BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Hewan Coba FK UNS Surakarta dan Laboratorium Patologi Anatomi FK UNS Surakarta selama periode bulan Februari2016. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan desain randomized controlled trial yang menggunakan tikus Wistar dengan umur 2-2,5 bulan dan berat badan antara gram yang diberi perlakuan dilakukan incisi sepanjang 2 cm. Pada kelompok perlakuan diberikan Ketotifen dengan dosis 0,3 mg/kg bb. Pemberian Ketotifen dilakukan setelah incisi dan dilanjutkan dengan pemberian dosis ulangan tiap 12 jam selama 6 hari.setelah 6 hari pasca incisi, dilakukan euthanasia pada tikus Wistar dengan dibius menggunakan Ketamin 50mg/kg BB IM, dan selanjutnya dilakukan dislokasi tulang servikal. Setelah tikus dimatikan, kemudian pada jaringan bekas incisi dibuat eksisi biopsi, dan dimasukkan ke dalam larutan buffer. Untuk selanjutnya jaringan dibawa ke laboratorium patologi anatomi untuk dibuat preparat dengan menggunakan pengecatan khusus Toluidine Blue. 1. Deskripsi Data Infiltrasi sel Mast jaringan dari tiap kelompok dilihat dengan menggunakan pengecatan khusus Toluidine Blue. Hasilnya dihitung dengan menggunakan mikroskop Olympus BW 5. Dengan perbesaran 400x, pada lima lapang pandang dan dihitung sel yang positif pada lapang pandang tersebut. Luas luka didapatkan dengan melakukan pengukuran dengan alat ukur dengan bantuan perangkat lunak sehingga didapatkan luas luka yang sesuai. 41

2 42 Gambar 7. Grafik box plot infiltrasi sel Mast Gambar 8. Grafik box plot luas luka

3 43 Dari grafik box plot terlihat bahwa infiltrasi sel Mast (gambar 7) dan luas luka (gambar 8) dari kelompok tikus yang diberikan Ketotifen terlihat lebih kecil dibandingkan dengan kelompok tikus kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian Ketotifen pada hewan coba yang dilakukan luka incisi, secara bermakna akan mengurangi luas luka jika dibandingkan dengan hewan coba yang tanpa pemberian Ketotifen. 2. Uji Normalitas Uji Normalitas ditujukan untuk mengetahui apakah data laboratoris terdistribusi normal atau tidak. Pengujian dilakukan dengan uji Shapiro-Wilk. Tabel 3. Uji Normalitas data infiltrasi sel Mast Kelompok p* Keterangan Kontrol.217 Normal Perlakuan.485 Normal Normal bila p >0.05 Tabel 4. Uji Normalitas data luas luka Kelompok p* Keterangan Kontrol.290 Normal Perlakuan.561 Normal Normal bila p >0.05 Dari tabel 3 menunjukkan data untuk penghitungan infiltrasi sel Mast kelompok kontrol dan perlakuan mempunyai varians data normal (p > 0.05). Dari tabel 4. menunjukkan untuk data pengukuran luas luka, kelompok kontrol dan perlakuan mempunyai varians data normal (p > 0.05).

4 44 3. Uji Beda Infiltrasi Sel Mast dan Luas Luka Uji beda infiltrasi sel Mast dan luas luka dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan bermakna antara infiltrasi sel Mast dan luas luka pada kelompok placebo dibandingkan dengan kelompok kontrol dan perlakuan. Uji beda ini dilakukan dengan menggunakan uji statistik Independent t-test karena didapatkan distribusi data yang normal. Tabel 5. Hasil uji beda Independent t-test luas luka kelompok kontrol dan perlakuan Kelompok Mean Mean Difference Std error p* Kontrol (sel) / Perlakuan (sel) / *signifikan bila p < Tabel 6. Hasil uji beda Independent t-test infiltrasi sel Mast kelompok kontrol dan perlakuan Kelompok Mean Mean Difference Std error p* Kontrol (mm 2 ) / Perlakuan (mm 2 ) /-4.33 *signifikan bila p < Dari tabel 5 didapatkan adanya perbedaan infiltrasi sel Mast yang signifikan antara kelompok kontrol dan perlakuan (p < 0.05). Rerata dari kelompok tikus yang diberikan perlakuan terlihat lebih kecil dibandingkan dengan kelompok kontrol. Dari tabel 6 didapatkan adanya perbedaan luas luka yang signifikan antara kelompok kontrol dan perlakuan (p < 0.05). Rerata dari kelompok tikus yang diberikan Ketotifen terlihat lebih kecil dibandingkan dengan kelompok tikus kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian Ketotifen pada hewan coba yang dilakukan luka incisi, secara bermakna akan mengurangi luas luka dan infiltrasi sel Mast jika dibandingkan dengan hewan coba yang tanpa pemberian Ketotifen.

5 Gambar 9 : infiltrasi sel Mast di sekitar luka incisi dengan pengecatan Toluidine Blue difoto dengan mikroskop Olympus BW5 dengan perbesaran 400x. Kiri: infiltrasi sel Mast dengan pemberian placebo setelah 6 hari(kontrol). Kanan : infiltrasi sel Mast dengan pemberian Ketotifen 0.3mg/kgBB per 12 jam setelah 6 hari. Sel Mast tampak berwarna ungu. 45

6 Gambar 10 : Luas luka diukur dengan teknik fotografi dibantu dengan piranti lunak IMAGEJ. Kiri: luas luka incisi dengan pemberian placebo setelah 6 hari(kontrol). Kanan : luas luka incisi dengan pemberian Ketotifen 0.3mg/kgBB per 12 jam setelah 6 hari. Bidang yang dibatasi garis berwarna kuning adalah batas tepi luka. 46

7 47 B. Pembahasan Penyembuhan luka terdiri dari beberapa fase temporal yang saling tumpang tindih, yaitu: hemostasis, inflamasi, proliferasi, dan maturasi. Sel Mast adalah sel yang umum ditemukan sebagai resident, secara tradisional sel Mast disebutkan sebagai sel efektor dari reaksi alergi yang dapat menyimpan dan mensintesis de Novo banyak mediator pada saat aktivasi oleh berbagai rangsangan. Wawasan baru yang menarik menunjukkan keterlibatan sel Mast dalam gangguan patogenesis jaringan ikat termasuk penyembuhan luka dan fibrosis. Penyembuhan luka yang tidak normal dikaitkan dengan peningkatan jumlah sel Mast yang secara strategis terletak di sekitar pembuluh darah. Manipulasi terapi terhadap populasi sel Mast dan reaktivitasnya mungkin dapat memperbaiki dan bahkan mencegah proses perbaikan yang terganggu yang belum ada obatnya (Oskeritzian C., 2012). Ketotifen sebagai stabilisator sel Mast mencegah degranulasi sel Mast, yang akan meningkatkan produksi sitokin pro inflamasi yang memicu masuknya sel Netrofil, Makrofag dan sel Mast tambahan dalam jumlah besar ke dalam jaringan. (Chen Lin et al., 2014; Finn dan Walsh, 2013; Monument et al., 2010). Pada penelitian ini, 20 ekor tikus Wistar dibuat incisi sepanjang 2 cm sedalam subkutan pada punggungnya. 10 ekor diantaranya diberikan Ketotifen oral, yang dilakukan pada dua jam sebelum incisi sampai 6 hari pasca incisi, dengan waktu pemberian dilakukan tiap 12 jam, 10 ekor lainnya diberi perlakuan dengan placebo sebagai kelompok kontrol. Pada hari ke enam, dilakukan pengambilan gambar dengan kamera digital pada luka dan kemudian diambil jaringan pada seluruh sampel dan dilanjutkan dengan pembuatan dan pengecatan preparat sampai pada pembacaan hasil. Pengambilan biopsi jaringan dilakukan pada hari keenam, dimana healing cascade diperkirakan sudah memasuki tahap proliferasi. Hasil penelitian ini menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna terhadap infiltrasi sel Mast diantara kelompok kontrol dan perlakuan (p < 0.05). Untuk uji normalitas menunjukkan kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan mempunyai varians data normal dengan p > Untuk luas luka juga terdapat perbedaan yang bermakna terhadap luas luka diantara kelompok kontrol dan perlakuan (p < 0.05). Untuk uji normalitas menunjukkan kelompok kontrol dengan perlakuan mempunyai varians data normal dengan p > 0.05.

8 48 Hasil tersebut menunjukkan bahwa pemberian Ketotifen dengan dosis 0.3mg/kg BB, dimana dosis tersebut merupakan dosis konversi tikus dengan dosis 0.025mg/kg BB orang dewasa, efektif dalam menurunkan luas luka dan infiltrasi sel Mast yang terjadi pasca incisi. Hal itu dilihat dari adanya perbedaan yang signifikan luas luka dan infiltrasi sel Mast antara kelompok Ketotifen dengan kelompok kontrol. Pada kelompok Ketotifen, terjadi penurunan yang signifikan terhadap luas luka maupun infiltrasi sel Mast. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh Serna H. dan kawankawan (2006) membuktikan bahwa dengan pemberian Ketotifen mampu mengurangi infiltrasi sel Mast di jaringan mukosa usus tikus Sprague-Dawley sehingga mencegah hiperplasia mukosa usus dan eksaserbasi respon motorik akibat inflamasi intestinum. Penelitian Monument MJ dan kawan-kawan (2010) juga menyatakan adanya penurunan infitrasi sel Mast pada kapsul sendi kelinci setelah pemberian Ketotifen, penelitian ini mendemonstrasikan bahwa hewan yang diberikan stabilisator sel Mast dapat mengurangi secara signifikan terhadap beratnya kontraktur sendi, kadar miofibroblas dan hiperplasia sel Mast. Penelitian Nauta dan kawan-kawan (2013) mem bandingkan penyembuhan luka antara jenis tikus C57BL/6-Kit(W-sh/W-sh), WBB6F1-Kit(W/W-v), and Cpa3-Cre; Mcl- 1(fl/fl) dan tikus wild type sebagai kontrol, dari penelitian tersebut didapatkan bahwa tidak ada perbedaan kecepatan penutupan luka antara tikus dengan defisiensi sel Mast dibandingkan dengan tikus kontrol, juga tidak didapatkan perbedaaan jaringan parut yang terjadi dan kolagen yang terbentuk antara tikus dengan defisiensi sel Mast dibandingkan tikus kontrol, hal ini membuktikan bahwasanya sel Mast tidak terlalu penting dalam proses penyembuhan. Sebaliknya penelitian Weller dan kawan-kawan (2006) dengan subyek MCdeficient Kit W / Kit WƲ, tikus normal dengan Kit +/+, dan tikus dengan MC-reconstituted Kit W / Kit WƲ. Pada penelitian ini didapatkan bahwa pada tikus dengan defisiensi sel Mast, didapatkan rekrutmen Netrofil lebih rendah, permeabilitas vaskuler turun, dan luas luka lebih luas, disimpulkan bahwa sel Mast dan pelepasan Histamin dibutuhkan untuk untuk penyembuhan luka kulit tikus secara normal, hasil yang berlawanan ini disebabkan perbedaan metode penelitian yang lebih fokus ke awal fase penyembuhan dalam hal ini fase inflamasi yang memang membutuhkan respon cepat dari sel Mast resident.

9 49 Sel Mast merupakan salah satu dari sel yang diduga berperan dalam memelihara proses inflamasi, karena dengan aktivasi dari sel Mast, sel Mast resident umumnya mengalami degranulasi setelah terjadinya luka, sehingga jarang ditemukan pada awal cedera, jumlahnya mulai kembali normal dan meningkat setelah 48 jam setelah cedera dan aktivasi dari sel Mast akan berperan dalam proses inflamasi, yang meliputi vasodilatasi, peningkatan permeabilitas, dan aktivasi/rekrutmen dari sel imunitas dalam darah tepi sebagai akibat dari dilepaskannya berbagai macam mediator yang bersifat pro inflamasi disamping histamin, dua mediator yang diduga berperan dalam pemeliharaan inflamasi adalah Chymase dan Triptase (Diegelman, 2004; Eming, et al. 2007; Rajan dan Murray, 2008). Ketotifen Fumarat selain melalui aksinya sebagai antagonis reseptor Histamin, beberapa dari efek obat ini berhubungan dengan aksinya menghambat pelepasan mediatormediator proinflamasi dari sel Mast dan Netrofil. Beberapa penelitian maupun trial klinik membuktikan bahwa, Ketotifen mampu mencegah degranulasi sel Mast dan menurunkan pelepasan Histamin, Protease, Mieloperoksidase, Lekotriene, PAF, dan beberapa jenis Prostaglandin, hal ini secara langsung akan mengurangi fungsi Eosinofil dan viabilitasnya yang nantinya akan mempercepat penyembuhan luka (Heyman et al., 1997). Dengan adanya fungsi Ketotifen sebagai inhibit releasing mediator pro-inflamasi diharapkan dapat membantu dalam mengendalikan proses inflamasi yang terjadi pasca cedera jaringan, yang selanjutnya diharapkan bahwa pada periode inflamasi yang terjadi dalam tahap-tahap penyembuhan luka, akan berjalan tanpa respon inflamasi yang berlebihan dan berkepanjangan. Akhirnya diharapkan bahwa healing cascade dapat berlangsung lebih cepat dan menuju ke fase proliferasi yang pada akhirnya akan mempercepat penyembuhan dan mengurangi resiko terjadinya komplikasi lanjutan seperti wound dehiscence, atau timbulnya luka kronis dan jaringan parut yang berlebihan. Ketotifen merupakan suatu obat dengan beberapa aktivitas, diantaranya adalah efek anti histamin dan efek stabilisasi membran sel Mast, obat ini sudah lama digunakan dalam terapi penyakit-penyakit yang melibatkan aktivasi dan pelepasan mediator oleh sel Mast dalam contoh patogenesisnya, sebagai contoh: asma bronkial, urtikaria maupun seasonal allergic conjunctivitis. Efektivitas dari Ketotifen telah dibandingkan terhadap obat-obat sejenis, misalnya Sodium Kromoglikat pada asma, Ketotifen juga dibuktikan sama

10 50 efektifnya untuk terapi urtikaria dibandingkan dengan Ceterizine, Loratadine, Astemizole, dan Emedastine. Ketotifen dipatenkan oleh Sandoz dan sudah dipakai sejak 1980, hal itu menunjukkan bahwa obat tersebut sudah terbukti aman untuk penggunaan klinis. Ketotifen juga tersedia luas, sehingga mudah didapatkan, dan dosis pemberian hanya dua kali sehari akan meningkatkan ketaatan pasien dalam penggunaan obat ini. Namun sayangnya di Indonesia saat ini belum tersedia sediaan generik dari obat ini, sehingga dari segi ekonomis obat ini menjadi lebih mahal, walaupun bila dibandingkan dengan obat paten lain masih pada level harga yang sama Dari penelitian ini ada beberapa hal baru yang bisa didapat, yakni bahwa sel Mast berperan dalam penyembuhan luka incisi, dan bahwa pemberian antihistamin seperti Ketotifen dapat mempercepat proses penyembuhan luka, sehingga bisa menjadi landasan untuk penelitian lanjutan baik pada hewan coba maupun pada manusia. Sehingga bisa dihasilkan kesimpulan yang lebih kuat untuk mendasari disusunnya protokol yang baru untuk mencegah timbulnya gangguan penyembuhan luka operasi, terutama pada pasien pasien yang berisiko tinggi. C. Keterbatasan Penelitian Pada pelaksanaan penelitian ini, peneliti memiliki keterbatasan pada pemberian obat per oral. Karena metode pengencerannya masih sederhana, maka kesesuaian perhitungan dosis tidak dapat dilakukan dengan sangat presisi. Belum bisa dilakukan penelitian untuk dengan menggunakan berbagai variasi dosis dari masing-masing obat untuk mengetahui dosis yang memberi efek yang maksimal. Perlu dibandingkan efektifitas antara Ketotifen dan obat antihistamin lain yang dapat mempengaruhi kecepatan penyembuhan luka. Perlu dilakukan pemeriksaan lebih lanjut untuk memastikan bahwa aktivitas sel Mast berkaitan dengan penyembuhan luka.