AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN PAPASAN (Coccinia grandis L.) DAN FRAKSI-FRAKSINYA DENGAN METODE DPPH SERTA PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTALNYA

Transkripsi

1 AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN PAPASAN (Coccinia grandis L.) DAN FRAKSI-FRAKSINYA DENGAN METODE DPPH SERTA PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTALNYA NASKAH PUBLIKASI Oleh: NAIMAH LATEH K FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIAH SURAKARTA SURAKARTA

2 2

3 AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN PAPASAN (Coccinia grandis L.) DAN FRAKSI-FRAKSINYA DENGAN METODE DPPH SERTA PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTALNYA ANTIOXIDANT ACTIVITY OF IVY GOURD (Coccinia grandis L.) LEAF EXTRACT AND FRACTIONS USING DPPH METHOD AND TOTAL PHENOLIC CONTENT. Naimah Lateh #, Dedi Hanwar Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jalan Ahmad Yani Tromol Pos I, Pabelan Kartasura, Surakarta # ABSTRAK Buah dan akar papasan (Coccinia grandis L.) menunjukkan adanya aktivitas antioksidan, serta pengobatan lain seperti penyembuhan luka, ulkus, sakit kuning, diabetes dan antipiretik. Coccinia grandis memiliki kandungan kimia antara lain flavonoid, saponin, fenolik. Bagian daun papasan belum diteliti aktivitas antioksidannya oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan fraksi-fraksi dan ekstrak etanol daun papasan serta menetapkan kadar fenolik total. Metode ekstraksi yang digunakan adalah meserasi dengan menggunakan etanol 96%, sedangkan fraksinasi menggunakan pelarut heksan, etil asetat, dan etanol.aktivitas antioksidan dengan ekstrak fraksi ditetapkan dengan DPPH. Kandungan total fenolik ditetapkan dengan metode Folin- Ciocalteu. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 pada ekstrak sebesar 300,18 ppm, fraksi n-heksan sebesar 325,34 ppm, fraksi etil asetat sebesar 342,91 ppm, dan fraksi etanol sebesar 559,91 ppm. Kandungan fenolat berturut turut adalah 28,50; 21,52; 63,59 dan 28,66 GAE. Kata kunci : daun papasan (Coccinia grandis L.), fenolik, antioksidan, DPPH ABSTRACT Papasan (Coccinia grandis L.) fruits and roots have antioxidant activity and other treatments such as healing wounds, ulcers, jaundice, diabetes and antipyretic. Coccinia grandis has chemical constituents include flavonoids, saponins, phenolic. Papasan leaves are unexplored for antioxidant activity, therefore this study aims to determine the antioxidant activity of the fractions and ethanol extract of papasan leaves and the total phenolic content. Maceration by ethanol was used for extraction, while the fractionation using hexane, ethyl acetate, and ethanol. The antioxidant activity of the extract and fractions were determined by DPPH. The total content phenolic was determined by the Folin-Ciocalteu method. The results showed antioxidant activity with IC50 values of , , and ppm for the extract, n-hexane fraction, ethyl acetate fraction and ethanol fraction respectively. Meanwhile, the total phenolic content for the extract and fractions were 28.50, 21.52, and GAE respectively. Keywords: ivy gourd leaf (Coccinia grandis L.), phenolics, antioxidant, DPPH 1

4 PENDAHULUAN Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif karena mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya (Deshpande, 2011). Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul, radikal bebas akan bereaksi dengan molekul disekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi ini akan berlangsung terus menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit degeneratif lainnya. Oleh karena itu, tubuh memerlukan suatu substansi penting yaitu antioksidan yang mampu menangkap radikal bebas tersebut sehingga tidak dapat menginduksi suatu penyakit (Kikuzaki, dkk., 2002). Di dalam tubuh terdapat senyawa yang disebut antioksidan yaitu zat yang memperlambat atau menghambat stress oksidatif pada molekul target (Priyanto, 2010).Antioksidan alamidari ekstraktanamanmemberikan ukuran produksi yang memperlambat preoses kerusakan oksidatif dan antioksidan juga dapat diperoleh dari asupan makanan yang banyak mengandung vitamin C, vitamin E dan betakaroten serta senyawa fenolik. Bahan pangan yang dapat menjadi sumber antioksidan alami, seperti rempah-rempah, coklat, biji-bijian, buah-buahan, sayur-sayuran seperti daun papasan dan sebagainya (Bhadauria et al., 2012). Sebagian besar penelitian papasan adalah pada bagian akar dan bagian buah, sedangkan daun yang banyak digunakan sebagai sayur belum banyak diteliti. Papasan (Coccinia grandis L) adalah suatu tanaman merambat milik keluarga Cucurbitaceae. Buah memiliki sel mast menstabilkan; antianafilaksis dan potensi antihistamine. Fraksi ekstrak hidrometanolik dari akar C.grandis menunjukkan aktivitas antioksidan yang kuat, mengurangi kemampuan daya aktivitas radikal bebas dan kemampuan chelating logam ketika dibandingkan dengan standar seperti asam askorbat, α-tokoferol, kurkumin, dan butylated hidroksitoluene. (Bhadauria et al., 2012). Di beberapa negara Asia seperti Thailand menyiapkan tonik tradisional seperti minuman untuk tujuan pengobatan (Ashwini, 2012). METODOLOGI Alat dan Bahan Alat yang yang digunakan adalah spektofotometer UV Vis (UV Mini SHIMADZU). Bahan kimia yang digunakan adalah etanol p.a (Merck), pereaksi DPPH (Sigma), etanol 96 % teknis, akuades, reagen Folin Ciocalteu (Merck), Na karbonat (Merck), asam galat (Sigma), Vitamin E (Sigma), alumunium foil, heksan teknis, etil asetat. 2

5 Jalan Penelitian 1. Pembuatan ekstrak Daun papasan yang sudah dihaluskan kemudian diekstraksi dengan metode maserasi.sebanyak 0,44 kg sampel direndam dalam pelarut etanol 96 % ( 1: 6) sambil diaduk dan didiamkan selama 3 hari. Maserat disaring dengan corong pisah dan diuapkan dengan vacum rotary evaporator dan dikentalkan dengan waterbath untuk mendapatkan ekstrak kental. Maserat dipisahkan dan proses diulangi 2 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan penguap vakum hingga diperoleh ekstrak kental. 2. Fraksinasi Fraksinasi ekstrak etanol daun papasan menggunakan isonikasi. Fraksinasi dilakukan dengan ekstrak kental daun papasan sebanyak 3 gramekstrak etanol daun papasan kemudian diekstraksi 10 kali dengan menggunakan n-heksan dan disonikasi selama 10 menit hingga diperoleh fraksi n-heksan. Ampas disari kembali sebanyak 7 kali menggunakan etil asetat hingga diperoleh fraksi etil asetat. Selanjutnya ampas disari kembali menggunakan etanol 96% sebanyak 3 kali hingga diperoleh fraksi etanol. Masing-masing fraksi dipekatkan menggunakan penangas air. Fraksinasi diulang sebanyak 3 kali. 3. Penentuan kandungan fenolik Larutan ekstrak 0,1 ml dengan konsentrasi 100 µg/ml ditambah dengan 7,5 ml air suling dan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteu. Setelah dicampur dalam Labu takar, diamkan pada suhu ruangan selama 5 menit yang kemudian ditambahkan 1,5 ml Na karbonat konsentrasi 2 g/ 100 ml. Jika sudah tercampur semua, didiamkan selama 120 menit. Absorbansi diukur pada spektrofotometer dengan lamda 750 nm ( Sejed et al., 2010). Kandungan total fenolat dinyatakan dalam GAE (gallic acid equivalent) per gram ekstrak. 4. Penentuan aktivitas antioksidan Metode DPPH Diambil ekstrak dan fraksi-fraksi ekstrak etanol daun lempuyang wangi dengan konsentrasi 80 µg/ml, 160 µg/ml, 240 µg/ml, 320 µg/ml, 400 µg/ml dimasukkan dalam labu takar, masing-masing konsentrasi sampel ditambahkan dengan larutan stok DPPH 1 ml kemudian ditambahkan etanol pro analisis sampai volume 5 ml. Kontrol yang digunakan adalah larutan stok DPPH 1 ml ditambahkan etanol pro analisis sampai volume 5 ml dan dilakukan replikasi 3 kali. Diinkubasi selama 30 menit pada tempat gelap, kemudian DPPH, blanko dan sampel dimasukkan dalam kuvet dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 515,5 nm. 3

6 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil rendemen ekstrak kental adalah 14,24 sebagian ekstrak membentuk kristal. % b/b. Warna ekstrak hijau tua dan Gambar 1. Ekstrak daun papasan Uji aktivitas penangkap radikal ekstrak daun papasan menggunakan metode DPPH dan sebagai pembandingnyaa digunakann vitamin E. Vitamin E digunakan sebagai pembanding dikarenakan vitamin ini telah diketahui secara luas memililki aktivitas antioksidan. Metode DPPH dipilih karenaa cepat, sederhana, peka serta hanyaa memerlukan sedikit sampel (Hanani et al., 2005). Aktivitas antiradikal DPPH dilakukan dengan mereaksikan senyawa uji dengan larutan DPPH 0,04 mm.senyawa uji berperan sebagai penangkap radikal memberikan hidrogen kepada DPPH, sehingga terbentuk DPPH-H mengukur absorbansi DPPH pada panjang gelombang maksimal. Absorbansi yang diukur adalah absorbansi sisa DPPH setelah bereaksi dengan sampel. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang maksimal (λ mak ) karena pada λ max tersebut sensitivitas tinggi, dan kesalahan absolute lebih rendah. Pada penelitian ini diperoleh λ max yaitu 515,5 nm. tereduksi yang berwarna kuning (Huang et al., 2004). Aktivitas antiradikal diukur dengan metode spektrofotometri yaitu Absorbansi yang didapat digunakan untuk perhitungan % penangkapan radikal (lampiran) Nilai IC50 Sampel dan Pembanding Vit E ESK FNH FEA FET Vit E ESK FNH FEA FET Gambar 2. Grafik Aktivitas Penangkap Radikal (%) Berbagai konsentrasi (EKS), fraksi n-heksan (FNH), fraksi etil asetat (FEA), fraksi Konsentrasi sampel sebanding dengann aktivitas antiradikalnya. Senyawa uji, ekstrak papasan etanol (FET) dan vitamin E. 4

7 Nilai IC 50 tergantung jumlah DPPH yang terduksi oleh antioksidan selama reaksi terjadi. Aktivitas penangkap radikal berbanding terbalik dengan IC 50. Semakin kecil nilai IC 50 yang ditunjukkan maka semakin besar aktivitas antioksidan yang dimiliki. Tabel 1. Hasil pengujian aktivitas antiradikal dari 5 sampel Sampel IC * 50 ±SD (µg/ml) Ekstrak papasan 300,18 ± 0 Fraksi n-heksan 325,34 ± 27,618 Fraksi etil asetat 342,91 ± 2,703 Fraksi etanol 559,91 ± 26,472 Vitamin E 6,489 ± 0 Menurut Reynertson (2007) senyawa dikatakan sebagai antioksidan yang sangat aktif apabila nilai IC 50 50µg/mL, nilai IC 50 antara µg/ml merupakan antioksidan aktif, antioksidan dengan aktivitas sedang nilai IC 50 antara µg/ml, dan antioksidan tidak aktif apabila memberikan nilai IC 50 diatas 200 µg/ml. Hasil dari penelitian ekstrak nilai semua sampel ini memiliki aktivitas yang sangat rendah dan termasuk ke dalam kategori antioksidan tidak aktif menurut Reynertson. Hasil pengujian aktivitas penangkap radikal ekstrak daun papasan dan fraksifraksinya (Table 1) menunjukkan bahwa IC 50 dari ekstrak dan fraksi berturut-turut dari yang paling kecil ke yang paling besar adalah sebagai berikut: Ekstrak papasan, fraksi n- heksan, fraksi etil asetat dan fraksi etanol (300,18; 325,34; 342,91 dan 559,91 µg/ml). Hal tersebut menunjukkan bahwa komponen aktif yang mampu menangkap atau mereduksi radikal bebas yang terdapat dalam ekstrak papasan paling banyak dibanding dengan fraksi n-heksan, fraksi eti asetat dan fraksi etanol, karena nilai IC 50 ekstrak daun papasan paling kecil dibandingkan 3 fraksi lainnya. Hal ini dimungkinkan karena kandungan senyawa aktif sebagai antiradikal dalam ekstrak daun papasan paling banyak atau paling aktif dibandingkan dengan kandungan senyawa aktif yang terdapat pada ketiga fraksi lainnya. Sebagai pembandingan digunakan vitamin E yang sudah diketahui sebagai antioksidan. Vitamin E sebagai pembanding memiliki aktivitas terkuat dengan IC 50 6,489 µg/ml. Hal ini dikarenakan vitamin E merupakan senyawa murni. Mekanisme reaksi α- tokopherol (Vitamin E) dengan DPPH melalui dua tahap reaksi, pada tahap pertama, suatu molekul dari DPPH bereaksi dengan suatu molekul dari α-tokopherol membentuk radikal α-tokopherol. Kemudian radikal α-tokopherol bereaksi dengan molekul DPPH lainnya membentuk α-tokopherolquinon, maka dua molekul DPPH dapat direduksi oleh sebuah molekul α-tokopherol. Pada penentuan kandungan fenolik total dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi Folin- Ciocalteu (Lee et al., 2003). Metode ini berdasarkan kekuatan mereduksi 5

8 dari gugus hidroksi fenolik. Semua senyawa fenolik termasuk fenol sederhana dapat bereaksi dengan reagen Folin- Ciocalteu walaupun bukan menangkap radikal (antiradikal) efektif (Huang et al., 2005). Penentuan operating time (OT) asam galat sebagai standar dengan reagen Folin- Ciocalteu pada panjang gelombang maksimal referen 750 nm (Lee et al, 2003) menunjukkan absorbansi yang stabil pada menit. Penentuan panjang gelombang maksimal dimaksudkan untuk mengetahui panjang gelombang yang memiliki absorbansi terbesar. Hasil percobaan menunjukkan serapan terbesar terjadi pada panjang gelombang 760,5nm. Sebagai standart penentuan senyawa fenolik total menggunakan asam galat karena asam galat turunan asam hidroksil benzoat dengan ciri mempunyai gugus fenol. Absorbansi Kurva Baku Asam Galat y = 0.098x R² = Konsentrasi (ppm) Gambar 3. Profil Penentuan Kurva Baku Asam Galat dengan Persamaan Regresi Linier Kandungan fenolik total dalam tumbuhan dinyatakan dalam GAE (gallic and equivalent) yaitu jumlah kesetaraan milligram asam galat dalam 1 gram sampel (Lee et al, 2003). Hasil percobaan menunjukkan kadar fenolik total pada fraksi etil asetat lebih besar dibandingkan dengan ekstrak papasan dan fraksi lainnya. Tabel 2. Penentuan Kadar Fenolik Total Ekstrak Daun Papasan dan Fraksi-fraksinya Rerata Kadar fenolik total (mg/g) ± SD Ekstrak 28,50 ± 1,225 Fraksi n-heksan 21,52 ± 0,692 Fraksi etil asetat 63,59 ± 3,603 Fraksi etanol 28,66 ± 1,469 Hasil dari tabel di atas menunjukkan bahwa kadar fenolik yang paling tinggi terdapat pada fraksi etil asetat. Hal ini dimungkinkan karena ekstrak etil asetat memberikan perbedaan yang nyata terhadap ekstrak, fraksi n-heksan dan fraksi etanol. Perbedaan yang nyata yang dimaksud adalah kadar kandungan fenolik total. Urutan kandungan fenolik total dalam ekstrak secara berturut-turut adalah fraksi etil asetat > ekstrak etanol > ekstrak> 6

9 fraksi n-heksan. Rohman, dkk (2006) melaporkan bahwa pelarut etil asetat sangat cocok untuk mengekstraksi senyawa fenolik dan kandungan fenolik total yang terdapat di dalam ekstrak etil asetat lebih besar dibandingkan dengan ekstrak metanol dan kloroform. Kelarutan senyawa fenolik bergantung pada pelarut yang digunakan. Komponen polifenol memiliki spektrum yang luas dengan sifat kelarutan yang berbeda-beda (Nur dan Astawan, 2011). Hal inilah yang menyebabkan sulitnya prosedur ekstraksi yang cocok untuk mengekstrak fenolik pada tanaman (Naczk dan Shahidi, 2004). Tingginya total polifenol pada pelarut etil asetat diduga adanya golongan polifenol yang memiliki berat molekul yang sama dengan pelarut etil asetat seperti tanin dan flavanol (Nur dan Astawan, 2011). Senyawa polifenol dapat berperan sebagai antioksidan yang efektif karena mempunyai suatu gugus OH yang terikat pada karbon cincin aromatik. Produk radikal bebas senyawa-senyawa ini akan terstabilkan secara resonansi dan karena itu tidak reaktif dibandingkan dengan kebanyakan radikal bebas lain (Fessenden dan Fessenden, 1986). Senyawa fenolik telah diketahui mempunyai aktivitas sebagai penangkap radikal, oleh karena itu diperlukan penetapan kadar fenolik total untuk mengetahui korelasi antara kandungan fenolik dan nilai IC 50 yang terdapat dalam ekstrak daun papasan beserta fraksifraksinya. Aktivitas Antioksidan (Nilai IC50) ppm Fraksi n-heksan Fraksi etanol Ekstrak y = x R² = Fraksi etil asetat Kadar Fenolik Total (GAE) Gambar 4. Aktivitas Antioksidan dengan Nilai IC 50 (ppm) dan kadar fenolik Ekstrak (EKS), Fraksi n- heksan (FNH), Fraksi Etil Asetat (FEA), dan Fraksi Etanol (FET). Tabel 3. Hubungan antara aktivitas antioksidan (IC 50 ) dengan kadar fenolik total (GAE) No Sampel Rerata IC 50 RerataGAE(mg/g) (µg/ml) 1 Ekstrak 300,18 28,50 Y = -0,879x + 413, 2 Fraksi n-heksan 325,34 21,52 R 2 = 0,019 3 Fraksi etil asetat 342,91 63,59 4 Fraksi etanol 559,91 28,66 7

10 Kandungan fenolik total dari fraksi etil asetat lebih besar dibanding sama ekstrak dan fraksi-fraksi yang lain. Namun aktivitas antioksidannya menunjukkan kebalikan dimana potensi antioksidan paling tinggi ditunjukkan oleh ekstrak papasan, bukan fraksi etil asetat. Hal ini kemungkinan disebabkan karena adanya perbedaan jenis senyawa yang aktif pada masing-masing ekstrak dan fraksi-fraksinya yang telah diuji. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Aktivitas antioksidan ekstrak daun papasan (Coccinia grandis L.) memiliki nilai IC 50 untuk ekstrak 300,18 ppm, fraksi n- heksan 325,34 ppm, fraksi etil asetat sebesar 342,91 ppm, dan fraksi etanol sebesar 559,91 ppm serta sebagai kontrol adalah vitamin E memiliki nilai IC 50 sebesar 6,49 ppm. 2. Kandungan fenolik pada daun papasan (Coccinia grandis L.) untuk ekstrak nilai rerata sebesar 28,49 GAE, fraksi n-heksan nilai rerata sebesar 21,52 GAE, fraksi etil asetat nilai rerata 63,59 GAE, dan fraksi etanol nilai rerata sebesar 28,66 GAE. 3. Ekstrak etanol daun papasan (Coccinia grandis L.) dan fraksi-fraksinya tidak memiliki hubungan kadar fenolik terhadap aktivitas antioksidan. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menguji aktivitas antioksidan dengan metode yang lain yang lebih efektif. Selain itu menguji dari bagian lain dari tanaman papasan. DAFTAR ACUAN Ashwin I.M, et al., 2012, In Vitro Antioxidant And Anti Inflammatory Activity Of Coccinia Grandis, Int J Pharm Pharm Sci, Vol 4, Issue 3 B. Shyam Kumar., et al, 2010, Hepatoprotective activity of Coccinia indica leaves extract, Int J Pharm Biomed Res, 1(4), Deshpande S.V.,et al, 2011, A Study On Antioxidant Activity Of Fruit Extracts Of Coccinia Grandis L.Voigt, International Journal of Drug Research and Technology, Vol.1 (1), Hanani, E., Mun im, A., Sekarini, R., 2005, Identifikasi senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia Sp Dari kepulauan seribu, Majalah Ilmu kefarmasian, 2(3), Huang C, DKK,2005, Identification of an Antifungal Chitinase from a Potential Biocontrol Agent, Bacillus cereus.,journal of Biochemistry and molecular Biology, 38,

11 Lee KW, Kim YJ, Lee HJ, Lee CY, 2003,Cocoa Has More PhenolicPhytochemical and A Higher Antioxidant Capacity than Teas and Red Wine, J. Agric. Food Chem, 51 (25), Kikuzaki, H., et al., 2002, Antioxidants Properties of Ferulic Acid and Its Related Compound, J. Agric.Food Chem, 50, Preeti Bhadauria.,et al, 2012, In vitro Antioxidant Activity of Coccinia Grandis Root Extracts, Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences; 2(3), Priyanto, 2010, Antioksidan, (Hadi Sunaryo), Toksikologi, Mekanisme, Terapi Antidotum, Dan Penilaian Risiko, 98 Reynertson, K.A., 2007, Phytochemical Analysis of Bioactive Constituens form Edible Myrtaceae Fruit, Dissertation, The city University of New York, New York Sejed, I., Saka, M., Misan, A., & Mandia, A., 2010, Antioxidant Activity of Wheat and Buck Wheat Flaurs, University of Novi Sad, No. 118, Wang, S. Y., Chang, H. N., Lin, K. T., Lo, C. P., Yang, N. S., & Shyur, L. F. (2003). Antioxidant properties andphytochemical characteristics of extracts from Lactuca indica. Journal of Agricultural and Food Chemistry,51(5),