 4.2 Hubungan antara log konsentrasi dengan persentase kematian larva udang Di bawah ini terdapat tabel 4.5 yang menunjukan hasil perhitungan jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati batch III. Tabel 4.5 Hasil perhitungan jumlah larva udang Artemia salina Leach yang mati batch III Konsentrasi ekstrak etanol (µg/ml) Log konsentrasi Jumlah larva yang mati (ekor) I II III Rata-rata kematian larva (ekor) % Kematian Konversi probit 1,0016 6,9x ,333 43,33 4,82 10,016 1, ,00 100,16 2, ,667 56,67 5,18 500,8 2, ,333 63,33 5, ,6 3, ,667 66,67 5, ,4 3, ,667 76,67 5,74 Kontrol

51 40 Keterangan : Larva yang digunakan pada setiap tabung sebanyak 10 ekor. Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun dandang gendis maka semakin tinggi juga pesentase kematian larva udang Artemia salina Leach. Pada kontrol negatif tidak ditemukan adanya kematian larva udang Artemia salina Leach. probit 6,8 6,4 6 5,6 5,2 4,8 4,4 batch 2 6,9x10-4 1,0007 2,0007 2,6997 3,0007 3,1768 log dosis Grafik 4.3 Hubungan antara log konsentrasi dengan persentase kematian larva udang. 4.5 Nilai Lethal Concentration (LC 50 ) Di bawah ini terdapat tabel 4.6 yang menunjukan nilai Lethal Concentration (LC 50 ) dari ke tiga batch. Tabel 4.6 Nilai LC 50 masing-masing batch Batch LC 50 (µg/ml) 1 11, , ,0116 Rata-rata 10,5901

52 BAB V PEMBAHASAN Pengujian efek toksik ekstrak daun dandang gendis pada larva udang Artemia salina Leach dilakukan dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksik senyawa antikanker. Tanaman dandang gendis yang digunakan telah diidentifikasi oleh Dinas Kesehatan Propinsi Jawa Timur UPT MATERIA MEDICA. Kandungan senyawa metabolit sekunder yang ada pada daun dandang gendis yaitu alkaloid, triterpenoid/steroid, glikosida, tanin, saponin, flavonoid dan minyak atsiri, sulfur. Saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid pada daun dandang gendis memiliki sifat toksik. Ekstraksi saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid dari tumbuhan dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut polar seperti etanol. Dalam penelitian ini untuk dapat mengekstrak saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid maka digunakan etanol 70% sebagai pelarut. Daun yang akan digunakan diserbuk terlebih dahulu untuk menghilangkan kandungan air didalamnya, selain itu daun diserbuk bertujuan untuk memperluas permukaan sampel sehingga proses ekstraksi dapat berlangsung secara optimal karena semakin luas permukaan sampel maka akan semakin mudah untuk mengekstrak senyawa yang diinginkan. 41

53 42 Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode sokhletasi karena ekstraksi dengan metode sokhletasi selalu menggunakan pelarut yang baru yang umumnya dilakuakan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik sehingga proses ekstraksi berjalan maksimal. Ekstrak cair kemudian dipekatkan dengan menggunakan waterbath agar ekstrak tidak menjadi gosong. Selain itu ekstrak cair dipekatkan agar ekstrak tidak ditumbuhi jamur pada pada proses penyimpanan ekstrak sebelum digunakan. Dari proses ekstraksi 3 batch serbuk daun dandang gendis yang masing-masing diperoleh dari pengeringan 0,5kg daun dandang gendis segar dihasilakan ekstrak kental sebanyak 20,3408gram pada batch 1, 18,3439gram pada batch 2, dan 17,7330gram pada batch 3. Ekstrak kental yang didapat kemudian diuji organoleptis yang meliputi warna, bentuk, rasa, bau. Warna dari ekstrak kental daun dandang gendis yaitu hijau kecoklatan. Bentuk dari ekstrak kental daun dandang gendis yaitu kental. Rasa dari ekstrak kental daun dandang gendis yaitu pahit. Bau dari ekstrak daun dandang gendis yaitu bau khas daun. Ekstrak yang dihasilkan masing-masing batch ditimbang dan diambil sebanyak 500mg untuk dibuat sebagai larutan baku induk dengan mengencerkannya dengan 100mL etanol 70%. Uji sitotoksik ekstrak daun dandang gendis terhadap larva udang Artemia salina menggunakan berbagai konsentrasi yaitu 1µg/mL, 10µg/mL, 100µg/mL, 500µg/mL, 1000µg/mL, dan 1500µg/mL karena suatu ekstrak dapat dikatakan toksik apabila konsentrasi yang

54 43 digunakan untuk membunuh 50% larva udang kurang dari 1000µg/mL sehingga dipilih konsentrasi antara 1µg/mL µg/mL. Pengujian dilakukan dalam 63 tabung reaksi, masing-masing tabung reaksi terdapat 10 ekor larva. Setiap konsentrasi dan pengujian ekstrak daun dandang gendis juga direplikasi sebanyak 2 kali, sedangkan 9 tabung reaksi sebagai kontrol negatif. Hasil penelitian selama 24 jam menunjukkan banyak larva udang Artemia salina Leach yang mati disetiap konsentrasi, sedangkan pada kontrol negatif tidak ditemukan larva udang yang mati. Persentase kematian larva udang semakin besar ditiap kenaikan konsentrasi ekstrak tetapi jumlah kematian larva udang tersebut tidak berbeda jauh dari jumlah kematian larva udang dari konsentrasi sebelumnya walaupun rentang konsentrasi antara satu dengan yang lain cukup jauh. Diharapkan pada penelitian selanjutnya untuk dapat memperkecil rentang konsentrasi ekstrak sehingga dimungkinkan dapat terlihat lebih jelas rentang kematian larva udang antara yang satu dengan yang lainnya. Mekanisme kematian larva berhubungan dengan fungsi senyawa saponin, flavonoid, alkaloid, triterpenoid yang dapat menghambat daya makan larva (antifedant). Cara kerja senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena itu, bila senyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya. Akibatnya, larva mati kelaparan (Cahyadi, 2009).

55 44 Dari persentase kematian akan didapat nilai probit yang digunakan untuk menentukan LC 50. Pada pengujian pertama didapat nilai LC 50 sebesar 11,6413µg/ml. Pada pengujian kedua didapat nilai LC 50 sebesar 11,1173µg/mL. Pada pengujian ketiga didapat nilai LC 50 sebesar 9,0116µg/mL. Dari ketiga kali pengujian menunjukkan harga rata-rata LC 50 sebesar 10,5901μg/mL. Artinya hanya dengan konsentrasi 10,5901μg/mL, ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) dapat membunuh 50% larva udang Artemia salina Leach. Suatu ekstrak dapat dikatakan memiliki efek sitotoksik jika ekstrak dapat menyebabkan kematian 50% hewan uji pada konsentrasi kurang dari 1000µg/mL (Harmita dan Radji: 2005). Berdasarkan pernyataan tersebut maka ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) bersifat toksik.

56 BAB VI PENUTUP 6.1 Kesimpulan Berdasarkan penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) memiliki efek toksik terhadap larva udang Artemia salina Leach Nilai LC 50 ekstrak daun dandang gendis (Clinacanthus nutans) sebesar 10,590μg/mL. 6.2 Saran Melakukan penyeleksian daun dandang gendis yang akan digunakan Memperkecil rentang pembuatan konsentrasi larutan uji. 45

57 46 DAFTAR RUJUKAN Agoes, Goeswin Teknologi Bahan Alam. Bandung: ITB Andriani, Ade Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Uji Potensi Larvasida Fraksi Ekstrak Daun Clinacanthus nutans L. Terhadap Larva Instar III Nyamuk Aedes aegypti, (online), ( diakses 10 Agustus 2012) Anshori, Farhan Program Studi Fakultas MIPA Universitas Negeri Yogyakarta. Isolasi dan Identifikasi Golongan Flavonoid Daun Dandang Gendis, (online), ( IDENTIFIKASI-GOLONGAN-FLAVONOID diakses 17 November 2011) Arini, Sri Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Daya Antipksidan dan Kadar Flavonoid Hasil Ekstraksi Etanol-Air Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.), (online), ( diakses 27 Juni 2012) Cahyadi, Robby Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Pare (Momordica charantia L.) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode BST, (online), ( diakses 11 November 2010) Departemen Kesehatan Republik Indonesia Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawas Obat Dan Makanan Departemen Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jendral Pengawas Obat dan Makanan Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Ditjen POM Sediaan Galenik. Departemen Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta Harmita Analisi Hayati. Departemen Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta Hendrawati, Anindita Rosenda Eka Program Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kemangi ( Ocimum sanctum Linn. ) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test ( BST), (online), (

58 47 ac.id/8087/1/anindita_rosenda_eka_hendrawati.pdf+uji+toksisitas+akut+ Ekstrak+Etanol+Daun+Kemangi+%28+Ocimum+sanctum+Linn.+%29+Terh adap+larva+artemia+salina+leach+dengan+metode+brine+shrimp+lethal ity+test+%28+bst%29&hl=id&gl=id&pid=bl&srcid=adgeesiprujmyak xi8dqodaa8qu8iraixm9auz0sla0xyai4j-- 9bnd1A6vcdIO142d7PQk1wq80mB7zt30FDGllrHMeJWmKjPtlKpTxP_U5- UdF4UVJq8qmUGQBBCHfSZ7OttUqT63F&sig=AHIEtbSi5NhKgGEYGHb zrbknf5ueaet6ma diakses 2 Desember 2011) Markham, K. R Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: ITB Mutia, Dita Program Sarjana Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Anggur (Vitis vinifera) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan BST, (online) ( diakses 15 November 2011) Nur, Ahmad Program Pendidikan Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang.Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Sukun (Artocarpus altilis) Terhadap Larva Artemia Salina Leach Dengan Metode BST ( diakses 23 November 2011) Nurhayati, Dyah Program Studi Biologi Fakultas MIPA. Uji Toksisitas Ekstrak Eucheuma Alvarezii terhadap Artemia Salina sebagai Studi Pendahuluan Potensi Antikanker, (online), ( diakses 15 November 2011) Putri, Siti Program Ekstensi Sarjana Farmasi universitas sumatera utara medan. Pemanfaatan ekstrak etanol daun dandang gendis (Clinacanthus nutans (Burm f.) Lindau) Menggunakan Matriks Nata De Coco Dan Gel Dalam Penyembuhan Luka Sayat, (online), ( diakses 15 November 2011). Srisadono, Arya Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. Skrining Awal Ekstrak Etanol Daun Sirih (Piper betle Linn) Sebagai Antikanker Dengan Blt, (online), ( diakses 2 Desember 2011) Suhirman Sintha dan Hernani Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik. Uji Toksisitas Ekstrak Lempuyang Gajah (Zingiber zerumbet) Terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach), (online) ( lempuyang.pdf diakses 15 November 2011)

59 48 Lampiran 1 Gambar 1.1 Daun Dandang Gendis Gambar 1.2 Daun Kering Gambar 1.3 Serbuk Daun Dandang Gendis Gambar 1.4 Proses Ekstraksi Gambar 1.5 Ekstrak daun dandang gendis Gambar 1.6 Proses Evaporasi

60 49 Lampiran 2 Gambar 1.7 Ekstrak Pekat Gambar 1.8 Larutan Induk Gambar 1.9 Telur Artemia salina Gambar 1.10 Penetasan Telur Gambar 1.11 Larutan Uji Gambar 1.12 Penguapan Larutan Uji

61 50 Lampiran 3 Gambar 1.13 Larutan Uji + Larva

62 51 Lampiran 4 Surat Determinasi Daun Dandang Gendis

63 Lampiran 5 Tabel Probit 52