PROSES HILIR (DOWNSTREAM)

Transkripsi

1 PROSES HILIR (DOWNSTREAM) Learning outcome : Mahasiswa dapat menjelaskan cara-cara pemanenan sel, dan pemurnian produk

2 Teknologi fermentasi terdiri dari 2 proses : 1. Upstream processing = proses hulu 2. Downstream processing = proses hilir Upstream processing (USP) : 1. Aspek utama : cara memproduksi mikroorganisme : pemilihan mikroorganisme, isolasi, pengembangan inoculum 2. Aspek kedua : pemilihan media, sterilisasi 3. Aspek ketia : berhubungan dengan fermentasi pada kondisi terkontrol

3 Proses Hilir (Downstream Processing) Meliputi semua proses setelah fermentasi Tujuan : memproduksi dan memperbaiki produk yang diinginkan Biasanya memerlukan spesifikasi dan tindakan khusus (aktivitas biologis, kemurnian, dll), memaksimalkan hasil pemurnian, dan meminimalkan biaya Produk target dapat dimurnikan dengan mengolah sel atau media tergantung dari target produk produk intraseluler atau ekstraseluler Tingkat kemurnian yang harus dicapai disesuaikan dengan tujuan penggunaan missal kemurnian enzim dinyatakan dengan unit aktivitas enzim per unit protein total Setiap tahap dalam prosedur pemurnian, tergantung pada proses fermentasi sebelumnya

4

5

6

7 Faktor-Faktor Faktor yang yang Mempengaruhi Pemurnian Produk Jenis substrat Peralatan Stabilitas produk

8 Proses Hilir Tahapan Proses Proses Hilir Hilir (Downstream) Pemanenan Sel Pemisahan Sel Pengkondisian Media Cair (Broth) Penghancuran Sel Mekanis Non mekanis Sentrifugasi Sedimentasi Pemurnian Produk Kromatografi Destilasi Filtrasi Tahap Akhir Kristalisasi Pengeringan

9 Pemanenan Sel Pemisahan padatan cairan untuk membersihkan atau memindahkan sel dari suatu media Pemilihan metode pemisahan sel didasarkan pada : ukuran dan morfologi mikroorganisme (sel tunggal, agregat atau miselia), viskositas serta reologi dalam media fermentasi.

10

11 Pengkondisian Media Media Cair Cair (Broth Conditioning) Metode yang paling sering digunakan untuk mengikat atau mengumpulkan sel Biasanya menggunakan teknik pengendapan

12 Sentrifugasi Metode pemisahan partikel menggunakan gaya gravitasi pada medan sentrifugasi, pada berbagai ukuran dan densitas campuran suatu larutan Diaplikasikan pada campuran solid-liquid dengan efisiensi yang sangat tinggi Keuntungan : dapat digunakan untuk memisahkan campuran secara cepat baik dalam volume besar maupun kecil Kekurangannya : butuh modal yang besar, kebisingan sleama proses, biaya listrik tinggi, kemungkinan sel menjadi pecah,sulit mengontrol suhu, terbentuknya bioaerosol (sumber limbah terbesar)

13 Sentrifugasi Tdd : skala besar dan skala kecil 4 tipe sentrifugal : 1. Tubular centrifuge 2. Multichamber bowl centrifuge 3. Disc stack centrifuge 4. Screw decanter centrifuge

14 Tubular Centrifuge Memiliki hollow tubular rotor yang menyediakan saluran panjang untuk suspense yang dipompa masuk dari bawah dan mengalirkannya ke atas melalui baling-baling Partikel akan terlempar ke samping

15 Multichamber Bowl Centrifuge Tdd mangkuk yang terbagi secara vertical menjulang yang saling berhubungan dalam silinder Cairan masuk melalui tengah melewati setiap ruang dan partikel kecil akan terkumpul di mangkuk terluar

16 Disc Stack Centrifuge Dapat beroperasi pada g Mangkuk sentrifus tdd tumpukan [iringan yang membentuk kerucut yang membantu proses pemisahan Pada saat cairan memasuki sentrifus, partikel material terlempar keluar dan menyangkut di luar piringan kerucut. Partikel kemudian mengalir keluar dan terkumpul didinding mangkuk Biasanya memiliki fasilitas untuk mengeluarkan partikel yang terkumpul selama proses

17 Screw decanter centrifuge Beroperasi pada g Cocok untuk padatan konsentrasi tinggi Juga digunakan dalam pembuangan kotoran untuk pemisahan lumpur dan untuk pemanenan yeast dan miselium jamur

18 Sedimentasi Dapat dilakukan pada berbagai tahap proses pemurnian produk yang sangat berguna memungkinkan enrichment dan konsentrasi produk dalam satu tahap proses, sehingga mengurangi volume bahan untuk proses selanjutnya Prinsi : pengaruh gaya gravitasi yang terjadi pada partikel bahan sehingga terbentuk endapan yang terpisah dari cairannya Hasil disebut supernatant atau sludge

19 Filtrasi Filtrasi konvensional dari liquid yang mengandung padatan tersuspensi menggunakan filter yang tersusun dari media penyerap (cloth, glass woll, atau cellulose) yang menahan padatan sehingga menghasilkan cairan bebas padatan Umumnya digunakan untuk memanen filamen jamur tetapi kurang efektif untuk menyaring bakteri Tdd : 1. Plate dan Frame filter 2. Rotary vacuum filter

20 Plate dan Frame filter Berbentuk rak horizontal yang berselang-seling dari plate penyerap dan kerangka berlubang, Rak horizontal ini menjulang dalam penyangga yang terikat dengan hidrolik Filter cloth ditempatkan di antara plat yang terdapat saluran aliran untuk feed dan menyerap aliran Prosesnya batch peralatan harus dibongkar untuk mengambil filter cake yang terkumpul Digunakan untuk memanen mikroorganisme dari fermentasi termasuk mempersiapkan ragi roti, mengembalikan endapan protein dan pemisahan air dari lumpur kotoran

21 Rotary Vacuum Filter Sistem filtrasi kontiniu yang digunakan untuk memanen miselium jamur dalam pembuatan antibiotika, untuk produksi baker yeast dan dalam pemisahan air dari lumpur kotoran pada pengolahan limbah Peralatan tdd : drum berlubang yang dilengkapi dengan media filter Drum berotasi terus menerus secara lambat yang berisi suspense yang akan disaring Padatan akan terkumpul dalam media filter, sedangkan filtrat keluar perlahan karena adanya tekanan vakum, melewati media filter dan masuk ke dalam drum berlubang lalu ke bejana.

22 Penghancuran Sel (Cell Disruption) Target akhir dari proses hilir untuk produk intraseluler adalah enzim, protein rekombinan dan produk lain yang terdapat di dalam sel perlu merusak dinding sel dan membrane sitoplasma dari mikroorganisme Masalah pada saat penghancuran sel : pembebasan DNA yang dapat meningkatkan viskositas suspense Dapat dilakukan secara : Mekanis dan Non Mekanis

23 Penghancuran Sel Sel Secara Secara Mekanis Metode liquid shear lebih efektif untuk bakteri, jamur, dan miselium jamur Alat : disruptor homogenizer suspense sel ditarik melalui katup ke slinder Perusakan sel dicapai ketika liquid shear yang tinggi berada di lubang yang diberikan tekanan secara mendadak Beroperasi pada tekanan tinggi hingga 2500 Bar

24 Penggilingan Didasarkan pada solid shear yang meliputi tekanan untuk pembekuan sel dapat digunakan untuk skala kecil Salah satu metode pemecahan sel secara mekanis dengan menggunakan media penggilingan seperti manik-manik kaca Menggunakan suatu wadah atau ruang penggilingan vertical atau horizontal dengan piringan atau impeler yang berotasi Piringan atau impeller digerakkan oleh shaft yang dihubungkan dengan motor listrik Pergerakan secara rotasi akan menyebabkan manikmanik kaca atau plastic menggiling suspensi sel secara merata gaya gesek solid Pada ruang atau wadah penggilingan terdapat pelat sehingga manik-manik dapat dipisahkan dan tertahan di dalamnya

25 Penghancuran Sel Sel Secara Secara Mekanis Perusakan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan metode ultrasonic yang melibatkan gelombang suara Alat : penggetar ultrasonic yang menghasilkan suara berfrekuensi tinggi dengan densitas gelombang ratarata 20 khz/detik.

26 Penghancuran Sel Sel Secara Secara Non Non Mekanis Metode : 1. Autolisis 2. Osmotic shock 3. Liofilisasi 4. Thermolysis

27 Autolysis Digunakan untuk memecahkan sel khamir Kelebihan : harganya murah dan menggunakan enzim mikroorganisme yang sebenarnya sehingga tidak ada zat asing yang masuk ke produk Osmotic Shock Digunakan untuk mengambil produk dari periplasma Berpengaruh pada penurunan tekanan osmotic dalam sel yang akan menyebabkan sel pecah dan mengeluarkan komponen sel Bakteri Gram negatif lebih rentan terhadap perubahan tekanan osmosa yang besar dibandingkan bakteri Gram positif Bila bakteri diletakkan dalam media dengan tekanan osmosa tinggi (mis. larutan sukrosa20%) sampai dicapai keadaan setimbang, kemudian dipindahkan ke dalam air, maka akan timbul aliran air dari media ke dalam sel, sehingga akan menyebabkan pecahnya dinding sel.

28 Thermolysis Bakteri Gram-negatif apabila dipanaskan hingga temperatur o C akan merusak struktur membran luar, sehingga dapat diperoleh protein pada ruang periplasmik. Pada suhu 90 o C, dapat diperoleh protein pada sitoplasma, pada E. coli. Pada bakteri Gram-positif, metode termolisis kurang efektif. Keuntungan : dapat membunuh inang, sehingga mengeliminasi organisme rekombinan pada proses hilir, mendeaktivasi enzim protease, dan memberikan sisa sel dengan ukuran yang masih relatif besar, sehingga pemisahan produk dapat dilakukan dengan mudah. Kerugian : apabila produk yang diinginkan tidak terlarut dalam kaldu fermentasinya, maka pemisahan produk dengan sisa sel akan menjadi sulit. Liofilisasi Liofilisasi atau freeze drying menyebabkan dinding sel rusak akibat pembentukan kristal es di dalam sel. Sampel diatur hingga mencapai tekanan 1 kpa dan suhu -40 o C. Sampel didinginkan perlahan agar kristal es yang terbentuk di dalam sel lebih besar. Memerlukan energi yang tinggi biaya besar untuk proses pembekuan sampel, sublimasi, desorpsi dan kondensasi air, serta penggunaan pompa vakum untuk menurunkan tekanan Keuntungan : tidak merusak protein dan enzim di dalam sel, sehingga produk yang diperoleh relatif baik

29 PEMURNIAN PRODUK Tujuan : untuk memurnikan produk dari pecahan sel atau kotoran lainnya Jika produk yang ditargetkan berupa protein metodenya : Salting out protein diikuti pengendapan melalui sentrifugasi Proses salting out menggunakan ammonium sulfat karena kelarutannya yang tinggi, toksisitas rendah dan biaya murah Pengurangan kelarutan protein juga dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut organ seperti : aseton, etanol dan isopropanol Etanol : terdapat keseimbangan antara efek melarutkan dan sifat hidrofilik yang cukup untuk mengurangi denaturasi. Isopropanol : digunakan untuk presipitasi enzim ekstraseluler seperti amiloglukooksidase mempunyai sifat mudah terbakar dan cenderung hidrofobik. Aseton : harus ditambahkan secara perlahan melalui sisi samping wadah Metode lain : teknik kromatografi, dialysis, dan elektrodialisis

30 Metode Penggumpalan Penggumpalan dengan dengan Garam Ion garam mempengaruhi kelarutan protein Pada konsentrasi rendah ion-ion garam melingkungi molekul protein dan mencegah bersatunya molekul protein sehingga protein melarut SALTING IN Pada konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik mantel air dari koloid protein interaksi hidrofobik dianatra sesama molekul protein pada suasana ionik akan menurunkan kelarutan protein SALTING OUT. Salting out dengan garam proses pemisahan yang murah. Garam yang ditambahkan : amonium sulfat, natrium sulfat, sodium fosfat dsb.

31 TEKNIK KROMATOGRAFI DALAM PEMURNIAN PRODUK Merupakan cara pemisahan berdasarkan perbedaan interaksi antara komponenkomponen yang akan dipisahkan dengan fasa diam dan fasa gerak Harus pempertimbangkan kapasitas, pemulihan dan selektivitas Pemisahan dengan kromatografi berhubungan dengan : Kecenderungan suatu molekul larut dalam suatu cairan Kecenderungan suatu molekul untuk melekat pada suatu matriks Kecenderungan suatu molekul untuk menguap

32

33 Different Chromatographic Techniques

34

35

36 Jenis-jenis kromatografi : Kromatografi Partisi Mis. Kromatografi kertas Kromatografi Adsorpsi Mis. TLC Kromatografi Penukaran Ion Mis. Resin penukar ion Kromatografi Penyaringan Molekul Mis. Filtrasi gel Kromatografi Affinitas

37

38 Dialisis

39 Elektroforesis Elektroforesis ilmu yang mempelajari pergerakan molekul yang bermuatan dalam medan listrik Dapat digunakan untuk identifikasi dan analisis polimer biologi yang bermuatan. Teknik yang relatif murah dan mudah untuk menganalisa dan memurnikan macammacam biomolekul, khususnya protein dan asam nucleat. Migrasi Molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh: ukuran, bentuk, muatan, dan komposisi kimia molekul.

40 Elektroforesis... Gel yang digunakan : gel pati, agarosa, poliakrilamida. Untuk memisahkan dan menentukan jumlah dan ukuran protein atau rantai sub unit protein digunakan elektroforesis gel dengan SDS (Sodium Dodesil Sulfat).

41 Gambar. Pemisahan Protein dengan Elektroforesis

42

43 Tahapan Akhir (Finishing Step) Kristalisasi Pengeringan

44 Kristalisasi Penguapan atau penambahan bahan kimia yang reaktif dengan zat terlarut Kelarutan produk dapat dikurangi dengan penambahan pelarut, garam, polimer (PEG), dan polielektrolit

45 Pengeringan 1. Rotary Drum Digunakan untuk menghilangkan air dengan mekanisme konduksipanas Cocok untuk sistem batch dengan volume kecil seperti produk obat-obatan 2. Spray Drying Atomisasi dan penyemprotan campuranproduk ke dalam ruang yang dipanaskan Partikel kering yang dihasilkan dipisahkan dari gas menggunakan cyclone separator 3. Freeze Drying Untuk proses yang produk akhirnya adalah sel hidup untuk persiapan kultur starter atau untuk produk terimobilisasi Produk : enzim, obat-obatan yang memerlukan aktivitas biologis