xxxiv METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 xxxiv METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmasi dan Laboratorium Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi dan Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, FKH-IPB serta Laboratorium Mikro SEAFAST IPB. Waktu penelitian dilaksanakan dari bulan Mei 2009 hingga Januari Bahan dan Alat Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih galur Sprague Dawley dengan jenis kelamin jantan. Bahan yang digunakan adalah simplisia daun alpukat, etanol 70%, aquadest, NaOH 10%, H 2 SO 4, kloroform, amoniak, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, pereaksi Wagner, FeCl 3 1%, etilen glikol, amonium klorida, eter, kit kreatinin, kit urea, PGA, betadine, NaCl 0,9%, furosemide, BNF 10%, alkohol bertingkat, alkohol absolut, xylol bertingkat, xylol absolut, paraffin, pewarna Hematoksilin-Eosin dan nitrogen cair. Alat yang digunakan adalah beaker glass, termometer, vacuum drying, timbangan, corong, kompor, sonde oral tikus, kandang tikus, syringe, vacutainer blood, tabung eppendorf, spektrofotometer UV/VIS, mikropipet, dan tabung reaksi. Metodologi Determinasi dan Pengumpulan Daun Alpukat Daun alpukat diperoleh dari Balai Penelitian Tumbuhan Rempah dan Obat (BALITRO) Bogor dan dilakukan determinasi di Pusat Penelitian LIPI Cibinong. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Alpukat Daun alpukat yang dipilih adalah yang terletak di tengah dan daun yang sudah tua. Daun dibersihkan dengan air mengalir hingga bersih dan dikeringkan dengan cara dijemur. Simplisia kering daun alpukat diserbukan dan diayak dengan ayakan mesh 16 sehingga diperoleh serbuk daun alpukat. Kemudian serbuk

2 xxxv disimpan dalam wadah bersih dan ditutup rapat. Pembuatan simplisia dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Tropis Bogor. Penapisan Fitokimia Kandungan senyawa aktif yang terdapat dalam tanaman dapat diketahui melalui perlakuan metode pemisahan, pemurnian, dan identifikasi kandungan di dalam tanaman dengan penapisan fitokimia (Harbone 1987). Kandungan senyawa organik yang umum diidentifikasi adalah alkaloid, tanin, flavonoid, saponin, steroid, dan triterpenoid. Uji Flavonoid. Sebanyak 0,1 g serbuk daun alpukat ditambah metanol hingga terendam, lalu dipanaskan. Ke dalam larutan ditambahkan NaOH 10% atau H 2 SO 4 pekat. Apabila terbentuk warna merah karena penambahan NaOH 10%, menunjukan adanya senyawa fenolik hidrokuinon, sedangkan warna merah akibat penambahan H 2 SO 4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 g serbuk daun alpukat ditambah 5 ml kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 2 tetes H 2 SO 4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung, kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Tanin. Sebanyak 0,1 g serbuk daun alpukat ditambahkan 5 ml aquades, dididihkan selama 5 menit kemudian disaring dan ke dalam filtratnya ditambahkan 5 tetes FeCl 3 1% (b/v). Apabila terbentuk warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukan adanya tanin.

3 xxxvi Uji Kuinon. Sebanyak 0,1 g serbuk daun alpukat ditambahkan etanol 70%, kemudian ditambah gelatin dan disaring. Ke dalam filtrat ditambahkan NaOH 1 N. Jika terbentuk warna merah berarti mengandung kuinon. Uji Saponin. Sebanyak 0,1 g serbuk daun alpukat ditambah 5 ml aquadest, dipanaskan 5 menit, kemudian dikocok selama 5 menit. Busa yang terbentuk setinggi kurang lebih 1 cm dan tetap stabil setelah didiamkan selama 10 menit menunjukkan adanya saponin. Pembuatan Larutan Infusum Daun Alpukat Ekstraksi daun alpukat dilakukan dengan metode panas yaitu infusum dengan menggunakan pelarut air. Serbuk simplisia daun alpukat yang telah ditimbang selanjutnya dimasukkan dalam wadah panci infusum dan dicampur dengan pelarut air. Selanjutnya dilakukan pemanasan hingga 90 C selama 15 menit. Setelah dingin dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring dan filtrat ditampung. Induksi Hewan Coba (Touhami et al. 2007; Khan et al. 1995) Induksi kristalisasi pada hewan coba tikus dilakukan dengan menggunakan etilen glikol dan amonium klorida. Konsentrasi induser yang digunakan adalah larutan 0.75% etilen glikol dan 2% amonium klorida. Pemberian induser dicampur dalam air minum dan diberikan ad libitum selama 10 hari. Desain Penelitian Sebanyak 20 ekor tikus jantan strain Sprague Dawley dibagi menjadi empat kelompok perlakuan yaitu: 1. Kelompok A : kelompok kontrol, hanya diberi minum aquades ad libitum 2. Kelompok B : kelompok kontrol positif, diberi minum aquades ad libitum yang mengandung induser.

4 xxxvii 3.Kelompok C : kelompok perlakuan, diberi minum aquades yang mengandung induser dan dicekok infusum daun alpukat konsentrasi 5%. 4.Kelompok D : kelompok perlakuan 2, diberi minum aquades yang mengandung induser dan dicekok infusum daun alpukat konsentrasi 10%. Pengambilan darah dilakukan pada hari ke-0, 5 dan ke-11 secara intrakardial. Darah tikus yang telah diambil didiamkan terlebih dahulu pada suhu ruangan kurang lebih satu jam untuk mendapatkan serum, selajutnya di sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. Serum dianalis terhadap kadar ureum dan kreatinin dengan menggunakan Kit komersil Human. Organ ginjal diambil untuk dibuat preparat histopatologi dan diwarnai dengan HE. Analisis Ureum Sebanyak 10µl serum dipipet dan ditambahkan 1000 µl enzim reagen, kemudian diaduk hingga homogen menggunakan vortex. Serum kemudian disimpan dalam water bath untuk menjaga temperatur 37 C agar reaksi berjalan dengan baik. Analisis konsentrasi ureum dalam serum menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm. Analisis Kreatinin Sebanyak 0,1 ml serum dipipet dan ditambahkan enzim reagen sebanyak 1,0 ml, kemudian diaduk hingga homogen menggunakan vortex. Serum kemudian dipanaskan dalam water bath untuk menjaga temperatur 37 C. Analisis konsentrasi kreatinin dalam serum menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 492 nm. Analisis Klirens Kreatinin Laju filtrasi glomerulus diukur berdasarkan nilai klirens kreatinin. Analisis klirens kreatinin dilakukan dengan menempatkan tikus dalam kandang metabolit dan urin ditampung selama 24 jam. Volume urin selama 24 jam diukur dan diukur pula kadar kreatinin urin. Klirens kreatinin dihitung dengan menggunakan rumus: Kadar kreatinin dalam urin 24 jam x volume urin 24 jam [ml/menit] Kadar kreatinin serum x 1440

5 xxxviii Pembuatan Preparat Histopatologi Pembuatan preparat histopatologi organ ginjal diawali dengan sampling atau pemotongan organ, lalu potongan organ dimasukan dalam tissue casette dan difiksasi dalam larutan fiksatif Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%. Proses selanjutnya adalah dehidrasi dengan mencelupkan jaringan ke dalam larutan alkohol 70%, 80%, 90% dan 100%, kemudian dilanjutkan dalam larutan alkohol absolut I, II dan III. Tahapan selanjutnya adalah penjernihan jaringan (clearing) dengan memasukan jaringan ke dalam xylol I, II dan III. Selanjutnya dilakukan embedding yaitu penanaman jaringan dalam blok-blok parafin. Blok parafin yang telah mengeras dipasang dalam mikrotom untuk selanjutnya dilakukan pemotongan jaringan (sectioning). Potongan jaringan yang sudah berada di gelas objek dideparafinisasi dan rehidrasi untuk selanjutnya dilakukan pewarnaan Hematoksilin-Eosin. Pengamatan sediaan histopatologi dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dan polarisasi. Evaluasi Histopatologi Evaluasi histopatologi dilakukan terhadap glomerulus maupun tubulus seluruh kelompok hewan coba dan disajikan secara deskriptif. Selain itu juga diamati adanya kristal yang terbentuk. Analisis Data Hasil evaluasi parameter pengamatan dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan dilanjutkan dengan Uji Wilayah Berganda Duncan. HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar air, Kadar Abu dan Penapisan Fitokimia Hasil pemeriksaan parameter spesifik menunjukan bahwa serbuk daun alpukat yang dihasilkan agak kasar, berwarna hijau tua, rasa sepat, dan berbau aromatik yang khas. Hasil pemeriksaan parameter non spesifik serbuk daun alpukat yaitu kadar air sebesar 4,19 % dan kadar abu sebesar 4,25%. Kadar air berfungsi menjaga kualitas simplisia agar tidak ditumbuhi jamur dan tidak

6 xxxix melebihi 5% sebagai persyaratan baku Departemen Kesehatan (2004), sedangkan kadar abu untuk mengetahui kandungan mineral dan tidak boleh melebihi 4,9% sebagai persyaratan baku Materia Medika Indonesia (1978). Pada hasil pemeriksaan ini kedua kadar abu dan air adalah terbakukan. Penapisan fitokimia merupakan suatu metode kimia yang digunakan untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam suatuu simplisia. Hasil penapisan fitokimia simplisia dan infusum daun alpukat disajikan pada Tabel 5. Tabel 5 Hasil uji penapisan fitokimia simplisia dan infusum daun alpukat (Persea americana Mill) Metabolit Sekunder Simpliasia Infusum Flavonoid Tanin Kuinon Saponin Alkaloid Negatif Negatif Triterpen Negatif Pelarut merupakan faktor yang harus diperhatikan dalam kegiatan ekstraksi. Pemilihan pelarut tergantung kepada senyawa yang ingin ditarik dalam ekstrak apakah senyawa polar, non polar atau semipolar. Pada penelitian ini digunakan pelarut air dan memberikan hasil penapisan yang hampir mirip dengan serbuk simplisia. Dengan demikian senyawa metabolit yang terkandung bersifat polar sehingga dapat terekstrak dengan menggunakan pelarut air. Hasil uji penapisan fitokimia terhadap infusum daun alpukat (Persea americana Mill), menunjukan adanya golongann senyawa flavonoid, tanin, kuinon dan alkaloid. Menurut Sastrohamidjojo (1996), flavonoid memiliki atom C15 yang terdiri dari dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Almeida et al. (1998), telah berhasil mengindentifikasi derivat senyawaa flavonoid yang terdapat dalam infusum daun alpukat yaitu quersetin 3-O- -D- arabinopiran nosida, quersetin 3-O- -L-ramnopiranosida (quersitrin) dan quersetin 3-O- -glukopiranoside. Quersetin termasuk golongan flavonolol dan merupakan derivat dari flavonoid. Pada penelitian ini tidak sampai mengidentifikasi derivat flavonoid yang diperoleh. Aktifitas farmakologi dari flavonoid adalah antialergi,

7 xl antiviral, antiinflamasi, hepatoprotektif, antioksidan, antithrombotic, vasodilator dan anti karsinogenik (Seyoum et al. 2006). Tanin merupakan senyawa polifenol yang membentuk kompleks dengan protein tertentu dan membentuk polimer stabil yang tak larut dalam air (Harbone 1987). Aktivitas biologis dan farmakologis dari tanin yang telah diketahui antara lain astringensia, anti tumor, anti oksidasi, anti hipertensi, anti bakteri, anti jamur, anti diabetes, dan anti helmintik (Riocaesar 2010). Kuinon merupakan senyawa berwarna dan memiliki kromofor dasar seperti kromofor pada benzikuinon, naftokuinon, antrakuinon, dan kuinon isoprenoid. Benzikuinon, naftokuinon, antrakuinon biasanya terhidroksilasi dan bersifat senyawa fenol, sehingga diperlukan hidrolisis asam untuk melepaskan kuinon bebasnya (Harbone 1987). Pengujian Fungsi Ginjal Pengujian fungsi ginjal dapat dilakukan melalui keterwakilan laju filtrasi glomeruler (LFG) dan tubuler. LFG dapat diukur melalui pengujian kadar ureum, kreatinin dan klirens kreatinin, sedangkan fungsi tubuler dengan melakukan pengujian Anti Diuretic Hormone Response Test dan uji deprivasi air. Pada penelitian ini diukur kadar ureum, kreatinin dan klirens kreatinin (Kaneko et al. 2008). Kadar Ureum Serum Ureum diproduksi di hati yang berasal dari metabolisme amoniak dan merupakan hasil katabolisme protein. Ureum akan diekskresikan melalui ginjal dan difiltrasi dengan bebas melalui glomerulus. Selanjutnya metabolit ini akan mengalami reabsorpsi pasif di dalam tubulus. Secara normal sekitar setengahnya akan direabsorpsi tetapi tergantung kepada kondisi hidrasi dan laju pembentukan urin di dalam tubulus (Bush 1991). Ureum dapat memberikan informasi mengenai LFG secara kasar, karena berbagai faktor non renal dapat meningkatkan kadarnya dalam darah. Rerata kadar ureum serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 disajikan pada Tabel 6.

8 xli Tabel 6 Rerata kadar ureum (mg/dl) serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 Kelompok Kadar Kreatinin Serum (mg/dl) Hari ke-0 Hari ke-5 Hari ke-11 A (Kontrol) 38,444±3,564 c 49,950±8,728 c 50,550±10,050 c B (Induksi) 40,488±6,869 c 61,242±4,741 c 144,317±28,665 a C (Infusum 5%) 46,296±4,833 c 51,870±9,815 c 92,982±22,809 b D (Infusum 10%) 35,945±20,18 c 41,043±25,203 c 57,978±37,528 c Keterangan : Huruf superkrip yang sama pada kolom yang sama menunjukan hasil yang tidak berbeda nyata (P>0.05) Menurut Hrapkiewicz dan Medina (2007), kadar ureum normal tikus Sprague Dawley dewasa adalah 32,1-44,94 mg/dl, sedangkan rerata kadar ureum seluruh kelompok sebelum perlakuan adalah 35,945-46,296 mg/dl. Berbedanya kadar ureum serum tikus yang digunakan dibanding nilai referensi kemungkinan dipengaruhi oleh perbedaan strain, berat badan dan jenis kelamin. Ilustrasi dari rerata kadar ureum (mg/dl) serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke- 0, 5 dan 11 disajikan pada Gambar 8. Gambar 8 Rerata kadar ureum (mg/dl) serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11. Berdasarkan tabel dan gambar di atas, rerata kadar ureum kelompok A pada hari ke-0 adalah 38,444 mg/dl, pada hari ke-5 perlakuan mengalami kenaikan menjadi 49,950 mg/dl dan pada akhir perlakuan nilai ureum menjadi 50,550 mg/dl. Pada kelompok B terjadi kenaikan nilai rataan kadar ureum, dari 40,488 mg/dl menjadi 61,242 mg/dl, dan terjadi peningkatan yang tinggi pada hari ke-11 yaitu 144,317 mg/dl. Pada kelompok C, rerata kadar ureum sebelum perlakuan adalah 46,296 mg/dl, pada hari ke-5 perlakuan menjadi 51,870 mg/dl

9 xlii dan naik menjadi 92,982 mg/dl pada hari ke-11, sedangkan pada kelompok D rerata kadar sebelum perlakuan adalah 35,945 mg/dl dan pada pada hari ke-5 menjadi 41,043 mg/dl dan naik menjadi 57,978 mg/dl pada hari ke-11. Berdasarkan perhitungan statistik, kadar rataan ureum kelompok C dan D berbeda nyata (p<0,05) dengan kelompok B. Gambar di atas menunjukkan pada kelompok induksi etilen glikol (kelompok B) terjadi peningkatan kadar ureum serum yang nyata (p<0,05) dibanding kontrol. Setelah pemberian infusum terjadi penekanan peningkatan kadar ureum dan penekanan terkuat terjadi pada kelompok D. Rerata kadar ureum serum pada kelompok B menunjukkan peningkatan selama periode perlakuan dan kondisi ini disebut azotemia. Menurut Bush (1991), kondisi yang dapat menyebabkan renal azotemia adalah acute tubular necrosis (ATN) yang bisa disebabkan oleh bahan nefrotoksik. Peningkatan rerata ureum pada kelompok B menunjukkan kuatnya bahan yang bersifat nefrotoksik. Dengan demikian infusum daun alpukat dapat mengoreksi peningkatan kadar ureum darah. Kadar Kreatinin Serum Kreatinin adalah molekul yang mempunyai berat molekul 113 dan berasal dari hasil degradasi kreatin dan kreatin fosfat yang terjadi di dalam otot (Kaneko et al. 2008). Kreatinin diekskresikan seluruhnya ke dalam urin dan kadarnya sangat dipengaruhi oleh fungsi ginjal. Meningkatnya kreatinin dalam darah merupakan indikasi rusaknya fungsi ginjal dan meningkatnya metabolisme otot. Kadar kreatinin serum dan urin dapat digunakan untuk memperkirakan laju filtrasi glomerulus (Lu 1995). Rerata kadar kreatinin serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 disajikan pada Tabel 7. Tabel 7 Rerata kadar kreatinin (mg/dl) serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 Kelompok Kadar Kreatinin Serum (mg/dl) Hari ke-0 Hari ke-5 Hari ke-11 A (Kontrol) 0,982±0,100 a 0,707±0,458 a 1,044±0,084 a B (Induksi) 1,091±0,508 a 1,164±0,659 a 1,477±0,664 a C (Infusum 5%) 0,908±0,150 a 1.143±0,515 a 1,045±0,284 a D (Infusum 10%) 0,800±0,075 a 1.040±0,628 a 0,902±0,028 a Keterangan : Huruf superkrip yang sama pada kolom yang sama menunjukan hasil yang tidak berbeda nyata (p>0.05)

10 xliii Kadar kreatinin sebelum perlakuan pada kelompok A, B, C dan D sepanjang pengamatan berkisar antara 0,707-1,091 mg/dl, relatif lebih tinggi dari yang dilaporkan oleh Hrapkiewicz & Medina (2007) yang berkisar antara 0,2-0,8 mg/dl. Faktor-faktor yang mempengaruhi kadar kreatinin adalah pakan, status hidrasi, aktivitas, perkandangan dan penggunaan obat-obatan tertentu (Kaneko et al. 2008). Ilustrasi rerata kadar kreatinin serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 disajikan pada Gambar Kadar Kreatinin (mg/dl) Hari Kontrol Infus 5% Infus 10% Gambar 9 Rerata kadar kreatinin (mg/dl) serum tikus seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11. Rerata kadar kreatinin pada kelompok A sebelum perlakuan adalah 0,982 mg/dl, pada hari ke-5 menjadi 0,707 mg/dl dan pada hari ke-11 menjadi mg/dl. Rerata kadar kreatinin pada kelompok B sebelum perlakuan adalah 1,091 mg/dl, pada hari ke-5 perlakuan meningkat menjadi 1,164 mg/dl, dan pada hari terakhir perlakuan mengalami peningkatan lagi menjadi 1,477 mg/dl. Rerata kadar kreatinin kelompok C sebelum perlakuan adalah 0,908 mg/dl, kemudian mengalami peningkatan seiring dengan lama perlakuan, yaitu pada hari ke-5 menjadi 1,143 mg/dl dan pada hari terakhir perlakuan mengalami penurunan menjadi 1,045 mg/dl. Untuk kelompok perlakuan D, rerata kadar kreatinin sebelum perlakuan adalah mg/dl selanjutnya pada hari ke-5 menjadi 1,040 mg/dl dan pada hari ke-11 mengalami penurunan menjadi 0,902 mg/dl. Tabel 7

11 xliv menunjukkan bahwa rerata kreatinin serum tidak berbeda nyata pada seluruh kelompok perlakuan (p>0.05). Kadar kreatinin serum pada kelompok B, menunjukan hasil yang cenderung mengalami kenaikan dari periode perlakuan hari ke-0 hingga hari ke- 11. Menurut Kaneko et al. (2008), hubungan antara kreatinin dan laju filtrasi glomerulus (LFG) adalah kurvalinier, yang berarti ketika laju filtrasi glomerulus mengalami penurunan maka akan diikuti dengan kenaikan kadar kreatinin. Kadar kreatinin dalam serum merupakan indikator yang baik untuk mengetahui laju filtrasi glomerulus sebagai petunjuk adanya gangguan fungsi ginjal. Kadar kreatinin serum pada kelompok C dan D mengalami penurunan setelah hari ke-5 perlakuan dengan menunjukkan pola yang sama. Hal ini mengindikasikan kuatnya peran infusum dalam mengembalikan atau mengoreksi atau meningkatkan LFG. Nilai Klirens Kreatinin Klirens kreatinin (KK) adalah laju pembersihan kreatinin dari plasma oleh ginjal. Parameter ini sangat sensitif dan pilihan utama dalam menentukan laju filtrasi glomerulus per satuan waktu tertentu. Rerata nilai KK pada seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 disajikan pada Tabel 8. Klirens kreatinin pada kelompok A relatif dinamis, pada hari ke-0 adalah 0,952 ml/menit, selanjutnya pada pengukuran hari ke-5 diperoleh 2,154 ml/menit dan pada hari ke-11 menjadi 0,819 ml/menit. Pada kelompok B, nilai klirens kreatinin pada hari ke-0 adalah 2,893 ml/menit, selanjutnya pada hari ke-5 mengalami penurunan menjadi 1,563 ml/menit dan pada periode berakhirnya perlakuan pada hari ke-11 menjadi 1,206 ml/menit. Pola antara kelompok A dan B sangat bertolak belakang, nyata terjadi penurunan signifikan pada kelompok B (p<0,05). Yang juga menunjukkan kurva linier penurunan KK adalah penurunan LFG (Stockham dan Scott 2002). Tabel 8 Rerata nilai kreatinin klirens (ml/menit) seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 Kelompok Kadar Kreatinin Serum (mg/dl) Hari ke-0 Hari ke-5 Hari ke-11 A (Kontrol) 0,952±0,764 c 2,154±1,458 cde 0,819±0,805 c

12 xlv B (Induksi) 2,893±1,157 bcd 1,563±1,065 de 1,206±1,027 de C (Infusum 5%) 4,821±1,362 a 2,058±1,139 cde 2,432±1,535 bcde D (Infusum 10%) 4,250±0,684 ab 2,616±1,664 bcde 3,786±1,834 abc Keterangan : Huruf superkrip yang sama pada kolom yang sama menunjukan hasil yang tidak berbeda nyata (p>0.05) Ilustrasi rerata nilai kreatinin klirens seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 disajikan pada Gambar Kreatinin Klirens (ml/mnt) Kontrol Infus 5% Infus 10% Hari Gambar 10 Rerata nilai kreatinin klirens (ml/menit) seluruh kelompok perlakuan pada hari ke-0, 5 dan 11 Pada kelompok C, nilai klirens kreatinin mengalami penurunan dari 4,821 ml/menit menjadi 2,058 ml/menit dan mengalami sedikit kenaikan pada hari ke- 11 menjadi 2,432 ml/menit. Pada kelompok D, nilai rerata klirens kreatinin pada hari ke-0 adalah 4,25 ml/menit, selanjutnya mengalami penurunan pada hari ke-5 menjadi 2,616 ml/menit dan pada hari ke-11 mengalami kenaikan menjadi 3,786 ml/menit. Pada kelompok C dan D, klirens kreatinin menunjukkan pola yang relatif sama. Penurunan terlebih dahulu pada lima hari pertama menunjukkan kuatnya pengaruh kerusakan LFG oleh etilen glikol, dan setelah itu mulai terjadi koreksi perbaikan LFG. Dari data kadar ureum serum, kreatinin serum dan nilai KK, terbukti bahwa pemberian etilen glikol dapat menurunkan LFG, dan akan terkoreksi mendekati kontrol secara linier setelah pemberian infusum daun alpukat. Evaluasi Histopatologi Ginjal Tikus

13 xlvi Etilen glikol merupakan bahan yang bersifat nefrotoksik dan penginduksi kristal oksalat di ginjal (Seyoum et al. 2008). Adanya oksalat akan menghasilkan radikal bebas yang mengakibatkan sel dalam kondisi stress oksidatif. Kondisi ini menginisiasi pelepasan mediator-mediator vasoaktif dengan efek vasokontriksi pembuluh darah, dalam hal ini pembuluh darah ginjal dan berdampak pada penurunan LFG. Dampak dari vasokonstriksi pembuluh darah menyebabkan ginjal mengalami iskemia. Mekanisme penurunan laju aliran darah adalah dengan mengubah transport ion pada permukaan lumen, menurunkan absorpsi natrium sehingga konsentrasi natrium di tubulus distal meningkat. Peningkatan konsentrasi natrium akan menstimulasi renin angiotensin yang berdampak pada vasokontriksi dan penurunan laju aliran darah (Gavin et al. 2007). Pelepasan rennin angiotension menyebabkan terjadinya kenaikan tekanan darah sistemik dan tekanan perfusi ginjal. Kenaikan tekanan perfusi ginjal akan dirasakan oleh reseptor regang miotonik dalam arterial aferen dan mengakibatkan kontraksi pada arterial aferen. Dampak vasokontriksi dari arterial aferen adalah penurunan renal plasma flow (RPF), tekanan kapiler glomerulus (Pgc) dan LFG (Prince dan Wilson 2002). Induksi kerusakan ginjal oleh bahan nefrotoksik etilen glikol diamati melalui gambaran histopatologi dan perhitungan lesio yang terjadi. Hasil pemeriksaan histopatologi ginjal tikus yang dipapar etilen glikol ditemukan perubahan-perubahan pada glomerulus dan tubulus. Perubahan yang ditemui berupa edema glomerulus, degenerasi tubulus yang dicirikan inti epitel yang membengkak, lepas dari membran basal, adanya droplet hyalin, lumen yang penuh dengan endapan protein hingga tubulus yang nekrotik yang ditandai dengan intinya yang piknotis. Menurut Nurulazmy (2010), persentase tubulus nekrotik pada kelompok yang diinduksi etilen glikol (kelompok B) sebanyak 64,2%, lebih tinggi dan berbeda nyata (p<0,05) dibandingkan kelompok yang diberi infus daun alpukat (19,5% & 18%). Keadaan ginjal pada kelompok B sudah dapat dikatagorikan mengalami acute tubular necrotic (ATN). Rendahnya persentase tubular nekrotik pada kelompok C dan D mempertegas bahwa infusum daun alpukat memiliki peluang terhadap perbaikan struktur - morfologi nefron ginjal.

14 xlvii Edema glomerulus ditandai dengan adanya protein pada mesangium hingga ke ruang Bowman dan terjadi perluasan ruang Bowman (Gambar 11). Pada pewarnaan HE terlihat adanya protein yang berwarna merah muda yang memenuhi mesangium hingga ke ruang Bowman. Endapan protein di mesangium dan ruang Bowman di duga merupakan molekul-molekul proinflamasi dan protein kemoaktraktif yang terinisiasi akibat induksi etilen glikol. Gambar 11 Edema glomerulus (panah) dan tubulus nekrotik (bintang) pada kelompok B pasca pemberian etilen glikol. Pewarnaan HE,. perbesaran 400x. Gambar 12 Tubulus nekrotik dengan endapan protein di lumen (bintang) pada kelompok B. Pewarnaan HE, perbesaran 400x.

15 xlviii Hasil pengamatan histopatologi yang lain adalah ditemukan lesio endapan protein dalam lumen tubulus (Gambar 12). Adanya protein di lumen disebabkan oleh lolosnya protein plasma dari kapiler glomerulus yang kemudian mendiami lumen tubulus. Banyaknya protein dalam lumen tubulus juga dapat disebabkan oleh jumlah protein yang melebihi kapasitas absorpsi sel epitel tubulus. Endapan protein tersebut akan di fagosit oleh lisosom. Protein yang difagosit oleh lisosom akan mengalami akumulasi di sitoplasma yang disebut droplet hyaline (Gambar 13) (Cheville 2006). Gambar 13 Hyalin droplet (panah) di epitel tubulus proksimal, dan tubulus nekrotik (bintang) pada ginjal tikus kelompok B. Pewarnaan HE, perbesaran 400x. Penurunan laju aliran darah ke ginjal mengakibatkan sel-sel ginjal mengalami iskemia. Kondisi iskemia yang berkepanjangan akan mengakibatkan sel epitel tubulus proksimal, distal, loop Henle dan duktus pengumpul mengalami degenerasi hingga nekrotik (Gambar 12, 13). Hasil metabolisme etilen glikol bersifat toksik bagi sel epitel tubulus, dan oksalat menimbulkan perlukaan pada sel-sel epitel. Adanya perlukaan pada sel epitel dapat menghasilkan radikal bebas yang memodifikasi lipid dan protein membran sel. Sel epitel yang dalam kondisi stress oksidatif kehilangan kemampuan untuk menyembuhkan perlukaannya. Dampak lanjut dari modifikasi membran sel adalah kematian sel (Meimaridou et al. 2006). Kristal - kristal oksalat yang terbentuk sebagai metabolit etilen glikol membuka peluang afinitas yang tinggi/kuat terhadap kalsium. Pada keadaan ATN,

16 xlix kalsium yang seharusnya mengalami reabsorpsi tubuler menjadi gagal dan berada bebas di dalam lumen tubuli sehingga secara agregat bereaksi dengan oksalat menjadi kalsium oksalat, suatu endapan garam lemah oksalat (Gambar 14). Gambar 14 Kristalisasi (panah) pada ginjal tikus kelompok B di daerah duktus kolektivus (bintang) (HE, cahaya Polarisasi 400x). Menurut Tiselius et al. (2002), agregasi kristal umumnya terjadi di daerah duktus pengumpul karena di daerah ini kondisi ph rendah sehingga kondusif bagi proses agregasi kristal yang diinduksi etilen glikol. Agregasi kristal jarang ditemukan di daerah tubulus proksimal karena adanya proses disolusi kristal oleh enzim lisosom dari epitel tubulus. Adanya perlukaan pada epitel tubulus atau duktus kolektivus akibat hiperoksaluria akan menyebabkan interaksi antara nukleus kristal dan sel. Nukleus kristal dapat tumbuh dan berkembang menjadi batu harus dalam kondisi melekat dan bertahap, sehingga mengalami agregasi membentuk masa yang lebih besar. Metabolit etilen glikol yang berperan dalam pembentukan kristal adalah oksalat (C 2 O 2-4 ). Oksalat memiliki afinitas yang tinggi dengan kalsium sehingga akan bereaksi membentuk garam kalsium oksalat (CaC 2 O 4 ). Garam kalsium oksalat merupakan garam dari asam lemah (asam oksalat). Ikatan kalsium oksalat yang terbentuk masih bersifat labil sehingga kesetimbangan reaksi masih mungkin bergerak ke kanan dan ke kiri. Persamaan di bawah ini menunjukan reaksi kesetimbangan kalsium oksalat:

17 l H 2 C 2 O 4 (aq) + Ca 2+ CaC (s) + 2H 3 O + CaC (s) Ca 2+ (aq) + C 2 O 2-4 Pemberian amonium klorida bertujuan membantu kelarutan dari kalsium oksalat karena efek ion sejenis yang akan menggeser kesetimbangan reaksi. Dalam ginjal terjadi ikatan antara ion Cl - dan Ca 2+ sehingga menghasilkan garam CaCl 2. Reaksi disosiasi amonium klorida dapat dilihat sbb; ` NH 4 Cl (s) NH 4+ + Cl - NH 4+ + H 2 0 NH 3 + H 3 O + Ca 2+ + Cl - CaCl 2 Adanya CaCl 2 : CaCl 2 Ca 2+ (aq) + 2Cl - (aq) Akibat pemberian infusum daun alpukat 5% dan 10%, kristal kalsium oksalat yang terbentuk dari kerusakan tubuler (ATN), tampak inti kristalnya hilang atau terpecah (terfragmentasi). Hal ini dapat dilihat dari ukuran dan sebaran kristal yang kecil-kecil pada kelompok C dan D (Gambar 15 dan 16).

18 li Gambar 15 Kristal dengan ukuran kecil di lumen tubulus distal ginjal kelompok C. Pewarnaan HE, cahaya Polarisasi 400x. Gambar 16 Kristal dengan ukuran sangat kecil di lumen tubulus distal ginjal kelompok D. Pewarnaan HE, cahaya Polarisasi 200x. Hasil metabolisme infusum daun alpukat berupa 3,4 dihydrophenylacetic acid, metahydroxyphenylacetic acid dan 4-hydro-3-methoxyphenylacetic acid dalam urin (Gross et al. 1996). Garam asetat ini memiliki gugus karboksil pada

19 lii posisi Cα. Adanya kalsium oksalat seperti diuraikan di atas menghasilkan reaksi dengan metabolit dari infusum daun alpukat sebagai berikut : HO HO O OH HO HO O O + H 3 O + homoprotocatechuic acid homoprotocatechuic acid CaC (s) Ca 2+ (aq) + C 2 O 4 2- C 2 O H 3 O + HC H 2 O H 3 O + sebagai hasil resonansi gugus karboksilat akan mengubah suasana ph dan akan menggeser kesetimbangan reaksi kimia. Ion kalsium oksalat akan mengalami pergeseran ke arah titik equilibrium dengan bergerak ke kanan membentuk ion hidrogen oksalat dan air. Semua kalsium oksalat yang terbentuk akan melarut perlahan-lahan sehingga endapan kristal yang lebih besar tidak akan terbentuk. Dengan adanya flavonoid dalam infusum daun alpukat membantu penghambatan pembentukan kristal dengan cara mencegah peroksidase membran epitel tubulus sebagai lipid peroksidase (Grases et al. 2009). Daya antioksidan dari quersetin (derivate flavonoid) cukup tinggi sehingga dapat mengikat radikal bebas yang dapat mengakibatkan perlukaan dan perubahan struktur membran sel (Ameha et al. 2006). Salah faktor penentu kesuksesan dalam pembentukan kristal adalah adanya interaksi kristal dengan sel yang mengalami perlukaan. Ketika adanya antioksidan quersetin maka perlukaan pada epitel sel dapat dihambat.