ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI TUMBUHAN Spathoglottis aurea Lindl

Transkripsi

1 ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI TUMBUHAN Spathoglottis aurea Lindl Arjinal, Yuharmen 2, Hilwan Yuda Teruna 2 1 Mahasiswa Program S1 Kimia FMIPA-Universitas Riau 2 Dosen Jurusan Kimia FMIPA-Universitas Riau Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia arjinalper@gmail.com ABSTRACT Isolation of active coumpound of root Spatoglottis aurea Lindl was done with maceration method using methanol. The methanol extract was partitioned with hexane and obtained a total of methanol extract and hexane. Extract methanol and hexane were fractionated with column chromatography and were obtained separation results 4 fractions that is F m 1-F m 4 and F h 1-F h 4 and the fractions 2 (F h 2) of hexane extract was obtained white crystals. From UV spectra of crystal F h 2 showed there was a transition π π* indicating that there was F h 2 crystal C=C double bond. F h 2 IR spectrum of the compound showed OH group, GC-MS analysis showed the compound has the formula of C 29 H 50 O with a peak molecular ion m/z 414 which was a coumpound of β-sitosterol with a melting poin of C. Antibacterial activity test extract of methanol and hexane were not active against bacteria test, while the fraction of Fh1 and Fh2 hexane extract active against bacteria S. aureus dan bakteri E. coli. Keywords : Spatoglottis aurea Lindl, β-sitosterol, S.aureus, E. coli ABSTRAK Isolasi senyawa aktif dari akar Spatoglottis aurea Lindl telah dilakukan dengan metode maserasi menggunakan metanol. Ekstrak metanol dipartisi dengan heksana dan diperoleh ekstrak total metanol dan heksana. Ekstrak metanol dan heksana difraksinasi dengan kromatografi kolom dan diperoleh hasil pemisahan masing-masing 4 fraksi yaitu F m 1-F m 4 untuk fraksi metanol dan F h 1-F h 4 untuk fraksi heksana, dan pada fraksi 2 (F h 2) ekstrak heksana ditemukan kristal putih. Dari spektrum UV senyawa F h 2 terlihat adanya transisi π π* yang menyatakan bahwa pada kristal F h 2 terdapat ikatan rangkap C=C. Spektrum IR dari senyawa F h 2 menunjukkan adanya gugus O-H, analisis GC-MS menunjukkan senyawa F h 2 memiliki rumus C 29 H 50 O dengan puncak ion molekul m/z 414 yang merupakan senyawa β-sitosterol dengan titik leleh C. Uji aktivitas antibakteri fraksi metanol dan heksana tidak aktif terhadap bakteri uji, sedangkan fraksi F h 1 dan F h 2 ekstrak heksana aktif terhadap bakteri S.aureus dan bakteri E. coli. Kata kunci : E. coli, S. aureus, Spatoglottis aurea Lindl, β-sitosterol 1

2 PENDAHULUAN Indonesia adalah negara yang sangat kaya raya dengan keanekaragaman hayati. Hal ini merupakan aset nasional yang sangat menguntungkan bagi bidang pendayagunaan sumber daya alam, terutama sebagai sumber bahan kimia obat-obatan. Oleh sebab itu, penelitian pengembangan aspek kimia dari senyawa bahan alam sangat perlu ditingkatkan. Terutama pada tumbuhan, hewan dan mikroorganisme yang menghasilkan metabolit primer dan metabolit sekunder. Salah satu tumbuhan yang menghasilkan metabolit sekunder yang berguna untuk kesehatan adalah tumbuhan anggrek. Tumbuhan anggrek umumnya telah dikenal masyarakat sejak lama, bahkan tumbuhan anggrek digunakan untuk mengobati penyakit asbes paru-paru, radang saluran napas, pendarahan usus, mata ikan, herpes, terkilir, sinusitis, ingus berbau (Kusuma, 2004). Selain itu anggrek juga dimanfaatkan dalam ramuan obat-obatan dan bahan campuran minyak wangi atau minyak rambut (Kartikaningrum et al., 2004). Berdasarkan hal diatas maka dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa aktif dari yang terkandung dalam tumbuhan anggrek tanah (Spothoglottis aurea Lindl) yang digunakan oleh masyarakat sebagai obat. Diharapkan dari penelitian ini bisa diketahui senyawa yang terkandung pada tumbuhan anggrek tanah yang berkhasiat sebagai obat. METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : peralatan destilasi, neraca analitik, satu unit rotary evaporator (Heidolph 2000), ultrasonicator (Kerry Pulsatron), chamber, vial, pipa kapiler, lampu UV model UVL-C56, lumpang, seperangkat alat kromatografi kolom, spektrofotometer UV, spektrofotometer IR SHIMADZU dan seperangkatalat, serta pipet tetes dan peralatan gelas yang biasa dipakai di laboratorium kimia. b. Bahan yang dipakai Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah akar tumbuhan anggrek tanah (Spathoglottis aurea Lindl). Bahan yang digunakan adalah heksana, metanol, etil asetat, etanol 70%, H 2 SO 4 2 N, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendoff, serium sulfat, kertas cakram, dimetilsulfoksida (DMSO), etanol absolute, antibiotik Amoxsan, Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), asam asetat anhidrat, H 2 SO 4 pekat, logam Mg, HCl pekat, aluminium foil dan aquadest. Penanganan Sampel Akar tumbuhan Spathoglottis aurea Lindl basah sebanyak 12 kg diambil di desa Serombau Indah, Kecamatan Rambah Hilir, Kabupaten Rokan Hulu, Propinsi Riau. Akar tumbuhan Spathoglottis aurea Lindl terlebih dahulu dikering anginkan dan dijaga agar tidak terkena sinar matahari secara langsung, setelah kering dihaluskan hingga diperoleh serbuk kering. Serbuk akar tumbuhan Spathoglottis aurea Lindl ditimbang kemudian siap diekstraksi. c. Ekstraksi Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Sebanyak 1,2 kg serbuk kering akar Spathoglottis aurea 2

3 Lindl direndam dalam bejana ekstraksi dengan pelarut metanol selama 1x24 jam pada suhu kamar, lalu diultrasonikasi dan disaring. Proses ekstraksi ini dilakukan sebanyak 4 kali dan ekstrak yang didapat diuapkan dari pelarutnya menggunakan alat rotary evaporator, sehingga didapat ekstrak total metanol kemudian diekstraksi dengan pelarut heksana, sehingga didapatkan ekstrak heksana. d. Pemisahan dengan kromatografi kolom gravitasi Pemisahan senyawa setiap fraksi menggunakan tehnik kromatografi. Alat kromatografi kolom ditegakkan dengan statif. Kemudian sejumlah kapas dimasukkan setinggi 1 cm pada bagian paling bawah dari kolom. Silika gel yang akan digunakan ditimbang sebanyak 30 kali bobot ekstrak dan didispersikan dalam heksana. Kemudian silika gel yang telah basah dimasukkan ke dalam kolom. Kolom kembali dielusi dengan pelarut beberapa saat, sehingga permukaan pelarut turun mendekati penyerap, sampel dielusi dalam kolom yang telah siap pakai. Sampel dielusi gravitasi dengan pelarut heksana100% sampai seluruh sampel dapat terelusi keluar dari kolom. Hasil pemisahan ditampung dalam vial yang telah ditimbang massanya dan telah diberi nomor kemudian dibiarkan hingga pelarutnya menguap. e. Pengujian Hasil Pemisahan dengan KLT Semua vial hasil pemisahan secara kromatografi kolom diuji dengan KLT. Plat KLT diberikan batas atas dan bawah, masing-masing 1 cm dari atas dan bawah plat. Masing-masing ekstrak pada vial dilarutkan dan ditotolkan pada plat KLT sesuai dengan nomor yang telah diberikan. Selanjutnya dielusi sampai pada batas atas plat yang telah ditandai. Noda yang dihasilkan ditandai dengan pensil yang dibantu melihatnya dengan lampu UV atau pereaksi penampak noda cerium sulfat. Noda yang memberikan nilai R f yang sama bisa digabungkan menjadi satu fraksi. f. Uji Aktivitas Antibakteri Peremajaan bakteri Bakteri-bakteri yang digunakan untuk uji aktivitas adalah Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Sebelum digunakan untuk uji aktivitas, terlebih dahulu harus dilakukan peremajaan terhadap bakteri-bakteri tersebut. Media NB yang telah dibuat dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 10 ml dan disterilisasi. Jarum ose yang telah disterilisasi digoreskan pada agar miring yang berisi biakan bakteri dan selanjutnya dicelupkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media NB. Tabung ditutup dengan kapas kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 24 jam. Biakan bakteri siap dipakai untuk uji bioaktivitas (Hazimah, 2012). Penentuan aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar Optical Density (OD) dari larutan Nutrien Broth (NB) yang berisi biakan bakteri diukur dengan spektofotometer UV-Vis. Jika absorbansi yang diperoleh lebih dari 0,1 maka perlu dilakukan pengenceran menggunakan air salin (NaCl) 0,90%. Sebanyak 1 ml air salin yang berisi bakteri dimasukkan kedalam 15 ml Nutrient Agar (NA) kemudian divorteks agar bakteri tersuspensi merata. Media NA dituangkan kedalam cawan petri yang sudah disterilisasi lalu dibiarkan 3

4 memadat. Sampel dengan (konsentrasi 10 µg/disk, 50 µg/disk dan 100 µg/disk) dibuat dengan melarutkan ke dalam DMSO. Sampel dengan konsentrasi. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Uji fitokimia akar S. aurea Lindl Hasil pengujian kandungan metabolit sekunder dari akar Spathoglottis aurea Lindl adalah golongan steroid yang dapat dilihat pada Tabel Ekstraksi akar S. aurea Lindl Sebanyak 1,2 kg serbuk kering akar S. aurea Lindl direndam dalam bejana ekstraksi dangan pelarut metanol selama 1x24 jam pada suhu kamar, lalu diultrasonifikasi dan disaring, proses ekstraksi ini dilakukan sebanyak 4 kali dan ekstrak yang didapat diuapkan dari pelarutnya menggunakan alat rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak total metanol. Ekstrak total metanol diekstraksi menggunakan corong pisah dengan pelarut heksana, sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah adalah lapisan metanol dan lapisan atas adalah heksana, kemudian masing masing ekstrak diuapkan menggunakan alat rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak masing masing dari pelarut metanol dan heksana. Ekstrak metanol diperoleh berwarna hitam pekat sebanyak 24 gram dan ekstrak heksana bewarna coklat kehitaman sebanyak 17 gram. 3. Pemisahan dengan kromatografi Pemisahan dengan kromatografi kolom gravitasi menggunakan 24 gram ekstrak total metanol dengan pengelusian berbagai eluen yang memiliki kepolaran yang meningkat dari etilasetat 100% perbandingan etilasetat-metanol, sampai metanol (100%). Hasil pemisahan diperoleh sebanyak 56 vial, dan hampir semua pemisahan berbentuk minyak, dan sebagian lainnya tidak ada atau kosong, Sedangkan untuk pemisahan ekstrak heksana menggunakan 17 gram ekstrak total heksana dengan pengelusian dilakukan dengan berbagai eluen yang memiliki kepolaran yang meningkat dari heksana 100%, perbandingan heksana-etilasetat, sampai perbandingan etiasetat (100%). Hasil pemisahan diperoleh sebanyak 47 vial dan pada vial 19 sampai vial ke 27 berupa kristal putih. Sedangkan pada vial No 1 sampai No 18 dan vial No 28 sampai vial No 47 sebagian hasilnya berupa minyak dan sebagian lainnya tidak ada atau kosong. 4. Pengujian hasil kromatografi kolom gravitasi Hasil pemisahan kromatografi kolom ekstrak metanol dan ekstrak heksana diuji dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi darfi ekstrak metanol diuji KL T menggunakan eluen metanoletilasetat (7:3). Senyawa yang memilki R f yang sama dijadikan satu fraksi. Sehingga diperoleh ekstrak methanol 4 fraksi yaitu (F m 1,F m 2,F m 3, dan F m 4). Sedangkan uji KLT fraksi dari ekstrak heksana menggunakan eluen heksanaetilasetat (8:2) dan diperoleh hasil pemisahan untuk ekstrak heksana sebanyak 4 fraksi (F h 1,F h 2,F h 3 dan F h 4). 5. Uji KLT kristal F h 2 Hasil uji KLT vial 19 sampai vial 27 yang berupa kristal putih, menunjukkan nilai R f yang sama sehingga digabungkan menjadikan satu fraksi yaitu fraksi 2 (F h 2). F h 2 selanjutnya dilakukan kristalisasi, kemudian diuji KLT dan menunjukkan satu noda dengan harga R f 0,8 dengan eluen heksana:etilasetat (7:3). 4

5 6. Uji titik leleh kristal F h 2 Kristal (F h 2) dilakukan uji titik leleh menggunakan alat Fisher-Johns. Ini dilakukan untuk meyakini bahwa kristal yang diperoleh benar-benar sudah murni. Kristal F h 2 yang diperoleh mempunyai titik leleh C, ini menunjukkan kristal tersebut telah murni karena selisih antara kristal mulai meleleh sampai meleleh semuanya < 2 0 C. 8. Analisis spektroskopi GC-MS Data GC-MS menunjukkan senyawa dari senyawa F h 2 memiliki rumus C 29 H 50 O dengan puncak ion molekul m/z 414, pada 396 (M-H 2 O), dan 273 merupakan penggalan karakteristik dari stigmastran. Pola fragmentasi ini merupakan cirri khas senyawa β sitosterol (Muharram, 1993). 7. Hasil karakterisasi spektroskopi ultraviolet (UV) dan inframerah (IR) Spektrum UV senyawa F h 2 memperlihatkan adanya serapan maksimum pada panjang gelombang 204 nm (A=1,39), serapan maksimum ini menunjukkan adanya transisi π π* yang menyatakan bahwa pada senyawa F h 2 terdapat ikatan rangkap C=C. Spektrum IR dari kristal F h 2 memperlihatkan adanya serapan maksimum pada bilangan gelombang 3430 cm -1 yang mengindikasikan adanya gugus O-H, pada 2943 cm -1 yang mengindikasikan adanya gugus C-H, dan pada 1541 cm -1 yang menunjukkan adanya ikatan C=C. β-sitosterol 9. Uji aktivitas antibakteri Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Gram positif dan negatif. Kedua bakteri tersebut dipilih karena lazim digunakan pada uji aktivitas biologi dan tersedia di laboratorium, serta pada umumnya bakteri tersebut merupakan penyebab beberapa penyakit yang menginfeksi manusia. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak dan fraksi metanol tidak aktif, sedangkan senyawa yang aktif adalah Tabel 1. Hasil Uji Fitokimia No Gol. Senyawa Pereaksi Pemangatan Hasil 1 Flavonoid Mg-HCl Tidak terbentuk warna merah - 2 Saponim H 2 O Tidak terbentuk busa - 3 Steroid Liberman Burchad Terbentuk warna hijau + 4 Alkaloid Mayer Dragendorff (+) : Memiliki kandungan senyawa (-) : Tidak memiliki kandungan senyawa Tidak terbentuk endapan putih Tidak terbentuk endapan orange - - 5

6 fraksi heksana yaitu pada F h 1 dan F h 2, hal ini dapat dilihat pada zona bening yang dihasilkan. Daya hambat senyawa F h 1 terhadap bakteri S. aureus berkisar mm dan terhadap E.coli berkisar mm. Sedangkan daya hambat F h 2 terhadap bakteri S. aureus berkisar mm dan terhadap E.coli berkisar mm. Hal ini disebabkan karena fraksi F h 1 dan F h 2 dari ekstrak heksana merupakan senyawa dari golongan steroid yang mengandung β-sitosterol yang bisa menghambat bakteri (Mandala, 2015). Daya hambat yang terbesar dihasilkan adalah pada bakteri E. coli, karena E. coli merupakan bakteri Gram negatif yang struktur dinding selnya sangat tipis (10-15 nm) dan lapisan peptidoglikan hanya sekitar % yang terletak diantara membran luar dan membran dalamnya sehingga selnya akan lebih mudah terdenaturasi. Sedangkan S. aureus merupakan bakteri Gram positif yang memiliki dinding sel lebih tebal yaitu nm dengan lapisan peptidoglikan % yang terletak dilapisan luarnya sehingga dinding sel dari bakteri Gram positif lebih sulit terdenaturasi oleh senyawa tesebut. Fraksi F h 1 dan F h 2 tersebut memiliki aktivitas yang lemah terhadap kedua bakteri uji. Diameter zona bening atau zona hambat yang >20 mm berarti memiliki aktivitas kuat, diameter hambat mm memiliki aktivitas sedang, diameter hambat memiliki aktivitas lemah, sedangkan diameter hambat <10 memiliki aktivitas sangat lemah (Sagena, 2011). Hal ini berbeda dengan diameter zona bening yang dihasilkan oleh kontrol positif yaitu Amoxsan 30 μg yang berkisar antara mm (aktivitas sedang). KESIMPULAN Ekstrak heksana dari akar tumbuhan Spathoglottis aurea Lindl diperoleh 4 fraksi, pada fraksi 2 ditemukan senyawa F h 2 dengan titik didih C. Senyawa F h 2 yang diperoleh dari isolasi akar tumbuhan Spathoglottis aurea Lindl adalah golongan steroid yaitu β-sitosterol dengan rumus C 29 H 50 O. Hasil uji aktivitas antibakteri yang dilakukan, ekstrak metanol dan heksana akar tumbuhan Spathoglottis aurea Lindl tidak aktif terhadap bakteri S.aureus dan E. coli. Sedangkan fraksi F h 1 dan F h 2 ekstrak heksana aktif terhadap bakteri S.aureus dan E. coli dengan daerah daya hambat (DDH) sekitar mm. DAFTAR PUSTAKA Kartikaningrum, S.D. Widastoety dan Kusumah Panduan Karakterisasi Tanaman Anggrek. Badan Penelitian dan Pengembangan Komisi Nasional Platma. Jurnal Ilmiah dari pertanian. 10(2) : 2-3. Kusuma, H. W Sehat dengan Anggrek Tanah. Yahoo ( Suarakarya-online. com/news.html). 23 September Mandala, N.K., Bioaktivitas senyawa β-sitosterol hasil isolasi dari hydroid aglaophenia Cupressina lamoureoux sebagai bahan antibakteri terhadap staphylococcus Aureus dan shigella sp. Jurnal Hasil Penelitian. FMIPA UNHAS. Makassar. Muharram, Beberapa Metabolit Sekunder dari Cryptucarya Fuscopilosa T dan Cryptucarya ferrea. BL.(Lauraceae). Tesis ITB. Bandung. 6

7 Sagena, Sintesis Analog Calkon turunan piridin Karbaldehid Melalui Kondensasi Aldol dan Uji Aktivitasnya Sebagai Antibakteri. Skripsi. FMIPA, UNRI, Pekanbaru. Sihotang, B Anggrek. Diakses dari : Tanggal 12 Januari