PROFIL SITOGENETIK KROMOSOM Y PADA LAKI-LAKI NORMAL

Transkripsi

1 PROFIL SITOGENETIK KROMOSOM Y PADA LAKI-LAKI NORMAL Siti Wasilah 1 Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat sitiwasilah@yahoo.com ABSTRACT Normal prenatal developments of male and female genitalia are very complicated. Some crucial loci on Y chromosome have a role in normal sexual development. Descriptive study about cytogenetics profile of Y chromosome presented in 30 normal male was done using G-banding and C-banding techniques to described the mean length and heterochromatin profile of y chromosome. Cytogenetics method using G- banding show 30 male with normal karyotype (46,XY) and there is no structure aberration of Y chromosome, the mean length of Y chromosome in normal male was 2,54 µm (SD 0.31). Heterochromatin profile of Y chromosome analyzed by C-banding technique show that all normal male has C-band positive. Key words: cytogenetics profile, Y chromosome, normal male PENDAHULUAN Perkembangan prenatal organ genital memerlukan peran krusial dari kromosom Y 1,2. Kromosom Y adalah kromosom terkecil pada manusia yang diperlukan untuk perkembangan seksual dan spermatogenesis karena mengandung sejumlah lokus krusial yang berperan dalam perkembangan seksual normal 1. Faktor transkripsi pada lengan pendek kromosom Y (SRY), berperan penting dalam pembentukan testis. Sedangkan, gen-gen pada regio eukromatik lengan panjang kromosom Y (Yq11) berperan dalam spermatogenesis normal yaitu azoospermia factors yang terdiri atas AZFa, AZFb, dan AZFc 3,4. Struktur kromosom Y diduga mempunyai pengaruh terhadap fenotip seks secara tidak langsung 1,3. Beberapa laporan kasus abnormalitas kromosom Y pada individu-individu dengan anomali fenotip seks mendukung hal ini. Mutasi pada regio determinasi seksual (SRY) kromosom Y dapat menyebabkan seorang individu XY menjadi seorang wanita dan sebaliknya seorang dengan kariotipe 45, X yang disertai insersi SRY akan berfenotip seperti seorang laki-laki. Aberasi struktural kromosom Y pada penderita ambigus genitalia yang pernah dilaporkan adalah kromosom cincin, disentrik, isodisentrik lengan pendek kromosom Y, dan delesi sebagian besar lengan panjang kromosom Y 5,6,7. Sejumlah kasus dengan delesi kromosom Y yang pernah dilaporkan, menimbulkan dugaan bahwa kromosom ini memiliki kerentanan untuk kehilangan spontan materi genetik yang dikandungnya. Delesi kromosom dapat terjadi karena beberapa mekanisme berikut, yaitu: aberasi rekombinan antara daerah homolog atau sejumlah sekuen yang mirip antara kromosom X dan Y, aberasi rekombinan intrakromosomal karena pertukaran sister chromatid yang tidak seimbang, atau penyisipan pada saat replikasi DNA 8. Penelitian terdahulu pada beberapa kelompok ras telah melaporkan tentang 69

2 ukuran kromosom Y yang bervariasi di antara berbagai individu dan populasi etnik yang berbeda 9. Secara sitogenetik, ukuran kromosom Y mendekati ukuran kromosom 22, walaupun seringkali ukuran kromosom Y lebih besar 10. Ukuran kromosom Y pada berbagai fenotip ambigus genitalia tampaknya juga bervariasi. Pada kasus ambigus genitalia dengan delesi dan duplikasi lengan panjang kromosom Y, ditemukan panjang kromosom Y dalam batas normal tetapi dengan C-bandnegatif. Hal ini diduga karena adanya delesi regio heterokromatin lengan panjang kromosom Y sekaligus duplikasi regio eukromatin lengan pendek kromosom Y penderita 11. Preliminary study yang dilakukan di Pusat Riset Biomedik FK UNDIP untuk mengukur panjang kromosom Y pada 20 orang bukan penderita ambigus genitalia, memperlihatkan panjang rata-rata 2,88µm dan simpang baku 0,53. Sebagaimana telah diketahui bahwa pada kromosom Y terdapat faktor penentu fertilitas (gen AZFa, AZFb, dan AZFc), maka diduga laki-laki dewasa normal tidak mengalami kelainan pada gen ini sehingga memiliki kromosom Y yang normal secara struktural. Laki-laki dewasa normal yang mengandung kromosom Y normal pada sel tubuhnya dapat ditunjukkan dengan tidak adanya riwayat infertilitas primer maupun sekunder. Berdasarkan hal tersebut di atas, dalam kondisi sarana pemeriksaan sitogenetik dan molekuler yang masih terbatas, deskripsi profil sitogenetik kromosom Y pada laki-laki normal diharapkan bisa menjadi alternatif aspek sitogenetik yang dapat dianalisa dan menjadi dasar acuan untuk menganalisa abnormalitas kromosom Y pada kasus-kasus dengan anomali fenotip seks. Berdasarkan hal ini maka dilakukan penelitian untuk mengetahui profil sitogenetik kromosom Y pada laki-laki normal. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui gambaran profil sitogenetika kromosom Y, meliputi analisa adanya aberasi struktur dan pengukuran panjang kromosom Y, serta analisa profil regio heterokromatin kromosom Y pada lakilaki normal. METODE PENELITIAN Penelitian dilakukan di Pusat Riset Biomedik FK UNDIP, Semarang, dari Februari 2007 sampai dengan Mei Penelitian ini menggunakan metode dekriptif dengan sampel yang diambil secara consecutive random samplings sebanyak 30 orang. Laki-laki normal yang datang ke Pusat Riset Biomedik FK UNDIP dan bersedia menjadi subyek penelitian diminta data status marital dan fertilitasnya. Bahan yang digunakan yaitu darah penderita masing-masing sebanyak 5 cc dalam tabung heparin, media MEM, PHA, FBS, colcemid, thymidin, KCL 0.075M, serta larutan carnoy s untuk proses preparasi kromosom. Pengecatan G-banding menggunakan reagen reagen berikut: H 2 O 2 30%, larutan Trypsin 1% stok dalam buffer Hanks, larutan buffer Hanks (HBSS) ph 6,8-70

3 7,2, dan phosphate Buffer Saline (PBS) ph 6,8. Pengecatan C-banding menggunakan reagen-reagen berikut: HCl 0,2 N, 5% Ba(OH) 2 ; 5 g Ba(OH) 2 dalam 100mL aqua bidest, 2 x SSC (0.3M sodium klorid, 0.03 M sodium sitrat, ph 7.0): g NaCl dan 8.82 sodium sitrat dalam 1 L aqua bidest, dan Cat Giemsa 2% dalam buffer fosfat ph 6.8. Pemeriksaan sitogenetik konvensional dilakukan dengan menggunakan limfosit darah perifer dari subyek penelitian. Pembuatan kariotip dilakukan dengan teknik pengecatan G-banding dan C-banding. Kariotip dari hasil pengecatan G-banding digunakan untuk menganalisa adanya aberasi struktur dan mengukur keseluruhan panjang kromosom Y. Analisa struktur kromosom Y dilakukan pada 8 metafase dan menghitung 20 metafase, jika ditemukan mosaic maka penghitungan dilanjutkan hingga 40 metafase. Ukuran panjang kromosom Y adalah keseluruhan panjang kromosom yang meliputi lengan panjang dan lengan pendek kromosom Y, dinyatakan dalam satuan mikrometer (µm). Pengukuran dilakukan dengan menggunakan program Leica CW4000 pada 3 metafase berbeda hasil pengecatan G-banding yang memenuhi kriteria banding level 550 berdasarkan indikator kualitas banding ISCN, yaitu: 12 - Pada lengan panjang kromosom 18 (18q) terdapat 4 pita gelap - Pada kromosom 10 terdapat split antara 10q21, 10q23, dan 10q25 - Pada kromosom 7, 7q33 dan 7q35 terlihat dengan jelas - Pada kromosom 22, 22q13.2 dapat terlihat. Analisa profil regio heterokromatin kromosom Y dilakukan pada metafase hasil pengecatan C-banding dengan cara mengamati bagian bawah lengan panjang kromosom Y yang berwarna gelap. Ada atau tidaknya bagian bawah lengan panjang kromosom Y yang berwarna gelap dinyatakan sebgai C-band positive atau c- band negative. Data penelitian ini disajikan secara deskriptif, meliputi hasil kariotipe dan analisa struktur kromosom Y. Data ukuran panjang kromosom Y dari seluruh sampel dihitung reratanya, selanjutnya ditampilkan dalam tabel distribusi frekuensi meliputi kariotipe, rerata panjang kromosom Y dan profil regio heterokromatin kromosom Y. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil kariotip dan ukuran panjang kromosom Y pada subyek penelitian ditampilkan pada Tabel 1. Pengukuran panjang kromosom Y dilakukan pada metafase yang memenuhi kriteria banding level 550. Contoh kariotipe dari hasil pewarnaan G-banding yang memenuhi kriteria banding level 550 disajikan pada Gambar 1. Tabel 1. Hasil Kariotipe dan ukuran panjang kromosom Y sampel penelitian Kariotip Panjang kromosom Y (µm) 46,XY Minimum Maksimum Rata-rata SD 1,79 3,12 2,54 0,31 71

4 Gambar 1. Contoh kariotipe dari hasil pewarnaan G-banding yang memenuhi kriteria banding level 550 Hal ini menunjukkan kesesuaian data Gambaran contoh kromosom Y pada riwayat fertilitas yang menjadi dasar laki-laki normal dalam beberapa ukuran berbeda ditampilkan pada Gambar 2. Analisa pengambilan sampel. Sebagaimana dipahami, perkembangan prenatal organ genital lakilaki regio heterokromatin kromosom Y sampel dan perempuan dan perempuan penelitian, menunjukkan semua kromosom Y memiliki C-band positive (Gambar 3). memerlukan peran krusial dari kromosom Y (Gambar 4). Gambar 3. Kromosom Y pada laki-laki normal dalam ukuran berbeda Tabel 1 memperlihatkan hasil pemeriksaan kromosom pada 30 orang sampel penelitian adalah normal, yaitu semua memiliki kariotip 46XY dan pada sampel tidak ditemukan aberasi struktur kromosom Y. Gambar 3. Metafase dengan pewarnaan C-banding, tanda panah menunjukkan kromosom Y dengan C-band positive 72

5 Gambar 4. Bagan pengaruh kromosom Y pada diferensiasi gonad Kromosom Y adalah kromosom terkecil pada manusia yang diperlukan untuk perkembangan seksual dan spermatogenesis 14. Kromosom Y sangat sedikit mengandung gen aktif dan sebagian besar strukturnya terdiri atas heterokromatin 3,14. Kromosom Y merupakan penentu kelamin pada manusia yang mengandung 58 juta pasang basa dan merupakan 0,38% dari total DNA dalam sel 3,14. Sebuah penelitian pada beberapa kelompok ras 9 melaporkan tentang ukuran kromosom Y yang bervariasi di antara berbagai individu dan populasi etnik yang berbeda. Secara sitogenetik, ukuran Penelitian profil kromosom Y pada laki-laki normal perlu dilakukan dengan membatasi populasi berdasarkan etnis agar dapat mengetahui adanya perbedaan panjang kromosom Y antar populasi etnis di Indonesia. Kromosom Y mendekati ukuran kromosom 22, walaupun seringkali ukuran kromosom Y lebih besar 3,14. Beberapa literatur menyebutkan estimasi rata-rata ukuran kromosom Y adalah ~60 mbp 13,14,15. Berdasarkan penelitian terdahulu, telah diketahui bahwa ukuran panjang kromosom Y berbeda di antara berbagai populasi. Sedangkan, sampel dalam penelitian ini tidak ditentukan secara khusus berdasarkan suku atau populasinya, hanya mewakili populasi laki-laki normal. Berdasarkan hal ini perlu dilakukan penelitian dengan sampel yang dibatasi berdasarkan etnis, sehingga dapat diketahui ada atau tidaknya perbedaan ini di antara populasi yang berbeda. Analisa struktur kromosom Y dilakukan dengan teknik pewarnaan C- banding yang merupakan teknik primer untuk mengidentifikasi variasi polimorfisme kromosom, seperti untuk memeriksa adanya penambahan atau pengurangan panjang regio heterokromatin pada kromosom 1qh, 9qh,16qh, dan Yqh 12. Regio heterokromatin sebuah kromosom adalah regio yang tercat gelap (heteropiknosis positif) pada pemeriksaan sitogenetika 12,14. Heterokromatin terdiri atas dua tipe, yaitu heterokromatin fakultatif dan konstitutif 12. Heterokromatin konstitutif kaya dengan DNA repetitif yang mengandung sangat sedikit gen-gen struktural dan bersifat sangat polimorfik. Regio ini dapat dilihat secara sitogenetik dengan teknik pengecatan C- banding atau disebut sebagai C-bands positive 12. Hasil penelitian ini menunjukkan kromosom Y pada seluruh sampel memiliki c-band positive. Sebagaimana telah diketahui bahwa kromosom Y pada individu normal memperlihatkan setengah dari lengan 73

6 panjangnya bersifat C-band positive. Pada manusia regio ini bersifat sangat polimorfik 15,16. Gambar 5 memperlihatkan gambaran skematik regio eukromatik dan heterokromatik pada kromosom Y. struktur kromosom Y dilakukan pada 8 metafase berbeda, tetapi secara kualitatif tidak ditemukan perbedaan panjang regio heterokromatin kromosom Y antar metafase yang berbeda. Gambar 5. Idiogram kromosom Y yang memperlihatkan regio eukromatin dan heterokromatin 9. Pengukuran panjang regio heterokromatin lengan panjang kromosom Y tidak dilakukan pada penelitian ini, karena keterbatasan sarana untuk melakukan pengukuran tersebut. Laporan sejumlah penelitian terdahulu menyebutkan bahwa panjang regio heterokromatin lengan panjang kromosom Y di antara berbagai populasi berbeda-beda. Panjang regio heterokromatin ini dinyatakan sebagai Yqh + (positif) atau Yqh (negatif) atau C- band positive dan C- band negative. Sebuah laporan penelitian juga menyebutkan adanya satu individu dengan panjang regio heterokromatin yang berbeda dalam 2 populasi selnya, yaitu Yqh positive dan Yqh negative. Hasil ini diperoleh dengan memeriksa kromosom pada 30 metafase berbeda dari 2 media kultur yang berbeda. Pada penelitian ini, analisis KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan gambaran profil sitogenetik kromosom Y pada laki-laki normal adalah: - Tidak ada aberasi struktur kromosom Y - Rerata panjang kromosom Y adalah 2,54 µm (SD 0.31) - Regio heterokromatin pada bagian bawah lengan panjang kromosom Y tercat gelap (C-band positive). DAFTAR PUSTAKA 1. MacLaughlin DT and Donahoe PK. Sex Determination and Differentiation. Review article in N Engl J Med 2004; 350: Berkovitz GD, Seeherunvong T. Abnormalities of gonadal differentiation. Bailliere s clinical endocrinology and metabolism 1998; 12 (1) : Jobling MA and Smith CT. The Human Y Chromosome: An Evolution marker Comes of Age. Review Article in Nature 2003; available on 74

7 4. Passarge E. Color Atlas of Genetics 3rd Edition. Thieme Stuttgart, New York 2007: Ferlin A, Moro E, Rossi A, Dallapiccola and Foresta. The human Y chromosome s azoospermia factor b (AZFb) region: sequence, structure, and deletion analysis in infertile men. J Med Genet 2003; 40: Mundhofir FEP, Winarni TI, Juniarto AZ, Faradz SMH. Ring Chromosome Y in a boy with genital anomaly, a case report. Publish in PAAI, Semarang Kim S, Jung S, Kim H. Chromosome Abnormalities in a referred Population for Suspected Chromosomal Aberrations: A Report of 4117 Cases. J Korean Med Sci 1999; 14: Göllü G, Yildiz RV, Bingol KM, Yagmurlu A,Senyu cel, Tanju A, Go kcora H, Dindar H. Ambiguous Genitalia: An Overview of 17 years Experience. J Ped Surg, 2007; 42: Barbosa AAL, Cavalli IJ, Abel K, Santos M and Azevêdo ES. Family names and the length of the Y chromosome in Brazilian blacks. Braz. J. Genet 1997; vol. 20(1) 10. Liow SL, Yong EL, and Ng SC. Prognostic value of Y Deletion Analysis. Hum. Reprod. 2001; 16 (1): Thangaraj K, Subramanian S, Reddy AG, Singh L. Unique Case of Deletion and Duplication in the Long Arm of the Y Chromosome in an Individual With Ambiguous Genitalia. Research Letter in Am J Med Gen 2003;116A: Barch MJ. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. Lippincot-Raven Publisher, Philadelpia, New York 1991; 10-11; Sadler TW. Langman s Medical Embriology. 9 th ed. Pennsylvania: Lippincott Williams & Wilkins 2000: Jobling MA, et al. Structural variation on the short arm of the human Y chromosome: recurrent multigene deletions encompassing Amelogenin Y. Human Mol Gen 2007;16 3: Duell T, et al. Interstitial and terminal deletion of chromosome Y in a male individual with cryptozoospermia. Molecular Human Reproduction 1998;4: Jakubowski L, et al. Molecular analysis of Y chromosome long arm structural instability in patients with gonadal dysfunction. Clin Genet 2000: 57: