BAB I PENDAHULUAN. 1.3 Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril

Transkripsi

1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan (Dwijoseputro, 1998). Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur murni saja. 1.2 Permasalahan Permasalahan yang akan dibahas dalamp raktikum ini adalah bagaimana mempelajari teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril. 1.3 Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril

2 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Pemindahan biakan Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel (Lay, 1998). Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena pada bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme juga memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme (Lay, 1998). 2.2 Inokulasi Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu : 1. Menyiapkan ruangan Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan.dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca

3 (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986). 2. Pemindahan dengan dengan pipet Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986). 3. Pemindahan dengan kawat inokulasi Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel.ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986). 2.3 Teknik Inokulasi Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme yaitu : Metode gores Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni (Winarni, 1997). Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006) Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni : a. Goresan T

4 b. Goresan kuadran c. Goresan Radian d. Goresan Sinambung Metode tebar Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah (Winarni, 1997).

5 2.3.3 Metode tuang Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997) Metode tusuk Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni, 1997). 2.4 Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah : 1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam suatu media. 2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak (Rohimat, 2002). 2.5 Macam-Macam Media Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu : 1.Mixed culture: berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme 2. Plate culture: media padat dalam petridish 3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi

6 4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara penusukan. 5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi. 6. Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok. (Dwijoseputro, 1998). 2.6 Cara menyelidiki Piaraan Murni Dalam keadaan sebenarnya ( di alam bebas ) boleh dikatakan tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa cara, yaitu : 1. Dengan pengenceran Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran inii kemudian diambil sampel 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005). Gambar 1. Teknik Pengenceran

7 2. Dengan Penuangan Robert koch ( ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni koloni yang masing masing dapat dianggap murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005). 3. Dengan Penggesekan Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian (kurang lebih 12 jam) akan nampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo, 2005). 4. Dengan Mengucilkan Satu Sel ( Single Cell Isolation ) Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada tangan tangan suatu mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berkembang biak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh piaraan murni. Meode ini sangat memerlukan kesabaran, lagipula mikromanipulator sangat mahal (Waluyo, 2005). 5. Dengan Inokulasi Hewan Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yang disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka bakteri bakteri aprobe yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita

8 peroleh semata mata hasil tbc saja. Piaraan pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit ( intracutaneous ), dapat di bawah kulit ( subcutaneous), dapat di dalam otot ( intramuscular), dapat di rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi (Waluyo, 2005). 2.7 Teknik Aseptik Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kita harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme ada dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka mudah lepas dalam udara dan permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan sampai penanganan berikutnya mediun kultur harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya (Cappuccino, 1983). Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilan dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan pendamping mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus lihai dengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar, dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal (Cappuccino, 1983).

9 Gambar 2. Teknik Aseptik 2.8 Escherichia coli Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Klasifikasi Kingdom : Bakteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Order : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escheriachia Spesies : E. coli Escherichia coli biasanya hidup di dalam intestinum pada manusia ataupun hewan, memiliki gram negative, dan fakultatif anaerob. Merupakan makhluk prokariot. Pada

10 kondisi tertentu bisa menjadi pathogen atau dapat menyebabkan penyakit. Dan bakteri ini juga dapat menyebabkan keracunan makanan, dan yang paling sering adalah dapat menyebabkan diare serta beberapa penyakit yang sejenis (Anonim, 2008). Escherichia coli memproduksi racun yang berbahaya di lapisan intestinum. Bila terjadi desakan pada intestinum maka akan menghasilkan racun tersebut untuk menkontaminasi daging dan susu. Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal yang berasal dari kotoran hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Oleh karena itu, dikenal juga dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia coli berupa batang pendek (0,5-1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu flagela secara merata tersebar diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciriciri biokimiawinya adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini memberikan cara-cara dasar untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada lingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).

11 BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan Alat Alat yang dipergukan dalam percobaan ini adalah jarum ose, tabung reaksi, lampu spiritus, penangas air, cawan Petri, dan inkubator Bahan Bahan yang dipergunakan daalm praktikum ini yaitu kapas lemak dan media agar yanng telah disterilkan. 3.2 Cara kerja Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Miring Tabung Reaksi - Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan ditulis pada tabung reaksi. - Biakan induk dalam tabung reaksi dan media agar miring yang telah disterilkan diletakkan pada telapak tangan kiri. - Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara. - Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking. - Disumbat kapas pada biakan induk ditutup. - Disumbat kapas media agar miring yang akan diinokulasi mikroorganisme dibuka dengan cara yang sama dengan langkah 4. Kemudian ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganisme digeserkan dengan hati-hati di atas permukaan agar, dimulai dari dasar tabung secara zig-zag menuju ke bagian atas tabung. - Disumbat kapas ditutup secepatnya pada media yang telah diinokulasi. dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untuk memusnahkan mikroorganisme yang masih menempel. - Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati, digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri. Hasil

12 3.2.2 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Datar Tabung Reaksi - Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan pada cawan petri. - Biakan induk dalam tabung reaksi diletakkan pada telapak tangan kiri. - Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara. - Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking. - Disumbat kapas pada biakan induk ditutup. - Dipanaskan pinggiran cawan petri untuk proses sterilisasi cawan petri - Dibuka sedikit tutup cawan petri dengan tetap melakukannya di dekat api bunsen. - Digeserkan ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganisme dengan hati-hati di atas permukaan agar, dimulai dari atas permukaan secara zig-zag menuju ke bagian bawah (goresan T dan kuadran). - Ditutup secepatnya pada media cawan petri yang telah diinokulasi. dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untuk memusnahkan mikroorganisme yang masih menempel. - Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati, digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri. Hasil

13 3.2.3 Metode taburan (Pour Plate Method) Medium Biakan - Dicairkan medium bakteri di atas penagas air dan didinginkan sampai suhu 50 C. - Dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptic dan dibiarkan sampai padat. - Diencerkan susupensi bahan yang mengandung mikroorganisme seencer mungkin dan diteteskan secara aseptic. - Diratakan dengan digoyang seperti angka delapan. - Ditutup cawan petri dan diberi label, kemudian diinkubasi dalam keadaan terbalik dalam incubator selama jam masa inkubasi Hasil

14 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Pengamatan Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar) No. Perlakuan Pengamatan 1. Disiapkan media biakan induk dari jenis mikroorganisme : Bakteri : Escherichia coli - Diberikan pada 2 sampel medium, menggunakan goresan kuadran dan goresan T - Pada medium biakan induk, koloni bakteri tampak berwarna putih 2. Medium NA pada tabung reaksi yang telah disterilkan, dipanaskan di atas kompor listrik selama menit - Medium berwarna bening kekuningan - Pemanasan bertujuan untuk mencairkan media sehingga dapat dituangkan untuk media agar datar pada cawan petri 3. Disediakan dua buah cawan petri dan sekeliling pinggirnya dipanaskan dekat api bunsen - berfungsi untuk mensterilisasi cawan petri dari kontaminan mikroorganisme yang lain

15 4. Dituangkan Medium NA panas ke dalam cawan petri steril - berfungsi sebagai tempat menggoreskan bakteri dan tempat pertumbuhan koloni bakteri 5. Didiamkan selama beberapa menit cawan petri yang telah diberi medium NA panas - berfungsi agar medium NA menjadi padat seperti agar 6. Di panaskan jarum ose hingga membara - berfungsi untuk mensterilisasi jarum sehingga tidak ada mikroorganisme lain yang menempel disana. 7. Dibuka sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk, kemudian dipanaskan bibir tabung - berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain

16 8. Dimasukkan jarum ose bulat pada medium biakan induk jarum ose untuk inokulasi bakteri pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak 9. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk, kemudian segera ditutup dengan sumbat kapas 10. Setiap perlakuan di usahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) 11. Digoreskan inokulum di permukaan media agar di dalam cawan petri yang telah disediakan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping secara merata. Metode gores yang dipakai meode T dan kuadran 12. Ditutup cawan petri dan dipanaskan kembali sekeliling cawan petri dan diisolasi dengan selotip bening 13. Inokulum cawan petri diinkubasi di inkubator pada suhu 37 0 C - berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain - berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril - Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar), fungsi penggunaan medium NA karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi didalamnya yang mengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme - Agar koloni yang terbentuk tersebar merata, tampak jelas dan tidak bertumpukan - berfungsi untuk mensterilisasi cawan petri dan biakan dari mikroorganisme lain - sebagai tempat penyimpanan steril cawan petri dengan menyeting suhu optimum bakteri untuk tumbuh

17 14. Disimpan inokulum ke dalam inkubator dengan posisi terbalik, diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah diinkubasi selama 2 x 24 jam dan 4 x 24 jam Posisi cawan petri terbalik untuk menghindari uap air hasil metabolisme bakteri akan menetes dari tutup cawan ke permukaan media. Hal ini akan menghasilkan suatu masa pertumbuhan yang menganak sungai dan menghancurkan pembentukan koloni secara individu. Sehingga untuk menghindari hal ini, maka ketika diinkubasi, bagian bawah cawan petri diletakkan di atas atau terbalik 15. Setelah diinkubasi selama 2x 24 jam a. Sampel 1: - tidak terbentuk koloni bakteri karena tidak nampak goresan putih menyebar b. Sample 2: - tidak terbentuk koloni bakteri karena tidak nampak goresan putih menyebar

18 16. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam a. Sampel 1: - belum terbentuk koloni bakteri dengan jumlah lebih banyak karena belum terdapat goresan yang nampak jelas b. Sampel 2: - belum terbentuk koloni bakteri dengan jumlah lebih banyak karena belum terdapat goresan yang nampak jelas Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring) No. Perlakuan Pengamatan 1. Disiapkan media biakan induk dari jenis mikroorganisme : Bakteri : Escherichia coli - Masing-masing biakan induk berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring yang berwarna kuning - Pada medium biakan induk koloni bakteri tampak berwarna putih - Diberikan pada 3 sampel media

19 2. Disediakan tiga buah tabung reaksi steril berisi medium agar padat - Medium agar miring berwarna kekuningan - berfungsi sebagai tempat menggoreskan bakteri maupun jamur dan tempat pertumbuhan koloni bakteri maupun jamur 3. Di panaskan jarum ose hingga membara - berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain 4. Dibuka sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk, kemudian dipanaskan bibir tabung - berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain 5. Dimasukkan jarum ose bulat pada medium biakan induk untuk inokulasi bakteri - pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak

20 6. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk, kemudian segera ditutup dengan sumbat kapas - berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain 7. Setiap perlakuan di usahakan dilakuan secara aseptis (di dekat api bunsen) - berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril 5. Digoreskan inokulum di permukaan media agar di dalam tabung reksi yang telah disediakan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping arah zig zag secara merata 6. Dipanas di sekeliling mulut tabung dan segera ditutup dengan sumbat kapas - Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar), fungsi penggunaan medium NA karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi di dalamnya yang mengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme - Digunakan arah zig zag agar memungkinkan koloni yang terbentuk tersebar merata, tampak jelas dan tidak bertumpukan - berfungsi untuk mensterilisasi tabung reaksi dan biakan dari mikroorganisme lain 7. Disimpan inokulum ke dalam inkubator pada suhu 37 0 C, diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam - sebagai tempat penyimpanan steril cawan petri dengan menyeting suhu optimun bakteri untuk tumbuh

21 8. Setelah diinkubasi selama 1x 24 jam a. Sampel 1: - Terbentuk koloni bakteri dengan jumlah yang tidak dapat dihitung, terdapat goresan putih menyebar yang nampak jelas. b. Sampel 2: - Koloni terbentuk dengan goresan putih zig-zag agak menyebar c. Sampel 3: - Koloni terbentuk dengan goresan putih zig-zag agak menyebar 9. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam a. Sampel 1: - Terbentuk koloni bakteri dengan jumlah lebih banyak dan sebagian dapat dihitung, terdapat goresan putih menyebar yang nampak jelas b. Sampel 2: - Koloni terbentuk dengan goresan putih zig-zag agak menyebar

22 c. Sampel 3: - Koloni terbentuk dengan goresan putih zig-zag agak menyebar 4.2. Pembahasan Pada percobaan ini dilakukan inokulasi bakteri Escherichia coli pada medium agar datar dan medium agar miring Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar) Pada penggunaan metode gores dengan medium agar datar, mula mula disiapkan media biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli. Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya. Biakan induk berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring berwarna kuning. Pada medium biakan induk, koloni bakteri tampak berwarna putih. Disediakan sebuah cawan petri steril berisi medium agar padat (medium agar yang sebelumnya telah dipanaskan, dituagkan pada cawan petri steril, kemudian didiamkan untuk proes pendingina). Medium agar datar ini berwarna kekuningan, berfungsi sebagai tempat menggoreskan bakteri dan tempat pertumbuhan koloni bakteri. Selanjutnya dipanaskan jarum ose hingga membara, berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka, kemudian dipanaskan bibir tabung, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Kemudian dimasukkan jarum ose pada medium biakan induk dimana yang digunakan adalah jarum ose bentuk bulat, pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri

23 dapat terambil banyak. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme udara lain. Setelah itu tabung reaksi segera ditutup dengan sumbat kapas. Digunakan sumbat kapas disini karena sifatnya yang dapat menyerap uap air, yang terjadi ketika masa inkubasi. Setiap perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saat inokulasi, tidak ada mikroorganisme kontam. Sebelum inokulasi juga terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang digunakan dan medium benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Gambar 3. Metode Inokulasi pada Cawan Petri Selanjutnya digoreskan inokulum di permukaan media agar di dalam cawan petri yang telah disediakan dengan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping secara merata. Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar), fungsi penggunaan medium NA karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi didalamnya yang mengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme. Ditutup cawan petri, dipanas di sekeliling cawan petri dan diisolasi dengan selotip bening. Perlakuan ini berfungsi untuk mensterilisasi cawan petri dari mikroorganisme lain. Disimpan inokulum ke dalam inkubator dengan posisi terbalik, diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Posisi cawan petri diletakkan terbalik karena selama inkubasi terbentuk air yang mengembun di dalam cawan petri. Air akan menetes dari tutup cawan ke permukaan. Hal ini akan menghasilkan suatu masa pertumbuhan yang menganak sungai dan menghancurkan pembentukan koloni secara individu. Untuk menghindari hal ini, maka ketika diinkubasi, bagian bawah cawan petri diletakkan di atas atau terbalik.

24 Penggoresan inokulum pada media agar dilakukan untuk dua sampel. Sampel pertama menggunakan goresan kuadran dan sampel ke 2 goresan T. Goresan Kuadran Goresan T Gambar 4. Metode Gores pada Cawan Petri Dari hasil pengamatan 2 x 24 jam dapat dilihat tidak terbentuknya koloni bakteri dengan tidak adanya goresan putih meyebar zig-zag pada permukaan medium NA, dengan kata lain bakteri belum tumbuh pada jangka waktu ini. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam koloni Escherichia coli masih juga belum terbentuk, belum terlihat adanya streak putih zig-zag menyebar. Berikut gambar perbandingan antara koloni bakteri Escherichia coli yang terbentuk dari sumber referensi dibandingkan dengan hasil pengamatan : -Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (tidak terbentuk koloni)

25 Dari hasil pengamatan, pada kedua perlakuan dengan waktu yang berbeda, tidak ditemukan koloni yang terbentuk. Tidak terbentuk koloni bakteri bisa disebabkan adanya bahan kontaminan yang masuk saat inokulasi, penggunaan jarum ose belum benar benar steril / belum tersterilisasi secara keseluruhan. Metode gores yang dilakukan pada percobaan ini dengan menggunakan cawan petri. Cawan petri ini berfungsi berfungsi sebagai tempat madium agar datar untuk penanaman mikroorganisme dan tempat isolasi. Keuntungan penggunaan cawan petri adalah untuk memperoleh biakan dengan jumlah yang banyak dan lebih mudah untuk melihat morfologi biakan. Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar yang sebelumnya dipanaskan agar bisa membentuk medium. Agar lalu didinginkan dalam tabung reaksi hingga memadat dan berwarna kuning muda sehinnga membentuk agar tegak. Medium agar tegak adalah medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan. Keuntungan dari media agar tegak ini adalah luas permukaan besar sehingga memudahkan untuk identifikasi sedangkan kerugiannya adalah peluang kontaminasi yang besar karena luas permukaan yang lebar Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring) Untuk penggunaan metode gores dengan medium agar miring, mula-mula disiapkan media biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli. Biakan induk berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring yang berwarna kuning. Pada medium biakan induk, koloni tampak berupa sebaran/suspensi putih pada permukaan atas media. Disediakan tiga buah tabung reaksi steril berisi medium agar padat. Medium agar miring berwarna kekuningan berfungsi sebagai tempat menggoreskan jamur dan tempat pertumbuhan koloni jamur. Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka, kemudian bibir tabung dipanaskan berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Setelah itu, jarum ose dimasukkan pada medium biakan induk. Jarum ose bentuk bulat untuk inokulasi bakteri. Pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulat jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dipanaskan kembali, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Kemudian segera ditutup

26 dengan sumbat kapas Sumbat kapas lemak bertujuan agar keadaan mikroorganisme di dalam tabung reaksi tetap steril, apabila ada kontaminan yang akan masuk, maka dapat terserap dengan sumbat kapas tanpa dapat mempengaruhi mikroorganisme yang akan dibiakkan. Gambar 5. Teknik Inokulasi pada Media Miring Setiap perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril. Inokulum digoreskan di permukaan media agar miring di dalam tabung reksi yang telah disediakan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping arah zig-zag. Arah zig-zag digunakan supaya memungkinkan koloni yang terbentuk tersebar merata dan tampak jelas serta tidak bertumpuk dari koloni yang akan terbentuk. Dipanas di sekeliling mulut tabung dan segera ditutup dengan sumbat kapas berfungsi untuk mensterilisasi tabung reaksi dan biakan dari mikroorganisme lain. Inokulum disimpan ke dalam inkubator agar medium dapat tumbuh pada wadah yang steril dengan menyeting suhu 37 0 C sebagai suhu optimun bakteri untuk tumbuh, kemudian diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Berikut gambar perbandingan antara koloni bakteri Escherichia coli yang terbentuk dari sumber lain dengan hasil pengamatan -Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (terbentuk koloni)

27 Dari hasil pengamatan dapat dilihat mulai terbentuknya satu koloni bakteri dan terdapat goresan yang nampak samar. Pada suatu percobaan pada umumnya bentuk koloni yang terbentuk di medium agar miring adalah berwarna putih (dilihat dari tiga sampel yang diamati). Medium yang digunakan adalah larutan Nutrient Agar yang sebelumnya dipanaskan agar bisa membentuk medium miring yang didinginkan hingga memadat dengan memiringkan tabung reaksi sehinnga membentuk agar miring dan berwarna kuning muda. Medium agar miring adalah medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang diletakkan miring pada waktu pendinginan. Keuntungan media agar miring ini yaitu luas permukaan yang kecil sehingga peluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang untuk digunakan strain murni (indukan murni). Sedangkan kerugiannya hanya memuat sedikit mikroorganisme. Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar) karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi di dalamnya yang mengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme. Medium NA berfungsi untuk membiakkan berbagai macam mikroorganisme serta kultur bakteri. Medium NA dibuat atau disediakan untuk medium bagi bakteri. Sedangkan medium NA yang instant merupakan media non sintetik karena menggunakan bahan yang terdapat di alam biasanya tidak diketahui kandungannya secara rinci. Struktur protein besar dan relatif insolubel yang mana hanya sebagian kecil bakteri saja yang dapat langsung menggunakannnya, tetapi enzim yang disebut pepton dapat mengurai protein menjadi rantai yang lebih kecil yang disebut pepton. Bagian kecil dan solubel ini dapat dicerna oleh sebagian besar bakteri. Medium ini memiliki komposisi kimia tertentu antara lain OXOID CMD003 Nutrient Agar, typcal formula (g/l) yaitu :Lab-lemco powder 1.0, Yeast extract 2.0 (yang berfungsi sebagai fermentor), Pepton 5.0 (sebagai sumber protein), Sodium Chlorida 5.0 (sebagai sumber unsure S dan sumber garam mineral), Agar 15.0 (sebagai pemadat), Akuades 1000 ml, Ekstrak daging sapi : 3 gr, NaCl : 8 gr. Pada praktikum ini kita mempelajari bagaimana melakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril. Sehingga setelah melakukan serangkaian acara praktikum ini dapat didefinisikan bahwa teknik inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium lama ke medium baru dengan tingkat ketelitian sangat tinggi dan dituntut sekali bekerja secara aseptik yaitu bebas dari pengaruh kontaminan

28 mikroorganisme pengganggu yang lain. Teknik aseptik dilakukan dengan penyediaan alatalat kerja yang steril dan bekerja di dekat api bunsen agar terhindar dari kontaminan udara. Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghancurkan semua bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindahan. Setelah diinokulasi, biakan bakteri disimpan atau diinkubasi dalam lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Kumpulan dari sel-sel anakan akan tampak dengan mata telanjang sebagai suatu kekeruhan dalam media cair atau populasi yang terpisah yang disebut koloni pada media padat Esherichia coli Escherichia coli adalah bakteri yang hidup dalam saluran usus manusia dan hewan berdarah panas tetapi tidak pada ikan. Beberapa penelitian terdahulu menemukan bahwa 92,9 % Escherichia coli yang mencemari bahan makanan berasal dari tinja manusia. Sehingga keberadaannya pada bahan makanan atau ikan segar menunjukkan adanya ancaman kesehatan pada konsumen (manusia), sebab dapat diartikan bahwa bahan makanan atau ikan telah tercemar oleh tinja manusia. Oleh karenanya maka, Escherichia coli dipakai sebagai indikator cemaran yang berbahaya bagi manusia (Buckle, dkk. 1990). Klasifikasi : Superdomain:Phylogenetica Filum:Proteobacteria Kelas:GammaProteobacteria Ordo:Enterobacteriales Famili:Enterobacteriaceae Genus:Escherichia Spesies: E. coli (Wikipedia, 2008)

29 Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal yang berasal dari kotoran hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Oleh karena itu, dikenal juga dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia coli berupa batang pendek (0,5-1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu flagela secara merata tersebar diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-ciri biokimiawinya adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini memberikan cara-cara dasar untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada lingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986). Pada jurnal imiah analisa bakteri kloriform jenis E.coli pada air minum dilakukan tes pelengkap menggunakan metode medium agar miring NA dengan jarum inokulasi secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif terbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri Escherichia coli. Berdasarkan media agar miring NA, dibuat pewarnaan Gram dimana bakteri Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu 37 0 C (untuk golongan koli ) dan satu seri diinkubasi pada suhu 42 0 C (untuk golongan koli fekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42 0 C, sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 42 0 C (Widiyanti et al, 2004).

30 BAB V KESIMPULAN Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulan bahwa teknik inokulasi merupakan teknik pemindahan bakteri ke dalam media dengan perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian biakan bakteri. Teknik inokulasi dapat dilakukan dengan metode gores pada agar datar (streak plate method) dan metode gores pada agar miring (streak plate method). Proses inokulasi harus benar-benar aseptik atau steril supaya tidak terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme lain. Pada hasil pengamatan metode gores agar miring terlihat adanya garis zig-zag putih menyebar yang menandakan koloni bakteri E.coli biakan tumbuh. Sedangkan pada metode gores agar datar tidak ditemukan garis zig-zag putih yang menandakan belum tumbuhnya koloni bakteri E.coli dan hal ini dapat dikarenakan oleh beberapa faktor penentu.

31 DAFTAR PUSTAKA Anonim, diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul WIB Anonim, diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul WIB Buckle,K.A., J.A. Davey, M.J. Eyles, A.D. Hocking, K.G. Newton, and E.J. Stuttard Foodborne Microorganisms of Public Health Significance. 4 ed.. AIFST (NSW Branch).Australia. Cappuccino, J.G and N.Sherman Microbiology: a Laboratory Manual. Adison- Wesley Publishing company: California Dwidjoseputro, D Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang. Pelczar, M Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta. Rohimat, I Teknik Inokulasi Mycorrhizae arbuscular pada Bibit Jambu Mente. Buletin Teknik Pertanian Vol.7 Nomor 2. Hal : Waluyo, L Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang. Winarni, D Diktat Teknik Fermentasi. Program Studi D3 Teknik Kimia FTI-ITS : Surabaya. Widiyanti, Ni Luh Putu Manik, Ni Putu Ristianti. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform Pada Depo Air Minum Isi Ulang Di Kota Singaraja Bali. Jurnal Ekologi Kesehatan Vol 3 No 1, April 2004 : 64-73

32 LAMPIRAN Diskusi: 1. Mengapa pada saat dilakukan inokulasi bakteri pada media agar miring dimulai dari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung secara zig-zag? 2. Mengapa biakan yang baru diinokulasi harus disimpan dalam inkubator dalam suhu tertentu? Jawaban: 1. Supaya pertumbuhan bakteri tersebar pada seluruh bagian permukaan media dan dilakukan secara zig-zag supaya pertumbuhan bakteri semakin banyak karena penggoresan juga semakin banyak dan terjadi degradasi, pada akhir goresan akan semakin jarang dan tampak bentukan koloninya. 2. Supaya biakan bakteri dapat tumbuh secara optimal sesuai dengan suhu yang dibutuhkan. Karena tiap jenis bakteri membutuhkan suhu yang berbeda-beda dalam pertumbuhannya, ada yang C ada pula yang kurang dari C.