111. BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 111. BAHAN DAN METODE Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih, Jurusan Budi Daya Pertanian, Fakultas Pertanian, Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman, Laboratorium Mikrobiologi clan Biokimia, PAU Bioteknologi IPB. Pelaksanaan penelitian dimulai bulan Januari 1997 sampai Oktober Penelitian ini terdiri atas dua seri penelitian (Gambar 6). Penelitian I. Studi Kriteria Analisis Vigor Benih dengan Mekanisme Pulih Vigor. Penelitian ini bertujuan untuk meneliti mekanisme pemulihan kriteria analisis vigor benih. 1 a. Mekanisrne Pulih Vigor. vigor untuk Benih kedelai varietas Wilis yang digunakan merupakan has11 panen tanggal 20 Januari 1997 dari Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih Leuwikopo, Darmaga. Lot-lot benih dengan ragam viabilitas dibuat secara alami dan buatan. Pembuatan lot secara alami dilakukan dengan menyimpan benih dalam kondisi terbuka dengan taraf penyimpanan 0, 1, 2,..., 9 minggu (MO sampai dengan M9). Pembuatan lot dengan cara buatan dilakukan melalui proses devigorasi dengan pe- ngusangan cepat dalam deraan uap etanol dengan MPC IPB 77-1 pada taraf TO, TI, T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, dimana T O benih tanpa penderaan, T1 = ( ) menit, yang artinya dalam hembusan etanol selama 10 menit dan dibiarkan dalam etanol jenuh selama 10 menit. T2 = 2 x TI,... T8 = 8 x TI. Benih dilembabkan selama 6 jam sebelum diberi perlakuan etanol dan dikeringkan ke keadaan semula setelah perlakuan etanol.

2 Penelitian I Variasi lot benih oleh deteriorasi Variasi lot benih oleh devigorasi Lot benih dengan pulih vigor terlinggi Mekanisrne pulih vigor dengan parameter biok Penelitian I1 Pernanfaatan invigorasi untuk kriteria analisis benih vigor tinggi dan vigor sedang I Blended seed lot berbagai variasi rasio,lnvigorasi f Oeteksi viabilitas blended seed lot Garnbar 6. Skema pelaksanaan penelitian

3

4 U Ai Bj (AB)ij Eij k = rataan mum = pengaruh faktor tingkat viabilitas = pengaruh faktor invigorasi = pengaruh interaksi faktor A ke-i dengan faktor B ke-j = pengaruh acak Vigor benih dengan indikasi fisiologi (VgfiSiO') Parameter Viabilitas Potensial (Vp) diamati dengan tolok ukur DB. Parameter vigor (Vg) diamati dengan tolok ukur KST. Vigor benih dengan indikasi biokimiawi (vgbiok) Indikasi biokimiawi diamati dengan tolok ukur kandungan asam fitat, jurnlah P yang diesterifikasi oleh mitokondria dan aktivitas enzim peroksidase. lb. Hubungan antara V,"~'O' dan vgbiok Berdasarkan data penelitian la dilakukan analisis regresi linier Y= a + b X (X= indikasi fisiologi ; Y= indikasi biokimiawi) untuk mengetahui hubungan antara tolok ukur vigor benih dengan indikasi fisiologi dan vigor benih dengan indikasi biokimiawi. lc. Pemantapan mekanisme pulih vigor.- Berdasarkan hasil penelitian invigorasi pada beberapa taraf deteriorasi maupun devigorasi (Tabel Larnpiran 1 dan 2), maka lot benih yang dapat mencapai pulih vigor tertinggi yaitu penyimpanan 6 minggu dianalisis lebih lanjut untuk pemantapan mekanisme proses pulih vigor. Lot benih diberi perlakuan 1) Tanpa invigorasi, 2) Invigorasi dengan larutan KHzP04 ( 32.7 g/l) dan 3) Invigorasi dengan

5 larutan PEG (260 g/l). Metode osmotic priming dilakukan seperti pada penelitian 1 a. Indikasi fisiologi diamati dengan tolok ukur DB dan KST, sedangkan indikasi biokimiawi diamati dengan tolok ukur kandungan asam fitat, aktivitas enzim fitase dan pola pita protein. Id. Konsumsi energi selama perkecambahan Asam fitat di dalarn penelitian ini diteliti lebih rnendalam sebagai surnber P selama perkecambahan benih dan merupakan gambaran bagaimana konsumsi energi selama perkecambahan. Pada benih pulih vigor diduga penggunaan energi selama perkecambahan lebih efisien dan asam fitat merupakan salah satu tolok ukmya. Untuk memperkuat hipotesis tentang konsumsi energi selama perkecambahan, dilakukan analisis dari benih yang dikecambahkan pada kondisi gravitasi < 1 menurut metode Carlson (1996) yang dimodifikasi (Gambar 8) dan kontrol. Benih ditanam dalam kertas merang lembab berlapis plastik dan diletakkan pada roda yang berputar searah poros dengan kecepatan 7 rpm dan tegak lurus poros dengan kecepatan 14 rpm. Jarak antara benih dengan poros 18 cm. Indikasi fisiologi yang diamati adalah panjang akar dan panjang hipokotil, bobot kering kecambah, indikasi biokimiawi diamati dengan tolok ukur asam fitat. 11. Pemanfaatan Invigorasi untuk Deteksi Tingkat Pulih Vigor. 2a. Aplikasi Pulih Vigor untuk Kriteria Analisis Vigor Benih Proses invigorasi diukur dengan tingkat pulih vigor yaitu selisih nilai viabilitas benih baik yang dinyatakan dengan tolok ukur fisiologi maupun biokimiawi antara lot benih yang diinvigorasi dan kontrolnya (tanpa invigorasi).

6

7 2b. Aplikasi Pulih Vigor dalam SeedBIending Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari kemungkinan benih vigor sedang dapat dicampur secara optimal dengan benih vigor tinggi sehingga terwujud seed blending yang memuaskan. Selain itu penelitian ini bertujuan untuk mempelajari metode osmotic priming dalam penentuan efektivitas rasio dalam blending. Keterangan : Benih vigor tinggi : adalah lot yang terletak sebelum titik belok pertama. Benih vigor sedang : adalab lot benih yang terletak antara tit& belok pertama dan titik maksimum kurva Benih Vigor rendah : adalah lot benih yang terletak antara titik maksimum kurva dan titik belok kedua Benih Vigor nihil : adalah lot benih yang terletak setelah titik belok kedua. Tingkat Pulih Vigor : selisih antara Vp maupun Vg antara benih yang diberi perlakuan osmotic priming dengan PEG 6000 dm kontrol. Gambar 9. Teoritis kriteria vigor benih berdasarkan tingkat pulih vigor.

8 Variasi rasio blending yang dicobakan dapat dilihat pada Tabel 1. Lot benih vigor tinggi yaitu lot benih dengan DB sekitar 95 % dan lot benih vigor sedang yaitu benih dengan DB sekitar 80%. Selanjutnya untuk pengujian pulih vigor lot-lot benih tersebut diberi perlakuan osmotic priming dengan larutan KH2P g /l. Metode osmotic priming dilakukan seperti pada penelitian la. Indikasi viabilitas yang diamati adalah indikasi fisiologi dengan tolok ukur DB dan KST, indikasi biokimiawi dengan tolok ukur kandungan asarn fitat dm jumlah P yang diesterifikasi mitokondria. Tabel 1. Variasi rasio blending lot benih vigor tinggi dan sedang Lot I Lot I1 Lot I11 Lot IV Lot V Lot VI Vigor tinggi 85 % 80 % 75 % 70 % 65 '10 60 % Vigor sedang 15 % 20 % 25 % 30 % 35 % 40 Oh Percobaan faktorial dengan dua faktor disusun dalam rancangan acak lengkap. Faktor I adalah rasio blended seed dengan enarn taraf (Tabell). Faktor I1 adalah perlakuan invigorasi dengan dua taraf yaitu tanpa invigorasi clan invigorasi dengan larutan KH2P04. Model rancangan statistik yang digunakan adalah : Yijk = U + Ai + Bj + (AB)ij + Eijk Yijk = hasil pengarnatan u - rataan umum Ai = pengaruh faktor rasio blended seed Bj = pengaruh faktor invigorasi (AB)ij = pengaruh interaksi faktor A ke-i dengan faktor B Eij k = pengaruh acak

9 Penentuan rasio yang optimum dalam blending dilakukan dengan analisis data tingkat pulih vigor dengan regresi polinornial tingkat tinggi. Pada kurva tingkat pulih vigor yang menunjukkan garis konstan, maka rasio dalam kisaran ini termasuk optimum, apabila garis tingkat pulih vigor menanjak maka rasio blending ditolak (Gambar 5). Metode analisis secara fisiologi dan biokimiawi yang digunakan untuk penelitian adalah sebagai berikut : 1. Nilai DB Benih ditanam dengan metode Uji ~ e & Digulung didirikan dengan plastik. (UKDdp) pada kertas merang lembab. Setiap gulung ditanam 25 butir benih. Pengamatan dilakukan dua kali yaitu pada hari ke-3 (hitungan I) dan hari ke-5 (hitungan 11). DB dihitung berdasarkan persentase kecambah normal pada hitungan I dan Nilai KST Benih ditanam dengan metode UKDdp pada kertas merang lembab. Setiap gulung ditanam 25 butir benih. Pengamatan dilakukan pada hari ke-4 berda- sarkan persentase kecambah normal kuat. Kriteria kecambah normal kuat adalah panjang akar minimal 10 cm dengan akar sekunder yang lebat, panjang hipokotil minimal 4 cm, kondisi akar, hipokotil dan kotiledon tidak cacat. 3. Jumlah P teresterifikasi oleh mitokondria. Ekstraksi mitokondria dilakukan dengan metode Abu-Shakra dan Ching (1967). Hipokotil kecambah umur 4 hari diblender dengan larutan penyangga (Tabel Larnpiran 3) dengan perbandingan 4 ml/g hipokotil. Selanjutnya campuran disaring dengan kain. Kloroplas dan debris diendapkan dengan tiga kali sentrifigasi: 1000, 2000 dan 3000 g selarna 10 menit. Fraksi mitokondria

10 diendapkan dengan sentrifugasi g selama 20 menit. Selanjutnya endapan disuspensikan di dalam penyangga Tris/sukrosa (Tabel Lampiran 3). Jumlah P yang diesterifikasi oleh mitokondria dihitung berdasarkan pg P anorganik teresterifikasi, berdasarkan selisih jumlah awal dan setelah akhir periode inkubasi (Mattoon dan Walter, 1967). Inkubasi dilakukan dengan membuat campuran reaksi dengan total volume 2 rnl yang terdiri dari : 20 p mol malat, 2 pmol KH2P04, 2 prnol ADP, 20 pmol glukosa, 150 unit enzim heksokinase, 10 pmol MgC12, 10 mg bovin serum albumin, 60 pmol tris, 2 prnol EDTA dan 2 mg protein mitokondria. Pengukuran konsentrasi protein dilakukan dengan metode Biuret (Apriantono et al., 1989). Inkubasi dilakukan pada suhu 30 C selarna 1 jam. Untuk menghentikan reaksi ditambahkan 3 ml asam trikloroasetat 0.4 M. Selanjutnya campuran tersebut disentrifugasi 5000 g selama 8 menit untuk mengendapkan mitokondria. P anorganik ditentukan dengan metode Fiske dan Subbarow. Pereaksi Fiske dan Subbarow digunakan untuk penentuan P anorganik (Malik dan Singh, 1980). Supematan sejumlah 0.5 ml ditarnbah dengan 3.3 ml aquadest dan 1 ml pereaksi amoniurn molibdat (1.5 g amonium molibdat ml HC1 pekat lalu dilarutkan dengan aquadest menjadi 100 ml). Tabung dikocok dan sesudah 5 menit ditambah 0.2 ml pereaksi Fiske dan Subbarrow, ditunggu sarnpai 15 menit pada suhu 30 C kemudian absorbansinya diukur pada 660 nm. Pereaksi Fiske dan Subbarow dibuat dengan melarutkan 1.45 g sodium metabisulfit, 50 mg sodium sulfit dan 25 mg asam 1-amino-2-naphtol sulfonate dalarn 5 ml air panas (80 OC) kemudian ditambah aquadest sampai volume akhir I0 mi.

11 4. Aktivitas enzim peroksidase (Pian, 1981) Bagian yang dianalisis adalah kotiledon kecambah urnur 4 hari. Sampel yang sudah dihaluskan lalu ditimbang 1 g lalu ditambah 10 ml bufer fosfat M ph 6 kemudian diaduk-aduk. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit, lalu disaring dengan kertas Whatrnan no.1. Campuran reaksi yang terdiri atas 2 ml larutan pirogalol 0.05 M dalam bufer fosfat, 50 p1 filtrat enzim dan 50 p1 H202 1 % dimasukkan di dalam kuvet, lalu secepatnya diukur absorbansnya pada panjang gelombang 420 nm setiap 15 detik selama 2.5 menit. Aktivitas enzim dihitung berdasarkan rata-rata selisih absorbans per menit per mg protein enzim. metode Biuret. 5. Kandungan asam fitat (Wheeler clan Ferrel, 1971). Pengukuran protein enzim dilakukan dengan Jaringan yang dianalisis adalah kotiledon kecambah kedelai umur 4 hari yang sudah dikeringkan pada suhu 60 C selama 3 hari. Contoh sebanyak 250 mg ditambah 5 ml TCA 3 % lalu dikocok selama 30 menit. Campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan, 1.3 ml supematan dimasukkan ke dalam tabung sentrifusa lalu ditambahkan 0.52 ml larutan FeC13 (2 mg ion ~e~+/ml TCA 3 %). Campuran tersebut selanjutnya dipanaskan dalam air mendidih selama 45 menit. Jika supernatan tidak jemih ditambahkan 1 tetes Na2S04 3% dalam TCA 3 % dan pemanasan dilanjutkan. Tahap selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit, kemudian supematan didekantasi dengan pipet pasteur. Endapan ditambah dengan 1.6 ml TCA 3 % dan dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi rpm selama

12 10 menit. Supematan didekantasi, selanjutnya endapan ditambah 1.6 ml TCA 3%, dipanaskan dalarn air mendidih selama 10 rnenit dilanjutkan dengan sentrifugasi rpm selarna 10 menit. Supernatan didekantasi dan endapan ditambah aquades 1.6 ml kemudian dipanaskan selama 10 menit lalu disentrifugasi rpm selama 5 menit. Supernatan didekantasi, endapan ditarnbah dengan 0.65 ml aquades dan 0.39 ml NaOH 1.5 N. Campuran dipindah ke tabung reaksi 15 ml, tabung sentrifusa dibilas dengan 4 ml aquades, bilasan dijadikan satu dalam tabung reaksi lalu dipanaskan selama 30 menit. Endapan disafing panas-panas dengan kertas saring kecepatan medium (Whatrnan no. 40). Endapan yang tersisa dibilas dengan aquades panas 10 ml. Endapan yang ada di kertas saring dilarutkan dengan 5.2 ml HN N panas. Kertas saring dibilas dengan 8 ml aquades, bilasan dijadikan satu. Larutan didinginkan lalu ditepatkan dengan aquades sampai 13 ml. Dari larutan contoh yang sudah siap, diambil 0.5 ml lalu ditambah aquadest 4.5 ml. Selanjutnya ditambah 1 ml KSCN 1.5 N dan diukur absorbansinya dalam waktu tidak lebih dari 1 menit dengan panjang gelombang 480 nm. 6. Aktivitas enzim fitase Akivitas enzim fitase ditentukan menurut metode Mandal dan Biswas (1970). Kotiledon kecambah umur 4 hari dicuci dengadair, dihomogenasi dengan volume yang sama dengan 0.05 M buffer ph 7 dan disentrifugasi selama 20 menit pada g. Supernatan dipanaskan pada suhu 60'~ dalam penangas air yang dijaga suhunya selama 5 menit. Selanjutnya didiiginkan dalam es, lalu disentrifugasi pada g selama 20 menit.

13 Supernatan dijenuhkan sampai 90% dengan arnonium sulfat dm disentrifugasi untuk memperoleh endapannya. Endapan dilarutkan dengan 0.05 M buffer tris dengan volume seminimum mungkin, kemudian didialisis dengan buffer yang sama selama 1 malam pada suhu 10 C. Uji aktivitas enzim fitase dilakukan dengan membuat campuran sebanyak 1 ml yang terdiri : 400 pl buffer tris ph 7.5, 400 pi fitat (250 pglml), dan 200 p1 protein enzim. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37'~. Reaksi dihentikan dengan menambafikan 1 ml 0.4 M asarn trikloroasetat dingin dan didiamkan pada suhu karnar selama 15 menit. Campuran lalu disentrifugasi, P yang dibebaskan dihitung dengan metode Fiske dan Subarrow. 7. Analisis pola pita protein (Copeland, 1994) Protein diekstrak dari kotiledon kecambah kedelai umur 4 hari. Sifat-sifat protein dianalisis dengan metode elektroforesis SDS-PAGE. Komposisi resolving gel, stacking gel, larutan buffer elektroforesis, larutan sampel, larutan pewarna dan larutan pencuci dapat dilihat pada Tabel Lampiran 4. Sampel dilarutkan dalam lamtan sarnpel lalu dimasukkan dalam air mendidih selama 2 menit. Bovin serum albumin (1 mg/ml) diperlakukan sama seperti sampel digunakan untuk standar. Sampel dengan konsentrasi protein 5 pgnubang maupun standar selanjutnya diinjeksikan ke dalam lubang sampel pada gel yang sudah dimasukkan dalam perangkat elektroforesis yang berisi buffer. Aliran listrik &atur pada 75 ma, setelah 15 menit ditingkatkan menjadi 100 rna. Aliran listrik dihentikan setelah zat warna biru mencapai posisi kurang lebih 1 cm dari dasar gel. Gel diangkat dan direndam dalam larutan pewarna pada suhu 50 C selama 30 menit. Larutan pewarna dituang, kemudian gel dibilas dengan larutan pencuci satu kali, selanjutnya gel direndam dalarn larutan pencuci seiama

14 20 jam pada suhu kamar sambil digoyang. Larutan pencuci dituang dan gel dipindahkan ke plastik transparan.