KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOLTEMPE BERBAHAN BAKU KEDELAI HITAM

Transkripsi

1 KARAKTERISASI SENYAWA BIOAKTIF ISOVLAVON DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOLTEMPE BERBAHAN BAKU KEDELAI HITAM (Glycine soja), KORO HITAM (Lablab purpureus. L.), DAN KORO KRATOK (Phaseolus lunatus. L.) TESIS Oleh : Heny Rahma S. NIM : S PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

2 2 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah Senyawa isoflavon merupakan senyawa metabolit sekunder yang banyak disintesa oleh tanaman. Namun, tidak sebagai layaknya senyawa metabolit sekunder karena senyawa ini tidak disintesis oleh mikroorganisme. Dengan demikian, mikroorganisme tidak mempunyai kandungan senyawa ini. Oleh karena itu, tanaman merupakan sumber utama senyawa isoflavon di alam. Dari beberapa jenis tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada tanaman Leguminoceae, khususnya pada tanaman kedelai (Pradana, 2008). Isoflavon yang terdapat dalam biji kedelai dorman adalah dalam bentuk isoflavon glikosida yaitu daidzin, genistin dan glisitin. Isoflavon glikosida tersebut mempunyai aktivitas fisiologis yang rendah. Pawiroharsono (1995) dalam Restuhadi (2001), menyatakan bahwa 99% isoflavon glikosida yang terdapat pada biji kedelai, selama proses perendaman (dalam pembuatan tempe) dapat terhidrolisis menjadi isoflavon aglukan dan glukosa. Isoflavon aglukan yang mempunyai aktivitas fisiologis tinggi tersebut adalah genistein, daidzein, dan glisitein, selanjutnya pada proses fermentasi kedelai rendam dengan kapang Rhizopus oligosporus, daidzein dapat mengalami proses hidroksilasi sehingga menjadi senyawa faktor-2. Faktor-2 mempunyai aktivitas antioksidan dan antihemolisis yang lebih baik dari daidzein dan genistein (Gyorgy et al., 1964).

3 3 Salah satu aktivitas fisiologis yang menonjol dari isoflavon daidzein, genestein, glisitein dan faktor-2 adalah aktivitas antioksidan. Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas (Kochhar dan Rossell, 1990). Antioksidan pada isoflavon sangat dibutuhkan tubuh untuk menghentikan reaksi pembentukan radikal bebas, sehingga dapat menghambat proses penuaan dini, mencegah penyakit degeneratif seperti aterosklerosis, jantung koroner, diabetes melitus,dan kanker (Horwit, 1980 dalam Sukib, et al., 2002 ). Selama ini kita ketahui antioksidan yang digunakan sebagai pengawet pada bahan makanan adalah antioksidan sintetik seperti Butylated Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluene (BHT), Propyl Gallat (PG) dan Etylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA). Pemanfaatan zat antioksidan sintetik dapat menimbulkan gangguan kesehatan bagi konsumen antara lain gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus, dan keracunan (Suryo dan Tohari, 1995). Untuk itu perlu dicari alternatif lain untuk mengatasi permasalahan tersebut. Salah satu cara adalah dengan mengganti pemanfaatan antioksidan sintetik dengan antioksidan alami. Mengingat adanya kandungan isoflavon dalam kedelai yang dapat berfungsi sebagai antioksidan, maka tempe kedelai dapat direferensikan sebagai bahan baku sumber antioksidan alami. Disamping sebagai antioksidan, isoflavon daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2 juga mempunyai khasiat lain diantaranya sebagai estrogenik (zat yang mirip estrogen), anti inflamasi, anti tumor atau anti kanker, anti hemolisis, anti kontriksi (penyempitan) pembuluh darah, anti kolesterol, menurunkan kadar trigliserida VLDL dan LDL serta meningkatkan HDL (Pawiroharsono, 2001). Dengan demikian isoflavon dari tempe kedelai selain berkhasiat sebagai antioksidan juga mempunyai khasiat ganda seperti yang tertera diatas.

4 4 Pada saat ini tengah terjadi dilema dalam memproduksi bahan pangan berbahan baku kedelai (termasuk tempe), karena harganya yang melambung yaitu, dari Rp 2.500,00 ( tahun 2004) menjadi Rp 8.000,00 (tahun 2009) / kg. Penurunan harga kedelai sudah tidak memungkinkan lagi karena saat ini kedelai selain diperebutkan sebagai bahan pangan (food ), juga untuk pakan (feed). Untuk itu perlu dicari alternatif lain, yaitu dengan menggali potensi bahan lokal yang murah dan melimpah di Indonesia sebagai alternatif pengganti kedelai sebagai sumber antioksidan alami khususnya isoflavon ( Retno, 2001) Handayani dkk. (1996) menyatakan bahwa Indonesia mempunyai banyak jenis legume yang beberapa diantaranya belum dimanfaatkan secara optimal. Salah satu jenis legume yang cocok dibudidayakan di Indonesia dan dapat berfungsi sebagai bahan pangan tetapi produk olahannya masih jarang dikonsumsi yaitu koro hitam (Lablab purpureus), koro kratok (Phaseolus lunatus), dan kedelai hitam (Glycine soja). Dalam rangka pengembangan senyawa antioksidan alami khususnya isoflavon maka perlu dilakukan penelitian tentang optimasi produksi senyawa antioksidan dari koro hitam, koro kratok, dan kedelai hitam dan produk tempenya serta karakterisasi kandungan isoflavonnya. Dipilihnya koro hitam, koro kratok dan kedelai hitam sebagai alternatif obyek penelitian sumber isoflavon karena isoflavon merupakan metabolit sekunder yang banyak disintesis oleh tanaman namun tidak disintesis oleh mikroorganisme. Koro hitam, koro kratok, dan kedelai hitam merupakan spesies dari familia leguminoceae sehingga dimungkinkan juga mengandung isoflavon seperti yang dijumpai pada kedelai. Selama ini tempe kedelai yang dikonsumsi oleh masyarakat adalah tempe hasil fermentasi kedelai selama 48 jam. Lama waktu fermentasi tersebut merupakan lama waktu fermentasi kedelai untuk menghasilkan tempe yang paling optimum dari sisi cita rasa untuk dikonsumsi, tetapi lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak antioksidan khususnya isoflavon yang

5 5 optimum belum diketahui. Kedelai hitam, koro hitam, dan koro kratok mempunyai ukuran biji yang hampir sama dari ukuran biji kedelai, untuk itu perlu diteliti lama waktu fermentasi untuk menghasilkan ekstrak antioksidan khususnya isoflavon yang optimum. Penelitian ini akan difokuskan pada optimasi produksi senyawa antioksidan khususnya isoflavon dengan variasi lama waktu fermentasi baik pada biji kedelai dan produk tempenya maupun pada biji koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya. Untuk memperoleh zat antioksidan alami, dapat dilakukan dengan cara ekstraksi tanaman menggunakan pelarut organik seperti, heksana, benzena, etil eter, kloroform, etanol atau metanol. Metanol 90 % merupakan pelarut optimum untuk mengekstrak isoflavon dari kedelai, namun penggunaannya untuk skala komersial masih perlu dikaji lebih lanjut karena bersifat toksik. Penelitian dengan menggunakan pelarut etanol untuk ekstraksi diharapkan dapat mengganti metanol untuk menghasilkan ekstrak antioksidan alami secara komersial, karena kepolaran etanol mendekati metanol dan relatif tidak beracun (Ariani dan Hastuti, 2009). Untuk selanjutnya pada penelitian ini juga akan difokuskan pada ekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol. B. Perumusan Masalah Dari uraian latar belakang di atas permasalahan dapat dirumuskan sebagai berikut : 1. Berapa lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak etanol tempe berbahan baku Kedelai Hitam, Koro hitam dan Koro kratok dengan aktivitas antioksidan yang optimum pada perlakuan fermentasi (0, 1, 2, 3, 4 hari)? 2. Isoflavon jenis apa sajakah yang terkandung dalam tempe berbahan baku koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari )?

6 6 3. Bagaimana aktivitas antioksidan tempe berbahan baku koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dari kedelai dan produk tempenya serta beberapa antioksidan alami ( α-tokoferol, β-karoten, dan asam askorbat) maupun antioksidan sintetis (BHT)? C. Tujuan Penelitian Adapun tujuan dari penelitian yang dilakukan adalah : 1. Mengetahui lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak etanol tempe berbahan baku kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok dengan aktivitas antioksidan yang optimum pada perlakuan fermentasi (0, 1, 2, 3, 4 hari). 2. Mengetahui Isoflavon jenis apa saja yang terkandung dalam tempe berbahan baku koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari) 3. Mengetahui aktivitas antioksidan tempe berbahan baku koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya bila dibandingkan dengan ekstrak etanol dari kedelai dan produk tempenya serta beberapa antioksidan alami (α-tokoferol, β-karoten, dan asam askorbat) maupun antioksidan sintetis (BHT). D. Manfaat Penelitian Adapun manfaat dari penelitian yang dilakukan adalah : 1. Secara teoritis : a. Mengetahui jenis-jenis kandungan senyawa isoflavon yang terdapat dalam koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya berdasarkan variasi lama waktu fermentasi.

7 7 b. Mengetahui sejauh mana manfaat koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya sebagai sumber antioksidan alami. c. Diharapkan dapat dijadikan sebagai referensi bagi penelitian selanjutnya mengenai aktivitas antioksidan dan kandungan senyawa isoflavon dari jenis legum lainnya. 2. Secara praktis : a. Dapat memberikan informasi pada masyarakat mengenai kandungan isoflavon dan aktivitas antioksidan dalam biji dan tempe koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam yang berguna bagi kesehatan b. Sebagai bahan alternatif pengganti kedelai dan pengembangan produk tempe dari biji kacang-kacangan atau leguminoceae.

8 8 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. LEGUMINOCEAE Legume adalah tanaman dikotyl setahun dan tahunan; sebagian besar legume sayuran dan legume bijian yang dibudidayakan adalah tanaman setahun. Legum bijian, sering dikenal sebagai tanaman kacang bijian, adalah tanaman serealia bijian terpenting kedua sebagai sumber pangan utama dunia (Rubatski dan Yamaguchi, 1997). 1. Kedelai Hitam (Glycine soja) Berdasarkan warna bijinya dikenal kedelai putih (Glycine max.) dan kedelai hitam (Glycine soja). Kedelai putih membutuhkan tanah yang lebih subur, serta memerlukan pengairan dan pemeliharaan lebih baik dari pada kedelai hitam. Kedelai hitam umunya hanya digunakan untuk bahan baku kecap, sedangkan kedelai putih untuk bahan baku tempe dan tahu serta makanan lainnya (tauco dan lain-lain). Biji kedelai adalah hasil yang paling utama untuk diambil dan dimanfaatkan (Yamaguchi dan Rubatski, 1997). Kedelai yang dibudidayakan sebenarnya terdiri dari paling tidak dua spesies: Glycine max (disebut kedelai putih, yang bijinya bisa berwarna kuning, agak putih, atau hijau) dan Glycine soja (kedelai hitam, berbiji hitam). Glycine max merupakan tanaman asli daerah Asia subtropik seperti RRC dan Jepang selatan, sementara Glycine soja merupakan tanaman asli Asia tropis di Asia

9 9 tenggara. Tanaman ini telah menyebar ke Jepang, Korea, Asia Tenggara dan Indonesia. Menurut Tjitrosoepomo, G. (1996) kedudukan tanaman kedelai dalam sistematik tumbuhan (taksonomi) diklasifikasikan sebagai berikut : Kerajaan : Plantae Filum Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Fabales : Fabaceae : Glycine : Glycine soja (L.) ( Martin dan Leonardo, 1962 dalam Tjitrosoepomo. G., 1996). Kedelai termasuk keluarga kacang-kacangan yang berasal dari asia. Kedelai ditanam lebih dari 5000 ribu tahun yang lalu dinegeri Cina. Dunia barat baru mengenal kedelai pada tahun Namun, pada tahun 1905 dunia mengenal kedelai berbentuk bulat panjang atau pipih dengan tinggi pohon sekitar cm. Amerika, Brazil, Cina dan Argentina adalah negara terbesar di dunia penghasil kedelai. Indonesia sudah melakukan penanaman kedelai sejak tahun 1750 terutama di pulau Jawa dan Bali (Lamina, 1989). Biji kedelai kaya akan protein dan lemak serta beberapa bahan gizi penting lain, misalnya vitamin dan lesitin. Karena ini jugalah, kedelai banyak dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan makanan, seperti tahu, tempe, kecap, susu kedelai hingga tepung kedelai. Secara morfologi kedelai hitam merupakan tanaman dikotil semusim dengan percabangan sedikit, sistem perakaran akar tunggang, dan batang

10 10 berkambium. Kedelai dapat berubah penampilan menjadi tumbuhan setengah merambat dalam keadaan pencahayaan rendah. Kedelai, khususnya kedelai putih dari daerah subtropik, juga merupakan tanaman hari-pendek dengan waktu kritis rata-rata 13 jam. Ia akan segera berbunga apabila pada masa siap berbunga panjang hari kurang dari 13 jam. Ini menjelaskan rendahnya produksi di daerah tropika, karena tanaman terlalu dini berbunga. Perilaku pembungaan berbeda-beda, mulai dari sangat tidak terbatas hingga sangat terbatas. Saat berbunga bergantung pada kultivar dan dapat beragam dari 80 hari hingga mencapai 150 hari setelah tanam. Bunga berwarna putih agak ungu pucat, dan dapat menyerbuk sendiri. Polongnya, yang berkembang dalam kelompok, biasanya mengandung 2-3 biji yang berbentuk bundar atau pipih, dan sangat kaya akan protein dan minyak. Warna biji berbedabeda menurut kultivar (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997). Gambar 1. Tanaman kedelai hitam ( Kegunaan pangan umumnya berkorelasi dengan warna biji. Biji berwarna hijau dan kuning diproduksi terutama untuk sayuran (biji yang dapat dimakan). Kultivar berbiji besar warna kuning digunakan untuk membuat tahu. Umumnya, kultivar berbiji kuning kecil kaya akan minyak dan memiliki kandungan protein rendah, sedangkan kultivar berbiji hitam memiliki kandungan protein tinggi dan kandungan minyak rendah. Bergantung pada tipe biji, kandungan karbohidrat

11 11 dapat berkisar 15-25%, protein mencapai 50% dan kultivar tertentu mengandung minyak hingga 25%. Polong kultivar minyak biji umumnya mengandung 1-2 biji, sedangkan kultivar sayuran biasanya 2-3 biji (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997). Gambar 2. Biji Kedelai Kuning mentah Gambar 3. Biji Kedelai hitam mentah Kedelai yang berkulit hitam saat ini sedang menjadi incaran peneliti gizi dan kesehatan. Karena ternyata, di dalam kedelai hitam mengandung antosianin. Antosianin tersebut sangat potensial mencegah proses oksidasi yang terjadi secara dini dan menimbulkan penyakit degeneratif. Oksidasi LDL akan memicu berkembangnya penyakit tekanan darah tinggi dan berkembangnya penyakit jantung koroner, stroke dan beragam penyakit berbahaya lainnya (Astuti, 1995).

12 12 Antosianin dari kulit kedelai mampu menghambat oksidasi LDL kolesterol, dengan rajin mengonsumsi tempe dan produk olahan kedelai hitam sebanyak 150 gram/ hari mampu menurunkan kadar kolesterol. Alangkah sayangnya jika selama ini masyarakat hanya mendengar manfaat antosianin di dalam buah blueberry. Padahal kenyataannya, kandungan antosianin di dalam kedelai hitam lebih besar dibandingkan blueberry. Selain mampu menghambat oksidasi LDL, kandungan flavonoid yang dimiliki kedelai hitam dapat berfungsi sebagai antikanker. Kandungan flavonoid,banyak ditemukan dalam buah-buahan, sayur-sayuran, dan biji-bijian. Tidak hanya berfungsi sebagai antioksidan, kedelai hitam mampu mengurangi gejala- gejala menopause pada wanita. Karena struktur kedelai mirip dengan struktur hormon estrogen. Salah satu senyawa yang menyerupai estrogen yang terdapat di dalam tanaman adalah isoflavon. Di samping itu, kedelai hitam dapat menghambat penuaan dini pada wanita jika dikonsumsi secara rutin. Olahan kedelai hitam memang tidak semenarik kedelai kuning. Misalnya, olahan kedelai hitam menjadi tahu akan berwarna abu-abu. Sehingga tidak jarang produk olahan kedelai hitam malah dihindari konsumen ( 2. Koro Hitam (Lablab purpureus) Tanaman yang hampir mirip dengan kedelai hitam ini sering disebut dengan kacang India atau kacang Mesir. Warna yang mirip dengan kedelai hitam tetapi lebih legam daripada kedelai hitam dan bentuk yang sedikit lebih besar, kurang banyak dimanfaatkan oleh para pengguna jenis legume, karena tekstur yang keras dan berkulit tebal. Kedudukan tanaman Koro hitam dalam sistematik tumbuhan (taksonomi) dapat diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae

13 13 Division Class Ordo Family Genus Species : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Fabales : Fabaceae : Lablab : Lablab purpureus ( Martin dan Leonardo, 1962 dalam Tjitrosoepomo, 1996). Secara morfologi tanaman ini adalah tanaman tahunan berumur pendek, tetapi terutama ditanam sebagai tanaman setahun untuk menghasilkan polong yang dapat dimakan. Tanaman ini tumbuh baik mulai dari ketinggian permukaan laut hingga dataran tinggi (2200 m) dan di wilayah dengan curah hujan rendah dan suhu tinggi, serta toleran terhadap genangan. Tanaman koro hitam memiliki pola pertumbuhan merambat dengan panjang batang jalar mencapai 6-10 cm jika dilanjari. Daun trifoliatnya besar (15 cm), berbentuk mirip belah ketupat dan berperan dalam memproduksi biomassa dalam jumlah besar. Bunga berwarna putih, merah jambu, atau ungu kebanyakan menyerbuk sendiri. Polong berwarna hijau atau ungu berbentuk rampin pipih, oblong dan sering melengkung. Panen dilakukan ketika polong mencapai panjang 5-10 cm, dan sebelum biji matang. Polong mengandung tiga hingga enam biji kecil bundar matang sempurna dalam waktu 3-5 bulan. Gambar 4. Tanaman koro hitam (

14 14 Warna biji biasanya putih atau hitam tetapi kadang-kadang ditemukan juga warna coklat kemerahan dan berbintik-bintik, semuanya memiliki hilum (pusar biji)putih, panjang dan terlihat jelas. Kultivar berbiji putih mengandung glukosida sianogenik dan penghambat tripsin dalam jumlah kecil sehingga tidak beracun sedangkan kultivar berbiji gelap mengandung kedua senyawa tersebut dalam jumlah besar. Polong tanaman koro hitam mengandung 4-5% protein. Biji kering memiliki kandungan karbohidrat 50-60% dan protein 20-25% (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997). Gambar 5. Koro hitam mentah Tanaman dan biji koro hitam belum begitu banyak ditemukan kegunaan dan manfaatnya, karena tanaman dan biji koro hitam hanya digunakan sebagai campuran sayur bagi masyarakat pedesaan. 3. Koro Kratok (Phaseolus lunatus) Budidaya tanaman ini tersebar luas, mulai dari wilayah utara Brazil hingga menjadi tanaman kacang pangan pokok penting di beberapa wilayah afrika dan asia Tenggara. Peninggalan koro kratok berbiji kecil yang ditemukan di Amerika Tengah telah berumur sekitar 2000 tahun. Tipe liar tanaman ini selanjutnya ditemukan di Meksiko, Amerika Tengah dan seluruh wilayah Andes. Kedudukan tanaman Koro hitam dalam sistematik tumbuhan (taksonomi) dapat diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae

15 15 Division Class Ordo Family Genus : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Fabales : Fabaceae : Phaseolus Species : Phaseolus lunatus (Tjitrosoepomo, 1996). Secara morfologi tanaman ini mempunyai biji agak berbentuk bulan, panjang polong oblong yang agak melengkung berkisar antara 5 hingga 15 cm dengan lebar 2-3 cm. Sebagian besar kultivar biasanya mengandung 2-4 biji, walaupun ada yang berisi hingga 6 biji. Polong kultivar tertentu gemuk; yang lain agak ramping. Biji besar pipih dan oblong pada tipe tanaman tertentu memiliki panjang hingga 3 cm. Tipe biji yang lain juga pipih, tetapi agak bundar dan panjangnya sekitar 1 cm; permukaan biji kedua tipe ini rata. Kultivar yang umum ditanam memilki warna kulit biji hijau muda atau putih; yang lain dapat berwarna merah, ungu, coklat, atau hitam. Dua kotiledon daun biji besar merupakan bagia terbesar dari volume biji. Biji tipe liar memiliki kandungan glukosida sianogenik tinggi dan harus direndam sebelum atau selama pemasakan (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997). Gambar 6. Koro kratok mentah

16 16 Lima Gambar 7. Biji koro kratok yang masih muda ( Kandungan gizi biji koro kratok dalam 100 gram adalah protein 14,66g; serat fiber 13,16g; folate 156,23g; zat besi 4,49mg; phosphor 208,68mg; magnesium 80,84mg dan vitamin B1 (thiamin) 0,30mg ( Larco, 2001). Kandungan gizi koro kratok dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Kandungan beberapa zat biji koro kratok per 100 gram Zat Gizi Kandungan Protein g Serat pangan g Vitamin B1 (thiamin) 0.30 mg Zat besi 4.49 mg Copper 0.44 mg Phosphor mg Magnesium mg Mangan 0.97 mg Potassium mg Folate mcg Tryptophan 0.17 g Sumber : Larco Hoyle, Rafael B. TEMPE Tempe secara luas dikenal sebagai makanan khas Indonesia, dan sangat digemari oleh masyarakat Jawa. Ada berbagai macam tempe di Indonesia seperti misalnya tempe gembus dibuat dari ampas tahu, tempe lamtoro dibuat dari biji lamtoro, tempe benguk dibuat dari biji koro benguk, tempe koro dibuat dari koro, tempe bongkrek dibuat dari ampas kelapa, tempe gude dibuat dari kacang gude dan tempe kedelai dibuat dari kedelai. Dari beberapa jenis tempe tersebut yang

17 17 paling banyak digemari masyarakat adalah tempe kedelai. Tempe dibuat dengan proses fermentasi kedelai dengan kapang jenis Rhizopus. Tempe merupakan makanan bergizi tinggi sehingga makanan ini mempunyai arti strategis dan sangat penting untuk pemenuhan gizi. Lebih dari itu, tempe mempunyai keunggulan-keunggulan lain, yaitu mempunyai kandungan senyawa aktif; teknologi pembuatannya sederhana; harganya murah; mempunyai citarasa yang enak; dan mudah dimasak Tempe bermutu tinggi bila kacang terlekat dengan jalinan miselium putih. Jika proses fermentasi dibiarkan terlalu lama, spora hitam mungkin terbentuk di permukaan. Spora tersebut tidak berbahaya namun mempengaruhi kenampakan dan penerimaan konsumen ( Anonim a, 2008). Tempe mempunyai ciri-ciri berwarna putih, tekstur kompak dan flavour spesifik. Warna putih disebabkan adanya miselia jamur yang tumbuh pada permukaan biji-bijian. Tekstur yang kompak juga disebabkan oleh miselia-miselia jamur yang menghubungkan antara biji-biji. Sedangkan flavour yang spesifik disebabkan oleh terjadinya degradasi komponen-komponen dalam kedelai selama fermentasi ( Kasmidjo, 1990 dalam Supriyadi, 1998). 1. Tempe Kedelai Tempe tergolong sebagai makanan hasil fermentasi oleh jamur Rhizopus s.p. Tempe adalah produk fermentasi yang amat dikenal oleh masyarakat Indonesia. Tempe dapat dibuat dari berbagai bahan. Tetapi yang biasanya dikenal sebagai tempe oleh masyarakat pada umumnya ialah tempe yang dibuat dari kedelai (Astuti, 1995). Tempe berpotensi untuk digunakan melawan radikal bebas, sehingga dapat menghambat proses penuaan dan mencegah terjadinya penyakit degeneratif (aterosklerosis, jantung koroner, diabetes melitus, kanker, dan lainlain). Selain itu tempe juga mengandung zat antibakteri penyebab diare, penurun kolesterol darah, pencegah penyakit jantung, hipertensi, dan lain-lain.

18 18 Komposisi gizi tempe baik kadar protein, lemak, dan karbohidratnya tidak banyak berubah dibandingkan dengan kedelai. Namun, karena adanya enzim pencernaan yang dihasilkan oleh kapang tempe, maka protein, lemak, dan karbohidrat pada tempe menjadi lebih mudah dicerna di dalam tubuh dibandingkan yang terdapat dalam kedelai. Oleh karena itu, tempe sangat baik untuk diberikan kepada segala kelompok umur (dari bayi hingga lansia), sehingga bisa disebut sebagai makanan semua umur. Dibandingkan dengan kedelai, terjadi beberapa hal yang menguntungkan pada tempe. 2. Tempe Non Kedelai Selain tempe berbahan dasar kacang kedelai, terdapat pula berbagai jenis makanan berbahan bukan kedelai yang juga disebut tempe. Terdapat 2 golongan besar tempe menurut bahan bahan dasarnya, yaitu tempe berbahan dasar Legume dan tempe berbahan dasar non-legume (Astawan M, 2003). Tempe bukan kedelai yang berbahan dasar legume mencakup tempe koro benguk (dari biji koro benguk (Mucuna pruriens, L.) berasal dari sekitar Waduk Kedungombo (Handayani, 1992), tempe gude (dari kacang gude/cajanus cajan), tempe gembus dari ampas tahu/ampas gude (populer didaerah Lombok dan Bali), tempe kacang hijau (dari kacang hijau terkenal didaerah Yogyakarta), tempe kacang kecipir (dari biji kecipir (Psopocaarpus tetragonolobus), tempe koro pedang (dari biji koro pedang Canavalia ensiformis, tempe lupin dari lupin, Lupinus Angustifolius), tempe kacang merah (dari kacang merah, Phaseolus vulgaris), tempe kacang tunggak (dari kacang tunggak, Vigna unguiculata), tempe koro wedhus (dari biji koro wedhus, Lablab purpureus), tempe koro (dari koro kratok, Phaseolus lunatus banyak ditemukan di Amerika utara), dan tempe menjes (dari kacang tanah dan kelapa terkenal disekitar Malang). Tempe berbahan dasar non-legume mencakup tempe mungur (dari biji mungur, Entrolobium samon), tempe bongkrek dari bungkil kapuk atau ampas

19 19 kelapa yang terkenal didaerah Banyumas, tempe jamur merang (dari jamur merang) (Astawan, 2003) Kacang gude, komak, dan koro benguk, dan koro pedang biji putih/biji merah dapat dibuat tempe. Masyarakat Trenggalek (Jawa Timur) biasa mengkonsumsi tempe koro pedang. Biji kacang-kacangan tersebut memiliki kulit yang keras sehingga sebelum dibuat tempe perlu pengupasan kulit biji secara mekanis. Komak, koro benguk dan koro pedang mengandung senyawa beracun, sehingga dalam pembuatan tempe, setelah kulit biji dikupas, direbus dengan air yang dicampur abu kapus dan selanjutnya biji direndam dalam air dua kali selama selama dua hari dua malam agar kandungan racun dapat dinetralkan. Perendaman terbaik bila dilakukan pada air yang mengalir, bila hal tersebut tidak dapat dilakukan (air tetap), maka air perlu sering diganti agar terhindar dari aroma kurang sedap. Proses selanjutnya, termasuk jenis ragi yang digunakan relatif sama dengan pembuatan tempe kedelai ( 3. Fermentasi Tempe Fermentasi adalah proses kimiawi yang komplek sebagai akibat pertumbuhan maupun metabolisme mikroba yang merubah bahan-bahan mentah yang murah bahkan tidak berharga menjadi produk-produk yang bernilai ekonomi tinggi. Proses kimiawi yang terjadi disebabkan oleh enzim dan enzim yang berperan dihasilkan oleh mikroorganisme atau telah ada dalam bahan pangan. Fermentasi bahan makanan menyebabkan perubahan fisik dan kimia yang menguntungkan seperti flavour, aroma, tekstur, daya cerna dan daya simpan (Astuti, 1995). Fermentasi merupakan suatu proses oksidasi karbohidrat anaerob (Samson et al., 1988) dan merupakan hasil kegiatan beberapa jenis organisme, yaitu beribu-ribu jenis bakteri, khamir, dan kapang yang telah dikenal. Jadi mikroba yang digunakan dalam proses fermentasi merupakan unsur penentu

20 20 terhadap berhasil atau tidaknya proses fermentasi bersangkutan. Hasil fermentasi merupakan bagian penting dalam menu makanan dunia. Fermentasi mengakibatkan perubahan karbohidrat dari bahan pangan, tetapi kerugian ini dapat tertutup oleh keuntungan yang diperoleh. Protein, lemak, dan polisakarida dapat dihidrolisis sehingga bahan pangan hasil fermentasi dapat lebih mudah dicerna. Fermentasi menyebabkan perubahan flavour yang dipertimbangkan lebih disukai daripada bahan bakunya (Sutardi and Bucle, 1985). Sifat-sifat bahan pangan hasil fermentasi ditentukan oleh mutu dan sifat-sifat asal bahan pangan, perubahan yang terjadi sebagai hasil fermentasi mikroorganisme dan interaksi yang terjadi diantara kegiatan-kegiatan tersebut dan zat-zat yang merupakan pembentuk bahan pangan tersebut (Sutardi and Bucle, 1985). Proses pengolahan tempe pada umumnya meliputi tahap pencucian, perendaman bahan mentah, perebusan, pengulitan, pengukusan, penirisan dan pendinginan, inokulasi, pemanasan, kemudian pemeraman 2-3 hari. Perendaman mengakibatkan ukuran biji menjadi lebih besar dan stuktur kulit mengalami perubahan sehingga lebih mudah dikupas. Perebusan dan pengukusan selain menaikkan biji dimaksud untuk membunuh bakteri kontaminan dan mengurangi zat antigizi. Penirisan dan pendinginan bertujuan mengurangi kadar air dalam biji dan menurunkan suhu biji sampai sesuai dengan kondisi pertumbuhan jamur (Samson, 1987). Fujimaki (1968) melaporkan selama fermentasi terjadi perubahan enzimatik yaitu bau dan rasa karena adanya aktivitas enzim protease. Selama fermentasi miselia jamur yang berwarna putih akan menyelubungi permukaan tempe. Jamur akan mengeluarkan enzim-enzim yang dapat memecah komponen dalam bahan yaitu lemak, protein dan karbohidrat menjadi bahan yang lebih sederhana ( Fujimaki, 1968).

21 21 Aktivitas mikroorganisme didalam proses pembuatan tempe secara tradisional terutama terdapat 2 tahapan proses yaitu pada : 1) Proses Fermentasi Awal (Fermentasi I) Proses perendaman dilakukan terhadap kedelai yang telah direbus dan atau dikuliti selama semalaman (12 jam), pada temperatur kamar ( C), dengan menggunakan air tanah atu air kran. Pada proses ini terjadi proses fermentasi awal oleh bakteri pembentuk asamasam organik. Tujuan utama proses ini adalah untuk pengasaman kedelai. Untuk maksud pengasaman ini, maka pada proses perendaman dilakukan inokulasi bakteri pembentuk asam yaitu dengan menambahkan air ke dalam rendaman dari proses perendaman sebelumnya, sehingga tahapan ini disebut merupakan proses fermentasi I. Dengan kondisi demikian (12 jam perendaman) terjadi proses pembentukan asam-asam organik oleh bakteri pembentuk asam/pengasaman. Sedangkan pada koro proses perendamannya 3 x 24 jam untuk menghilangkan senyawa sianida (HCN) (Handayani, 1992). 2) Proses Fermentasi Utama (pemeraman) Mikroorganisme yang berperan utama didalam pembuatan tempe adalah kapang Rhizopus oligosporus. Aktivitas fisiologis kapang pada proses fermentasi tempe dimulai sejak diinokulasinya inokulum (ragi tempe) pada kedelai yang telah siap difermentasikan yaitu kedelai dan berbagai jenis koro masak yang telah yang telah dikuliti dan ditiriskan. Spora kapang tersebut mulai tumbuh berkecambah dengan membentuk benang-benang hifa yang makin tumbuh memanjang membalut dan menembus biji koteledon kedelai. Apabila benang-benang tersebut telah sedemikian padat, maka terbentuklah tempe yang kompak, putih dan dengan aroma khas tempe. Secara keseluruhan tahapan ini disebut sebagai proses fermentasi II.

22 22 4. Kapang Tempe Mikroorganisme yang berperan utama di dalam pembuatan tempe adalah kapang Rhizopus sp. Didalam klasifikasi, kapang ini digolongkan ke dalam genus Rhizopus, familia Mucoraceae, ordo Mucorales, subklass Zygomicotina, dan klass zygomycetes (Hesseltine, 1985). Kapang yang tergolong dalam genus Rhizopus sp. ditandai dalam sel vegetatif yang berupa benang yang disebut hifa/misellium yang membentuk stolon-stolon (semacam ruas/buku) yang dilengkapi dengan rhizoid (mirip akar) yang tumbuh bercabang-cabang masuk kedalam substrat. Pada tempat tumbuhnya rhizoid terdapat sporangiospora yang tumbuh mengarah keudara (berlawanan arah dengan rhizoid) dan dari tempat inilah terbentuk spora didalam spora didalam suatu sporangium. Kapang jenis Rhizopus sp. mempunyai sifat tumbuh cepat dan membentuk koloni yang terdiri dari benang-benang misellia. Hesseltin (1966 dalam Pawiroharsono, 1995), menambahkan bahwa aktivitas fisiologis kapang pada proses fermentasi tempe dimulai sejak diinokulasikanya inokulum (ragi tempe) pada kedelai yang telah siap difermentasikan yaitu kedelai masak yang telah dikuliti dan ditiriskan. Spora kapang tersebut mulai tumbuh berkecambah dengan membentuk benangbenang hifa yang makin tumbuh memanjang membalut dan menembus biji kotiledone kedelai. Apabila benang-benang tersebut telah sedemikian padat maka terbentuklah tempe yang kompak, putih dan dengan aroma khas tempe.

23 23 Rhizopus sebagai kapang pemeran utama dalam proses pembuatan tempe, jenis kapang ini telah terbukti dapat memfermentasikan kedelai dan membentuk tempe secara sempurna. Waktu yang dibutuhkan sampai terbentuk tempe secara sempurna jam (Samson et al., dalam Sutardi, 1988) Selama proses fermentasi berlangsung, kedelai berubah menjadi tempe dan perubahan tersebut pada dasarnya dapat dibedakan sebagai perubahan secara fisik dan secara kimia. Perubahan sifat fisik tempe dibandingkan dengan kedelai antara lain, bertekstur kompak, warna putih dengan aroma khas tempe. Perubahan secara kimia ditandai dengan terjadinya hidrolisis senyawa-senyawa komplek (protein, karbohidrat, lemak) menjadi senyawa yang lebih sederhana dan mudah dicerna. Disamping itu masih terdapat berbagai senyawa baru yang disintesis selama fermentasi yang bermanfaat untuk kesehatan seperti asam lemak tidak jenuh, isoflavon faktor II (Hesseltin, 1966 dalam Pawiroharsono, 1995). C. ISOFLAVON Senyawa isoflavon merupakan senyawa metabolit sekunder yang banyak disintesis oleh tanaman. Namun, tidak sebagai layaknya senyawa metabolit sekunder karena senyawa ini tidak disintesa oleh mikroorganisme. Dengan demikian, mikroorganisma tidak mempunyai kandungan senyawa ini. Oleh karena itu, tanaman merupakan sumber utama senyawa isoflavon di alam. Dari beberapa jenis tanaman, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada tanaman Leguminoceae, khususnya pada tanaman kedelai. Pada tanaman kedelai, kandungan isoflavon yang lebih tinggi terdapat pada biji kedelai, khususnya pada bagian hipokotil (germ) yang akan tumbuh menjadi tanaman. Sebagian lagi terdapat pada kotiledon yang akan menjadi daun pertama dari tanaman (Pradana, 2008). 1. Isoflavon Pada Kedelai

24 24 Mengingat berbagai potensi kedelai sebagai sumber gizi dan senyawa aktif serta prospeknya untuk dikembangkannya produk-produk baru, kedelai banyak disebut sebagai The golden bean, the miracle bean, food for the future. (Pradana, 2008). Kandungan isoflavon pada kedelai berkisar 2--4 mg/g kedelai. Senyawa isoflavon ini pada umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan glukosida. Jenis senyawa isoflavon ini terutama adalah genistin, daidzin, dan glisitin (Pradana, 2008). Sebanyak 99% isoflavon pada kedelai dalam bentuk glikosida (yang berikatan dengan glikosa), yang terdiri dari 64% genistin, 23% daidzin, dan 13% glisitin (Naim et al., (1974). Genestein dan deidzin serta konjugat glukosidanya berada dalam konsentrasi diatas tiga milligram per 1 biji kedelai (Walter, 1941). Isoflavon yang dominan pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida, sedangkan yang dominan pada produk kedelai yang mengalami fermentasi adalah aglikon (Coward et al., 1993). Bentuk glikosida dipertahankan oleh tanaman sebagai bentuk inaktif sehingga dibutuhkan sebagai antioksidan. Bentuk aktif glikosida adalah aglukon, yang dihasilkan dari pelepasan glukosa dan glikosida (Anderson et al., 1998). Isoflavon kedelai dapat menurunkan resiko penyakit jantung dengan membantu menurunkan kadar kolesterol darah. Protein kedelai telah terbukti mempunyai efek menurunkan kolesterol, yang di percaya karena adanya isoflavon di dalam protein tersebut. Studi epidemologi juga telah membuktikan bahwa masyarakat yang secara teratur mengkonsumsi makanan dari kedelai, memiliki kasus kanker payudara, kolon dan prostat yang lebih rendah. Isoflavon kedelai juga terbukti, melalui penelitian in vitro dapat menghambat enzim tirosin kinase, oleh karena itu dapat menghambat perkembangan sel-sel kanker dan angiogenesis. Hal ini berarti suatu tumor tidak dapat membuat pembuluh darah baru, sehingga

25 25 tidak dapat tumbuh (Koswara, 2006). Peranan isoflavon dalam membantu menurunkan osteoporosis juga telah diteliti. Konsumsi protein kedelai dengan isoflavon telah terbukti dapat mencegah kerapuhan tulang pada tikus yang digunakan sebagai model untuk penelitian osteoporosis. Studi yang lain menunjukkan hasil yang sama pada saat menggunakan genistein saja. Ipriflavone, obat yang dimetabolisme menjadi daidzein telah terbukti dapat menghambat kehilangan kalsium melalui urine pada wanita post monopouse (Koswara, 2006). Produk kedelai yang mengandung isoflavon dapat membantu pengobatan simptom monopouse. Pada wanita yang memproduksi sedikit estrogen, isoflavon (phitoestrogen) dapat menghasilkan cukup aktivitas estrogen untuk mengatasi symptom akibat monopouse, misalnya hot flashes. Suatu penelitian menunjukkan bahwa wanita yang mengkonsumsi 48 gram tepung kedelai per hari mengalami gejala hot flashes 40 % lebih rendah (Koswara, 2006). Makanan yang terbuat dari kedelai mempunyai jumlah isoflavon yang bervariasi, tergantung bagaimana mereka diproses. Makanan dari kedelai seperti tahu, susu kedelai, tepung kedelai dan kedelai utuh mempunyai kandungan isoflavon berkisar antara mg/100 gram. Kecap dan minyak kedelai tidak mengandung isoflavon. Produk kedelai yang digunakan sebagai bahan tambahan pangan, seperti isolat dan konsentrat protein kedelai mempunyai kandungan isoflavon yang bervariasi, tergantung bagaimana proses pengolahannya. Misalnya, hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan alkohol dalam proses ekstraksi menghasilkan kadar isoflavon yang rendah (Koswara, 2006).

26 26 Tabel 2. Struktur Daidzin, Genistin dan Glisitin Nama Senyawa Struktur Genistin H OH H CH 2 OH H OH O H OH O OH O O OH Glisitin H H OH OH H CH 2 OH O H OH O H 3 CO O O OH Daidzin HOH 2 C H H HO OH H O H OH O O O OH 2. Isoflavon Pada Tempe Kedelai Pada kedelai mengalami berbagai perubahan pada proses pembuatan tempe baik oleh proses fisik maupun proses enzimatik oleh adanya aktivitas mikroorganisme. Keterlibatan mikroorganisme pada proses pembuatan tempe

27 27 terutama terjadi pada proses perendaman oleh bakteri-bakteri pembentuk asam dan proses fermentasi oleh kapang khususnya Rhizopus oligosporus. Sebagai akibat perubahan-perubahan tersebut tempe menjadi lebih enak, lebih bergizi, dan lebih mudah dicerna. Salah satu factor penting dalam perubahan tersebut adalah terbebasnya senyawa-senyawa isoflavon dalam bentuk bebas (aglukon), dan teristimewa hadirnya Faktor-II, yang terdapat pada tempe tetapi tidak terdapat pada kedelai, ternyata berpotensi tinggi (dibanding dengan jenis isoflavon yang lainnya) sebagai antioksidan (Gyorgy dkk., 1964), antihemolitik (Murata, 1985), penurun tekanan darah, anti kanker (Zilleken, 1986), dan sebagainya Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses nonfermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglukan yang lebih tinggi aktivitasnya. Senyawa aglukan tersebut adalah genistein, daidzein dan glisitein (Pawiroharsono, 2001). Struktur dan sifat kimia daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2 ditampilkan pada Gambar 8, 9, 10, dan 11. HO O Daidzein O OH Nama Kimia : Daidzein, 7,4 -dihidroksi isoflavon Rumus Molekul : C 15 H 10 O 4 Kelarutan : Tidak larut dalam air Gambar 8. Struktur dan Sifat Kimia Daidzein (Ariani, 2009)

28 28 HO O OH Genistein O OH Nama Kimia : Genistein, 5,7,4 -trihidroksi isoflavon Rumus Molekul : C 15 H 10 O 5 Kelarutan : Larut dalam metanol dan etanol Gambar 9. Struktur dan Sifat Kimia Genistein (Ariani, 2009) HO O H 3 CO O Glisitein OH Nama Kimia : Glisitein, 6-metoksi-7,4 -trihidroksi isoflavon Rumus Molekul : C 16 H 12 O 5 Kelarutan : Tidak larut dalam air Gambar 10. Struktur dan Sifat Kimia Glisitein (Ariani, 2009) HO O HO O OH Faktor II Nama Kimia : Faktor-2, 6,7,4 -trihidroksi isoflavon Rumus Molekul : C 15 H 10 O 5

29 29 Kelarutan : Tidak larut dalam air Gambar 11. Struktur dan Sifat Kimia faktor-2 (Ariani, 2009) 3. Metabolisme Isoflavon pada Proses Pengolahan Kedelai menjadi Tempe Senyawa isoflavon merupakan salah satu komponen yang juga mengalami metabolisme. Senyawa isoflavon ini pada kedelai berbentuk senyawa konjugat dengan senyawa gula melalui ikatan -O- glikosidik. Senyawa isoflavon aglukon ini dapat mengalami transformasi lebih lanjut membentuk senyawa transforman baru. Hasil transformasi lebih lanjut dari senyawa aglukon ini justru menghasilkan senyawa-senyawa yang mempunyai aktivitas biologi lebih tinggi. Hal ini terlihat pada Faktor-II, yang mempunyai aktivitas antioksidan dan antihemolisis lebih baik dari daidzein dan genistein. Selain itu, telah ditemukan bahwa senyawa isoflavon lebih aktif 10 kali dari senyawa karboksikroman. Faktor-II merupakan senyawa yang sangat menarik perhatian, karena senyawa ini tidak terdapat pada kedelai dan hanya terdapat pada tempe. Senyawa ini terbentuk selama proses fermentasi oleh aktivitas mikroorganisme. Senyawa ini mula-mula ditemukan kembali oleh Gyorgy (1964) pada ekstrak tepung tempe. Perkembangan selanjutnya terbukti bahwa Faktor-II tersebut pada kedelai jumlahnya sangat kecil. Setelah fermentasi, Faktor-II akan dibebaskan walaupun jumlahnya sangat kecil. Faktor-II dipandang sebagai senyawa yang sangat prospektif sebagai senyawa antioksidan (10 kali aktivitas dari vitamin A atau karboksi kroman dan sekitar 3 kali dari senyawa isoflavon aglukon lainnya pada tempe) serta antihemolitik. Dengan demikian, karakterisasi mikroorganisme transforman Faktor-II perlu diteliti. Menurut penelitian Barz et al. (1993) biosintesis Faktor-II dihasilkan melalui demetilasi glisitein oleh bakteri Brevibacterium epidermis dan Micrococcus luteus atau melalui reaksi hidroksilasi daidzein. Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses nonfermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui

30 30 proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglukan yang lebih tinggi aktivitasnya. Senyawa isoflavon aglukan daidzein dan genistein dapat mengalami transformasi lebih lanjut membentuk senyawa baru, yaitu faktor-2 (Pawiroharsono, 2001 ). Senyawa faktor-2 ini tidak dijumpai pada kedelai yang tidak difermentasi (Ariani, 2001). 4. Manfaat Senyawa Isoflavon Pada Tempe Kedelai Isoflavon pada tempe dapat mencegah aktivitas sel menjadi sel kanker, tetapi juga dapat memperbaiki metabolisme hormon steroid, menurunkan kolesterol dan trigleserida, serta melindungi sel-sel hati dari paparan senyawa beracun. Selain itu Isoflavon juga dapat berfungsi untuk memperlancar sirkulasi darah. Isoflavon mempunyai beberapa efek positif dari isoflavon adalah antiadrenalin, yang membuat jantung bekerja lebih santai, di samping antiperadangan serta mencegah ketidak teraturan denyut jantung Khususnya isoflavon pada tempe yang aktif sebagai antioksidan, yaitu Faktor-2, terbukti berpotensi sebagai anti-kontriksi (penyempitan) pembuluh darah dan juga berpotensi menghambat pembentukan LDL (low density lipoprotein). Dengan demikian, isoflavon dapat mengurangi terjadinya arteriosclerosis pada pembuluh darah. Zat yang terkandung dalam hasil olahan kedelai ini dapat berfungsi pula untuk mencegah terjadinya kerusakan permukaan dinding pembuluh darah jantung (koroner), tetapi sekaligus memperbaikinya. Termasuk pula mengikis endapan kolesterol pada dinding pembuluh darah koroner. Hasil olahan kedelai lain seperti minyak kedelai, juga dapat menangkal kolesterol. Menurut Zilliken (1987), Faktor-II merupakan senyawa isoflavon yang paling besar pengaruhnya, karena itulah isoflavon menumbuhkan harapan cerah pada pencegahan dan penurunan kejadian penyakit jantung. Manfaat senyawa isoflavon adalah sebagai

31 31 Antitumor atau Antikanker, Antivirus, Antikolesterol, Antialergi, berpengaruh pada sistem Sirkulasi dan Mencegah Jantung Koroner, Membantu Produksi Hormon Estrogen dan Mencegah Osteoporosis (Pawiroharsono, 1995) D. ANTIOKSIDAN Antioksidan dapat berasal dari dalam tubuh dan luar tubuh. Didalam tubuh kita memiliki sistem enzym antioksidan yang bekerja secara simultan mematabolisme radikal bebas sehingga tidak meninggalkan kerusakan pada jaringan (Hodgson and Levi, 2000). Sementara itu jenis antioksidan yang lainnya berasal dari luar tubuh, yaitu yang berasal dari makanan, atau komponen bahan makanan (fitokimia) seperti fenol (Yang, et al dalam Sri Retno DA dan Wiji Astuti, 2009), karotenoid (Nara, et al, 2001), atau alkaloid (Schultz, et al, 1984). 1. Pengertian Tentang Antioksidan Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron, sehingga molekul tersebut menjadi tidak stabil dan selalu berusaha mengambil elektron dari molekul atom sel lain. Radikal bebas dapat dihasilkan dari hasil metabolisme tubuh dan faktor eksternal seperti asap rokok, hasil penyinaran UV, zat kimiawi dalam makanan dan polutan lain. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas bersifat kronis, yaitu dibutuhkan waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut menjadi nyata. Contoh penyakit yang sering dihubungkan dengan radikal bebas adalah serangan jatung dan kanker ( Anonim b, 2008). Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat, mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi oksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Pratt, 1992, dalam Ardiansyah, 2007 ). Sumber-sumber antioksidan dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).

32 32 Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari : (Pratt, 1992, dalam Ardiansyah, 2007 ). a. Senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan. b. Senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan. c. senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke dalam makanan sebagai bahan tambahan pangan. Berbagai nutrisi yang mengandung antioksidan di antaranya adalah semua biji-bijian, kacang-kacangan, buah-buahan, sayuran, hati, tiram, unggas, kerang, ikan, susu dan daging (Destiutami, 2007 ). Kumalaningsih (2007) menyatakan bahwa terdapat tiga macam antioksidan yaitu : a. Antioksidan yang dibuat oleh tubuh kita sendiri yang berupa enzim antara lain superoksida dismutase, glutathione peroksidase, perxidasi dan katalase. b. Antioksidan alami yang diperoleh dari tanaman atau hewan yaitu tokoferol, vitamin C, betakaroten, flavonoid dan senyawa fenolik. c. Antioksidan sintetik yang dibuat dari bahan-bahan kimia yaitu Butylated Hroxyanisole (BHA), BHT, PG dan EDTA yang ditambahkan dalam makanan untuk mencegah kerusakan lemak. Atas dasar fungsinya antioksidan dapat dibedakan menjadi lima yaitu : (Kumalaningsih, 2007) a. Antioksidan Primer Antioksidan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal bebas baru karena ia dapat merubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum sempat bereaksi. b. Antioksidan Sekunder

33 33 Antioksidan sekunder merupakan senyawa yang berfungsi menangkap radikal bebas serta mencegah terjadinya reaksi berantai sehingga tidak terjadi kerusakan yang lebih besar. Contoh yang popular, antioksidan sekunder adalah vitamin E, vitamin C, dan betakaroten yang dapat diperoleh dari buah-buahan. c. Antioksidan Tersier Antioksidan tersier merupakan senyawa yang memperbaiki sel-sel dan jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas. Biasanya yang termasuk kelompok ini adalah jenis enzim misalnya metionin sulfoksidan reduktase yang dapat memperbaiki DNA dalam inti sel. Enzim tersebut bermanfaat untuk perbaikan DNA dalam inti sel. Enzim tersebut bermanfaat untuk perbaikan DNA pada penderita kanker. d. Oxygen scavenger Antioksidan yang termasuk Oxygen scavenger mengikat oksigen sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi, misalnya vitamin C. e. Chelators / sequestrants Mengikat logam yang mampu mengkatalis reaski oksidasi misalnya asam sitrat dan asam amino. Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon, 1990 dalam Ardiansyah, 2007). Reaksi oksidasi lemak yang terjadi pada makanan atau bahan makanan berlemak dapat dihambat dengan pemberian zat antioksidan. Pada umumnya zat antioksidan yang digunakan adalah zat antioksidan sintetik seperti Butylated

34 34 Hydroxyanisole (BHA), Butylated Hydroxytoluene (BHT), Propyl Gallat (PG) dan Etylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA). Sementara itu penggunaan zat antioksidan sintetik tertentu misalnya BHT dapat menimbulkan akibat buruk terhadap kesehatan konsumen seperti gangguan fungsi hati, paru, mukosa usus dan keracunan. Salah satu usaha untuk mengatasi masalah tersebut adalah mengganti zat antioksidan sintetik dengan zat antioksidan alami. Zat antioksidan alami dapat diperoleh dari ekstrak bagian-bagian tanaman tertentu terutama yang banyak mengandung senyawa-senyawa flavonoid yang tersusun dari gugusgugus fenol (Suryo dan Tohari, 1995). Antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh antara lain adalah : 1. Superoksida Dismutase Antioksidan ini merupakan enzim yang bekerja bila ada pembantunya yaitu berupa mineral-mineral seperti tembaga, mangan yang bersumber pada kacang-kacangan, padi-padian. Dengan demikian sangat diperlukan sekali mengkonsumsi bahan tersebut di atas. Sayangnya kita lebih senang mengkonsumsi bahan yang enak dimakan. Bagi orang yang mampu, kekurangan mineral dapat dilakukan dengan meminum multivitamin dan suplemen mineral tetapi bagi orang yang hidupnya sedang-sedang saja lebih baik mengkonsumsi mineral dari tanaman karena banyak juga tanaman yang dapat menghasilkan SOD antara lain brokoli, bayam, sawi dan juga hasil-hasil olahan seperti tempe. 2. Glutathione Peroksidase Adalah enzim yang berperan aktif dalam menghilangkan H 2 O 2 dalam tubuh dan mempergunakannya untuk merubah glutathione (GSH) menjadi glutathine teroksidasi (GSSG). Makanan yang kaya glutahione adalah kubis, brokoli, asparagus, alpukat dan kenari. Glutathione sangat penting sekali

35 35 melindungi selaput-selaput sel. Senyawa ini merupakan tripeptida yang terdiri dari asam amino glisin, asam glutamat dan sistein. 3. Katalase Enzim katalase di samping mendukung aktivitas enzim SOD juga dapat mengkatalisa perubahan berbagai macam peroksida dan radikal bebas menjadi oksigen dan air. Enzim-enzim tersebut di atas dalam bekerjanya sengat membutuhkan mineral-mineral penyusun sebagai berikut : Copper (Cu), Zinc (Zn), Selenium (Se), Manganese (Mn), Besi (Fe). Jenis penggolongan antioksidan yang lain adalah berdasarkan sumber diperoleh senyawa tersebut. Penggolongan ini ada dua yaitu antioksidan sintetik dan antioksidan alami. 1. Antioksidan sintetik Antioksidan sintetik efektif dalam mencegah ketengikan pada minyak dan bahan pangan berlemak (Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Contoh antioksidan sintetik adalah BHA, BHT, propil galat dan lain-lain. Namun menurut Chang et al. (1977), penggunaan BHT pada tikus percobaan dapat menyebabkan kerusakan organ tubuh seperti paru-paru dan organ pencernaan. Oleh karena itu penggunaan food additive (bahan tambahan makanan) lebih baik dibatasi (Osawa dan Namiki, 1981 dalam Ariani dan Hastuti, 2008). Penggunaan antioksidan tidak boleh berlebihan karena aktivitas antioksidan akan hilang pada konsentrasi yang tinggi dan mungkin akan menjadi prooksidan. Penggunaan antioksidan berlebihan akan menyebabkan senyawa lebih bersifat sebagai akselerator daripada inhibitor dalam oksidasi lemak. Dalam keadaan berlebih, antioksidan akan meningkatkan dekomposisi oksidasi lemak dan pembentukan produk radikal. 2. Antioksidan Alami

36 36 Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b) senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan, (c) senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke makanan sebagai bahan tambahan pangan Kebanyakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, bunga, biji, dan serbuk sari. Kira-kira 2 % dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan erat dengannya, sehingga flavonoid merupakan salah satu golongan fenol alam terbesar. Sebenarnya flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau, sehingga pastilah ditemukan pula pada setiap telaah ekstrak tumbuhan. Golongan flavonoid dan senyawa yang berkaitan erat dengannya memiliki sifat-sifat antioksidan baik didalam lipida cair maupun dalam makanan berlipida. Di samping itu ada banyak bahan pangan yang dapat menjadi sumber antioksidan alami, seperti rempah-rempah, dedaunan, teh, kokoa, biji-bijian, serealia, buah-buahan, sayur-sayuran dan tumbuhan/alga laut. Bahan pangan ini mengandung jenis senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan, seperti asamasam amino, asam askorbat, tokoferol, karotenoid, tannin, peptida, melanoidin, produk-produk reduksi, dan asam-asam organik lain. 2. Antioksidan Pada Kedelai Dalam suatu sistem biologis terdapat sistem pertahanan tubuh untuk melawan atau meredam radikal bebas. Sistem pertahanan tubuh tersebut didukung oleh zat-zat gizi yang berfungsi sebagai antioksidan, yaitu suatu

37 37 senyawa yang dapat meredam dampak negatif radikal bebas maupun oksidan. Dikenal ada empat tipe perlindungan (Mills, 1989), yaitu : 1. Senyawa yang berperanan dalam pencegahan radikal bebas, meliputi peranannya dalam mempertahankan struktur sel, pencegahan terhadap terhimpunnya subtansi-subtansi yang kemungkinan membentuk radikal bebas; pengendalian terhadap distribusi zat besi. Antioksidan yang termasuk dalam kategori ini adalah katalase dan glutathion peroksidase. 2. senyawa yang berperan sebagai pembersih radikal bebas. Termasuk dalam golongan ini adalah vitamin E, vitamin C, betha karotin, glutathion dan enzim superoksida dismutase. 3. Senyawa yang berperan dalam memperbaiki radikal bebas, terutama dalam mempertahankan efektivitas glutathion. 4. Senyawa yang berperan dalam perbaikan asam nukleat seperti enzim polimerase. Kedelai, terkenal sebagai makanan antikanker. Dalam kedelai terdapat sejumlah zat yang secara bersama-sama saling menguatkan dalam menghabisi benih kanker. Senyawa inhibitor protease kedelai, yang punya nama khusus inhibitor Browman-Birk, ampuh melumpuhkan berbagai jenis kanker. Daya bunuh kanker tersebut dibantu serat kasar kedelai, yang kadarnya lumayan tinggi (2 gram per 100 gram) Itulah sebabnya mengapa kedelai dipastikan mampu mencegah dan membantu penyembuhan segala jenis kanker. Dari kanker usus besar, kanker paru-paru, kanker kulit, kanker payudara, kanker prostat, hingga kanker darah (leukimia). Namun kemampuannya menumpas kanker akibat membanjirnya hormon adalah paling top, seperti kanker payudara pada wanita dan kanker prostat pada pria. Sebab genistein kedelai memiliki khasiat antihormon, terutama antiestrogen, yang merupakan hormon seks pada wanita (Depkes 2004). 3. Antioksidan Pada Tempe Kedelai

38 38 Di dalam tempe juga ditemukan suatu zat antioksidan dalam bentuk isoflavon. Seperti halnya vitamin C, E, dan karotenoid, isoflavon juga merupakan antioksidan yang sangat dibutuhkan tubuh untuk menghentikan reaksi pembentukan radikal bebas (Pawiroharsono, 1996). Dalam kedelai terdapat tiga jenis isoflavon, yaitu daidzein, glisitein, dan genistein. Pada tempe, di samping ketiga jenis isoflavon tersebut juga terdapat antioksidan faktor II yang mempunyai sifat antioksidan paling kuat dibandingkan dengan isoflavon dalam kedelai. Antioksidan ini disintesis pada saat terjadinya proses fermentasi kedelai menjadi tempe oleh bakteri Micrococcus luteus dan Brevisbacterium epidermis. (Pawiroharsono, 1996). Penuaan (aging) dapat dihambat bila dalam makanan yang dikonsumsi sehari-hari mengandung antioksidan yang cukup. Karena tempe merupakan sumber antioksidan yang baik, konsumsinya dalam jumlah cukup secara teratur dapat mencegah terjadinya proses penuaan dini (Pawiroharsono, 1996). Murata et.al., 1985 menemukan bahwa kadar ribovlavin, asam nikotinat, asam pantotenat dan piridoksin dalam tempe jauh lebih tinggi daripada dalam kedelai yang tidak difermentasikan seperti terlihat dalam tabel 3 (Sumaatmojo, 1985). Liu et.al, 1997 menemukan peningkatan kadar vitamin B12, dihasiikan oleh bakteri clebsiela peneumonae, yang merupakan cemaran selama proses pembuatan tempe. Kadar vitamin B12 dalam tempe 3,9mcg per 100 gram tempe, 2600 kali kadar dalam kedelai. Vitamin lain yang meningkat jumlahnya adalah asam folat (300%) dan biotin (50%), sedangkan jumlah thiamin turun menjadi 58% (Sumaatmojo, 1985). Fermentasi ternyata dapat menurunkan kadar asam phitat dalam biji kedelai (54%).asam phitat adalah senyawa fosfor yg dapat mengikat mineral (kalsium, besi, fosfor, magnesium, seng) sehingga tidak dapat diserap tubuh. Dengan berurainya asam phitat karena perebusan dan oleh enzin fitase yang

39 39 dihasilkan cendawan Rhizophus oligosporus, fosfornya dapat dimanfaatkan tubuh dan penyerapan mineral lainpun tidak terganggu (Sumaatmojo, 1985). Tabel 3. kadar vitamin ( mg / g bahan kering) dalam biji kedelai dan tempe VITAMIN KEDELAI TEMPE Riboflavin 0,06 0,49 Asam nikotianat 0,90 4,39 Asam pantothenat 0,50 1,00 Piridoksin 0,08 0,35 Sumber : Sumaatmojo, Berdasarkan dari tabel diatas, Sumaatmaja (1985) menegaskan bahwa riboflavin meningkat 8 kali lipat pada tempe dibanding pada kedelai, juga pada asam nikotianat meningkat 5 kali lipat, sedangkan asam pantothenat meningkat 2 kali lipat, selain itu juga ditemukan peningkatan hampir 5 kali pada piridoksin. E. UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN Berbagai metode uji aktivitas antioksidan telah digunakan untuk mengetahui dan membandingkan aktivitas antioksidan pada makanan. Beberapa tahun terakhir, pengujian kapasitas absorbansi radikal oksigen telah digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan pada makanan, serum dan cairan biologis. Metode ini memerlukan peralatan khusus dan keahlian teknis untuk analisanya. Beberapa metode untuk uji aktivitas antioksidan antara lain Thiobarbituric acidreactive-substances (TBARS), 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), 2,2 -azinobis-3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ( ABTS), Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC), 2,2;-azobis-amidinopropane-dihydrochloride (AAPH) serta reagen Folin-Ciocalteau. Berbagai metode yang digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan pada bahan makanan dapat memberikan hasil yang berbeda-beda tergantung pada jenis radikal bebas yang digunakan sebagai reagen (Prakash, 2001 ).

40 40 Metode yang cepat, mudah dan tidah mahal untuk mengukur aktivitas antioksidan pada makanan dan bahan makanan menggunakan senyawa radikal bebas DPPH. DPPH secara luas digunakan untuk menguji kemampuan senyawa-senyawa penyerang radikal bebas atau donor hidrogen dan untuk menilai besarnya aktivitas antioksidan pada makanan. Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel padat ataupun cair dan tidak spesifik untuk senyawa antioksidan tertentu tetapi pada keseluruhan senyawa antioksidan yang ada dalam sampel. Uji aktivitas antioksidan secara keseluruhan membantu dalam memahami fungsi zat-zat yang terkandung dalam makanan (Prakash, 2001 ). Uji antioksidan dengan metode DPPH telah dikembangkan dalam memaparkan aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas stabil DPPH. Elektron bebas dalam radikal bebas DPPH memberikan panjang gelombang maksimum 517 nm dan berwarna ungu. Peredaman warna ungu menjadi kuning sebagai absorpsivitas molar radikal bebas DPPH berkurang dari 9660 menjadi 1640 ketika elektron bebas radikal bebas menjadi berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan yang menyerang radikal bebas membentuk DPPH-H tereduksi. Sehingga peredaman warna DPPH sebanding dengan banyaknya elektron yang tertangkap (Prakash, 2001 ). DPPH (difenil pikril hidrazil hidrat) menghasilkan radikal bebas aktif bila dilarutkan dalam alkohol. Radikal bebas tersebut stabil dengan absorpsi maksimum pada panjang gelombang 517 nm dan dapat direduksi oleh senyawa antioksidan (Prakash, 2001). Dalam metode ini larutan sampel ditambah larutan 0,2 mm DPPH (sebagai kontrol) dalam metanol, dibiarkan selama 30 menit pada suhu kamar dalam keadaan gelap dan diukur absorbansinya pada spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antiradikal dapat diperlihatkan pada sistem yang warnanya berubah dari ungu menjadi kekuningan.

41 41 Perubahan warna larutan menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH dan dapat diukur dengan perbedaan absorbansi yang dihasilkan pada sampel dibandingkan dengan kontrol. Aktivitas antiradikal dinyatakan dalam bentuk persen penangkapan radikal DPPH dan dihitung dengan persamaan (Yen dan Chen, 1995). % aktivitas antioksidan ( 1 absorbansi sampel absorbansi kontrol ) x 100% Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas atau antioksidan, sedangkan nilai 100% berarti peredaman total dan pengujian perlu dilanjutkan dengan pengenceran larutan uji untuk melihat batas konsentrasi aktivitasnya. F. KERANGKA BERPIKIR Tempe kedelai merupakan salah satu bahan makanan berbahan dasar kedelai yang merupakan hasil fermentasi dengan Rhizopus oligosporus. Isoflavon yang terkandung dalam kedelai dan hasil olahannya berada dalam bentuk glukosida isoflavon (daidzin, genistin dan glisitin) dan dalam bentuk aglukan isoflavon (daizein, genistein, glisitein dan faktor-2). Selama proses pengolahan dan fermentasi kedelai menjadi tempe terjadi biokonversi isoflavon dari glukosida isoflavon menjadi aglukan isoflavon. Kandungan isoflavon dalam tempe kedelai mempunyai aktivitas sebagai antioksidan dan dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan alami. Salah satu manfaat isoflavon adalah sebagai antioksidan. Kandungan isoflavon dalam kedelai dan hasil olahannya memiliki aktivitas antioksidan yang berbeda. Selama fermentasi, terjadi kenaikan aktivitas antioksidan yang

42 42 disebabkan terhidrolisanya isoflavon glikosida menjadi aglukan isoflavon. Aktivitas antioksidatif aglukan isoflavon lebih tinggi karena gugus hidroksi lebih banyak dijumpai pada aglukan isoflavon. Analisis kandungan daizein, genistein, glisitein dan faktor-2 dalam tempe kedelai dapat dilakukan dengan metode HPLC. Selain Kedelai, jenis legume yang dapat diolah menjadi tempe adalah kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok. Meski kandungan gizi tidak lebih dari kedelai kuning, ketiga jenis legume tersebut dapat diolah menjadi tempe yang mempunyai cita rasa seperti halnya tempe dari kedelai kuning. Kedelai yang berkulit hitam saat ini sedang menjadi incaran peneliti gizi dan kesehatan. Karena ternyata, di dalam kedelai hitam mengandung antosianin. Antosianin tersebut sangat potensial mencegah proses oksidasi yang terjadi secara dini dan menimbulkan penyakit degeneratif, penyakit jantung koroner, stroke dan beragam penyakit berbahaya lainnya (Astuti, 1995). Pada koro kratok kultivar yang umum ditanam memilki warna kulit biji hijau muda atau putih; yang lain dapat berwarna merah, ungu, coklat, atau hitam. Dua kotiledon daun biji besar merupakan bagia terbesar dari volume biji. Biji tipe liar memiliki kandungan glukosida sianogenik tinggi dan harus dilindikan sebelum atau selama pemasakan (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997). Pada koro hitam kultivar berbiji putih mengandung glukosida sianogenik dan penghambat tripsin dalam jumlah kecil sehingga tidak beracun sedangkan kultivar berbiji gelap mengandung kedua senyawa tersebut dalam jumlah besar. Polong tanaman koro hitam mengandung 4-5% protein. Biji kering memiliki kandungan karbohidrat 50-60% dan protein 20-25% (Rubatzky dan Yamaguchi, 1997).

43 43 Tanaman dan biji koro hitam belum begitu banyak ditemukan kegunaan dan manfaatnya, karena tanaman dan biji koro hitam hanya digunakan sebagai campuran sayur bagi masyarakat pedesaan. Lama waktu fermentasi tempe kedelai di pasaran antara jam, tetapi tempe dengan lama waktu fermentasi jam masih ada yang mengkonsumsi sehingga perlu dilakukan penelitian mengenai kandungan senyawa yang bermanfaat khususnya isoflavon dalam tempe kedelai yang difermentasi selama 48 dan 72 jam, demikian juga pada tempe kedelai hitam, tempe koro hitam dan tempe koro kratok. Aktivitas antioksidan isoflavon total yang diperoleh dari tempe kedelai yang difermentasi selama 0, 1, 2, 3, 4 dapat dihitung dengan metode DPPH. G. HIPOTESIS Berdasarkan kajian teori dan kerangka pemikiran di atas, maka dapat dikemukakan hipotesis sebagai berikut : 1. Ada perbedaan jenis Isoflavon yang terkandung dalam tempe berbahan baku Kedelai kuning, koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya berdasarkan variasi lama waktu fermentasi (0, 1, 2, 3, dan 4 hari) 2. Terdapat perbedaan lama waktu fermentasi yang optimum untuk menghasilkan ekstrak etanol tempe berbahan baku Kedelai kuning, kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok dengan aktivitas antioksidan yang optimum.

44 44 3. Tempe berbahan baku Kedelai kuning, koro hitam, koro kratok serta kedelai hitam dan produk tempenya mempunyai potensi dalam upaya pemanfaatannya sebagai antioksidan alami khususnya isoflavon BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian 1. Waktu Penelitian ini dilakukan pada pertengahan bulan Maret sampai Juni Tempat Penelitian ini dilakukan di: a. Laboratorium Program Kimia P.MIPA FKIP UNS, JL. Ir. Sutami No. 36A Kentingan Surakarta.

45 45 b. Sub Laboratorium Biologi Pusat MIPA UNS, JL. Ir. Sutami No. 36A Kentingan Surakarta. c. Laboratorium Kimia Organik F.MIPA UGM. d/a, Sekip Utara telp (0274) , Yogyakarta. B. Alat dan Bahan 1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : a) Alat rotary vacum evaporator (Buchi) b) Neraca analitik Sartorius c) Alat HPLC Perkin Elmer LC 295 d) Blender Philip e) Pipet mikro f) Alat Spektrofotometer UV - VIS g) Alat-alat gelas Pyrex 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah : a). Kedelai kuning Madura, koro hitam dari Wonogiri, kedelai hitam dan koro kratok dari Solo. b). Etanol 95 % Merck c). Metanol p.a Merck d). Standar Genistein, Standart Daidzein, Standart Glisitein, standart Faktor-2 (Sigma Chemical Co.) e). DPPH (Sigma Chemical Co.) f). Metanol gradient grade for liquid chromatography merek Merck

46 46 g). Aluminium foil h). Akuades i). Kertas saring j). BHT (Butyl Hidroksi Toluena) merek Sigma Chemical Co k). Betakaroten (Sigma Chemical Co.) l). Alfatokoferol (Sigma Chemical Co.) C. Prosedur Kerja Cara kerja yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi : 1. Pembuatan Tempe a. Pembuatan tempe kedelai berbahan baku kedelai kuning Madura sebagai berikut : Sebelum difermentasi, kedelai mengalami serangkaian perlakuan yang meliputi 1. Persiapan bahan dan sortasi Penyiapan bahan baku berupa kedelai kuning Madura dan kedelai 500 gr dipilih biji-biji yang besar, licin dan mengkilat kulitnya. 2. Perendaman Perendaman dilakukan dengan merendam 500 gr kedelai kuning Madura dalam 1000 ml air bersih selama 24 jam, dengan penggantian air rendaman setiap 8 jam. 3. Pengupasan kulit Pengupasan kulit dilakukan untuk menghasilkan biji yang bersih Sekaligus mempermudah penetrasi miselium kapang disaat terjadi fermentasi. 4. Perebusan Biji direbus dalam air sebanyak 1000 ml selama 45 menit, kemudian

47 47 ditiriskan dan diangin-anginkan sampai biji kedelai dalam keadaan lembab (tidak terlalu basah). 5. Penambahan inokulum Setelah sampel dalam keadaan tidak terlalu basah, ditaburi ragi atau Inokulum sebanyak 0,5 gr untuk 500 gr sampel. Inokulum yang digunakan produk dari LIPI dengan merek RAPRIMA. 6. Pemeraman Sampel yang sudah diberi inokulum dicampur dengan rata kemudian dibungkus dengan menggunakan daun pisang dan diperam selama 24, 48, 72, 96 jam dalam suhu kamar (27 o C) dam terbentuklah tempe kedelai. b. Pembuatan tempe berbahan baku koro hitam dari Wonogiri, kedelai hitam dan koro kratok dari Solo sebagai berikut : 1. Persiapan bahan dan Sortasi Tahap pertama dimulai dengan penyiapan bahan baku yaitu biji koro hitam (Lablab purpureus), koro kratok (Phaseolus lunatus), kedelai hitam (Glycine soja) masing-masing 500 gram. 2. Perendaman Perendaman dilakukan dengan merendam 500 gram biji koro hitam, koro kratok dan kedelai hitam dalam 1000 ml air bersih selama 3 x 24 jam, dengan penggantian air rendaman sebanyak tiga kali dalam 24 jam, untuk menghilangkan senyawa asam sianida (HCN). 3. Pengupasan kulit Pengupasan kulit dilakukan untuk menghasilkan biji yang bersih sekaligus mempermudah penetrasi miselium kapang disaat terjadi fermentasi. 4. Pemasakan biji koro hitam, koro kratok dan kedelai hitam

48 48 Pemasakan dilakukan dengan cara mengukus biji koro hitam, koro kratok dan kedelai hitam selama satu jam, kemudian ditiriskan dan diangin-anginkan. 5. Penambahan Inokulum Setelah sampel dalam keadaan tidak terlalu basah, ditaburi ragi/inokulum. Bahan inokulum yang digunakan dari produk LIPI dengan merk RAPRIMA. 6. Pemeraman Sampel yang sudah diberi inokulum dicampur dengan rata, kemudian dibungkus dengan menggunakan daun pisang dan diperam selama 24, 48, 52, 96 jam dalam suhu kamar ( 27 o C ) dan terbentuklah tempe koro hitam, tempe koro kratok dan tempe kedelai hitam. 2. Ekstraksi Isoflavon dengan Metode Maserasi Sebanyak 100gr sampel diblender hingga terbentuk bubur, kemudian dimaserasi dalam 250 ml etanol 70 % selama 24 jam, kemudian disaring dan filtratnya ditampung. Residu ditambah dengan 100 ml etanol 70 %, kemudian dimaserasi selama 24 jam, kemudian disaring dan filtratnya ditampung. Residu kedua ditambah dengan100ml etanol 70 %, lalu di saring lagi. Filtrat hasil maserasi kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental di oven selama 30 menit dengan suhu 50 o C sehingga diperoleh ekatrak etanol. Ekstrak etanol yang dihasilkan kemudian diidentifikasi isoflavonnya dengan metode HPLC. 3. Metode Identifikasi Isoflavon Identifikasi isoflavon dengan menggunakan metode HPLC dilakukan dengan pengkondisian instrumen HPLC dan pembuatan larutan sampel. Larutan sampel dibuat dengan mengambil 1 mg ekstrak etanol hasil ekstraksi, lalu masing-masing dilarutkan dalam etanol 10 ml. Larutan kemudian disentrifuge lalu diambil 20 µl dengan alat injeksi. Selanjutnya

49 49 sampel diinjeksikan ke dalam HPLC setelah pengkondisian HPLC selesai. Menganalisa kromatogram HPLC dengan menggunakan pembanding kromatogram isoflavon standar yang terdiri dari daidzein, genistein, glisitein dan faktor-2. Adapun kondisi HPLC adalah sebagai berikut: a. Panjang Kolom : 10 cm b. Jenis Kolom : Lichrosper (R) 100 RP-18 (non polar) c. Fase Gerak : metanol:asam asetat 0,02 ( 57,5% ; 42,5%) d. Volume Injeksi : 20 µl e. Detektor : sinar UV pada panjang gelombang 265 nm f. Suhu Oven : suhu kamar 4. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH a. Pembuatan Larutan DPPH Pembuatan larutan DPPH dengan menimbang kristal sebanyak 7,88 mg DPPH dan dilarutkan dalam metanol 100 ml sehingga diperoleh konsentrasi 0,2 mm sebagai larutan kontrol. Pengukuran absorbansi larutan DPPH dilakukan dengan memipet 600 µl pelarut (metanol) ke dalam kuvet dan ditambahkan larutan DPPH sampai volume 3 ml kemudian ditutup dan dikocok sampai homogen warnanya. Selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang (λ) nm dan mencatat absorbansinya pada puncak panjang gelombang 517nm sebagai absorban kontrol. b. Pembuatan Larutan Sampel Pembuatan larutan uji dengan menimbang ekstrak sebanyak 2 mg dan melarutkan ke dalam etanol 4 ml untuk membuat larutan uji dengan konsentrasi 100 ppm. Kemudian pengukuran antioksidan bahan uji digunakan metode yang sama, dimana 600 µl pelarut diganti dengan 600 µl larutan uji (sampel). Selanjutnya di ukur absrbansinya pada panjang gelombang (λ) nm dan mencatat absorbansinya pada puncak panjang gelombang mendekati 517nm sebagai absorban sampel.

50 50 5. Pengukuran Kadar Antioksidan Aktivitas antiradikal dihitung dengan metode DPPH dimana sampel direaksikan dengan larutan DPPH. Aktivitas antiradikal diperlihatkan pada sistem yang warnanya berubah dari ungu menjadi kekuningan. Perubahan warna larutan menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH dan dapat diukur dengan perbedaan absorbansi yang dihasilkan pada sampel dibandingkan dengan kontrol. Aktivitas antiradikal dinyatakan dalam bentuk persen penangkapan radikal DPPH dan dihitung dengan persamaan ( Yen dan Chen, 1995). % aktivitas antioksidan ( 1 absorbansi absorbansi sampel kontrol ) x 100 % Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas atau antioksidan, sedangkan nilai 100% berarti peredaman total dan pengujian perlu dilanjutkan dengan pengenceran larutan uji untuk melihat batas konsentrasi aktivitasnya. 6. Teknik Analisa Data Analisis data dengan dua faktor yaitu jenis bahan dasar pembuat tempe dan lama fermentasi, menggunakan program SPSS version 15. Analisis data pada Program SPSS tersebut adalah analisis data berupa General Linear Model Univariete. Analisis data dengan satu faktor yaitu jenis bahan dasar, menggunakan program SPSS version 15. Analisis data pada Program SPSS tersebut adalah analisis data berupa Compare Means One Way Annova.

51 51 BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil Fermentasi Aneka Legume dan produk Tempenya. Biji kedelai hitam, koro hitam dan koro kratok setelah mengalami serangkaian perlakuan sebelum terjadi proses fermentasi, antara lain : persiapan bahan dan sortasi, perendaman, pengupasan kulit, pemasakan biji koro, penambahan inokulum dan yang terakhir pemeraman, dari proses diatas didapatkan hasil : 1. Biji kedelai hitam dan produk tempenya

52 52 Fermentasi hari ke-0 : Kedelai hitam berupa biji-biji yang sudah lunak, ada yang terbelah menjadi dua dan ada yang utuh serta ada penambahan inokulum tetapi tidak difermentasikan lebih lanjut, sehingga bentuknya seperti kedelai kukus. Fermentasi hari ke-1 : Pada biji kedelai hitam sudah tumbuh sedikit miselium meski belum merata pada permukaan, dan belum dapat diiris (akan terlepas satu persatu), sehingga diperkirakan kandungan isoflavon belum optimum Fermentasi hari ke-2 : Miselium jamur yang berwarna putih sudah tumbuh merata dan kompak sehingga sudah terbentuk tempe seperti halnya tempe kedelai kuning dan diiris tidak pecah, sehingga diperkirakan kandungan isoflavon sudah ada Fermentasi hari ke-3 : Misellium semakin berwarna putih merata menutupi biji-biji kedelai hitam dan kompak, diiris tidak pecah dan belum terlihat warna kuning pada tepinya seperti halnya tempe kedelai, sehingga diperkirakan kandungan isoflavon sudah optimum Fermentasi hari ke-4 : Miselium mengalami perubahan warna menjadi kuning pada bagian tepi tempe dan menyusut kekompakannya, diiris tidak pecah, sehingga diperkirakan kandungan isoflavonnyapun berkurang. Tabel 4. Hasil Pengamatan Biji Kedelai hitam dan Produk Tempe Kedelai hitam SAMPEL FOTO WARNA AROMA Biji kedelai hitam Hitam Khas kedelai Kedelai hitam kukus (tempe hasil fermentasi hari ke-0 Tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-1 Putih Putih agak kuning dan ada warna hitam Khas kedelai Khas tempe kedelai

53 53 Tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-2 Putih kuning kehitaman Khas tempe kedelai Tempe kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-3 Tempe biji kedelai hitam hasil fermentasi hari ke-4 Putih Putih kekuningan Khas tempe kedelai Sedikit berbau amoniak 2. Biji koro hitam dan produk tempenya Fermentasi hari ke-0 : Pada biji koro hitam sama dengan biji kedelai hitam yaitu biji-biji yang lunak, ada yang terbelah ada yang utuh, ada penambahan inokulum dan tidak difermentasikan lebih lanjut dan bentuknya seperti kedelai kukus. Fermentasi hari ke-1 : pada biji kro hitam sudah tumbuh sedikit misellium dan belum merata pada permukaan biji, sehingga tidak dapat diiris (terlepas satu-persatu), diperkirakan kandungan isoflavon belum optimum. Fermentasi hari ke-2 : Misellium berwarna putih dan tumbuh merata, serta kompak sehingga sudah berbentuk tempe, diiris tidak pecah, dan diperkirakan kandungan isoflavon sudah ada Fermentasi hari ke-3 : Misellium makin berwarna putih merata menutupi biji-biji koro hitam dan kompak, diiris tidak pecah dan belum terlihat warna kunng pada tepi tempe, dan diperkirakan kandungan isoflavon sudah optimum

54 54 Fermentasi hari ke-4 : Misellium mengalami penyusutan dan perubahan warna menjadi kuning pada bagian tepi tempe, diiris tidak pecah, dan diperkirakan kandungan isoflavonnya juga mulai berkurang Tabel 5. Hasil Pengamatan Biji Koro hitam dan Produk Tempe Koro hitam SAMPEL FOTO WARNA AROMA Biji koro hitam mentah Hitam Tidak beraroma Koro hitam kukus (tempe hasil fermentasi hari ke-0 Putih Khas kedelai rebus Tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-1 Putih hitam agak Khas tempe kedelai tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-2 Putih Khas tempe kedelai Tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-3 Putih Khas tempe kedelai Tempe biji koro hitam hasil fermentasi hari ke-4 Masih berwarna putih Sedikit berbau amoniak 3. Biji koro kratok dan produk tempenya Fermentasi hari ke-0 : Sama seperti kedelai hitam dan koro hitam, biji koro kratok berupa biji-biji yang lunak, ada yang terbelah dan utuh serta ada penambahan inokulum dan tidak difermentasikan lebih lanjut. Fermentasi hari ke-1 : Sudah tumbuh misellium pada permukaan biji koro meskipun belum merata dan kompak, diiris akan pecah (terlepas satu persatu), dan diperkirakan kandungan isoflavon belum optimum

55 55 Fermentasi hari ke-2 : Misellium yang berwarna putih tumbuh merata dan kompak sehingga sudah berbentuk tempe dan diiris tidak pecah, dan diperkirakan kandungan isoflavon sudah ada Fermentasi hari ke-3 : Misellium semakin berwarna putih, merata menutupi biji koro dan kompak, diiris tidak pecah dan belum terlihat warna kuning pada tepi tempe, dan diperkirakan kandungan isoflavon sudah optimum Fermentasi hari ke-4 : Misellium mengalami penyusutan dan perubahan warna menjadi kuning pada bagian tepi tempe, diiris tidak pecah, dan diperkirakan kandungan isoflavonnya juga mulai berkurang Tabel 6. Hasil Pengamatan Biji Koro kratok dan Produk Tempe Koro kratok SAMPEL FOTO WARNA AROMA Biji koro kratok mentah Koro kratok kukus (tempe hasil fermentasi hari ke-0 Warnawarni (hitam, kuning Merah,cokla t) Putih bersih Tidak beraroma Khas kedelai rebus

56 56 Tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke-1 tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke-2 Tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke-3 Tempe biji koro kratok hasil fermentasi hari ke ke-4 Putih bersih Putih Putih Masih berwarna putih Khas tempe kedelai Khas tempe kedelai Khas tempe kedelai Sedikit berbau amoniak Dari ketiga jenis legume dan produk tempenya, hasil fermentasi yang optimum untuk menjadi tempe adalah pada fermentasi hari ke-3, karena pada hari tersebut sudah nampak adanya misellium yang berwarna putih yang tumbuh merata dan kompak sehingga biji-biji tertutupi dan pada saat tempe diiris tidak pecah yang disebabkan adanya misellium yang mengikat dan menembus biji-biji legume yang lunak, selain itu pada fermentasi hari ke-3 pada bagian tepi tempe belum terlihat adanya warna kuning yang menunjukkan adanya penyusutan misellium dan dimungkinkan kandungan isoflavonnya paling optimum (Faktor-2) karena hasil fermentasinya juga optimum Jadi hasil fermentasi tempe dari jenis legume yang paling optimum adalah hari ke-3 dimana hasil tersebut sama dengan hasil fermentasi tempe pada kedelai kuning Madura. Hasil tersebut dapat dilihat pada lampiran 1. B. Hasil Ekstraksi Aneka Legume dan Produk Tempenya Tempe hasil fermentasi hari ke-0, 1, 2, 3, 4 diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Etanol 70% diketahui mampu