ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA TERPENOID EKSTRAK METANOL AKAR POHON KAYU BUTA-BUTA (Excoecaria agallocha L.)

Transkripsi

1 ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA TERPENOID EKSTRAK METANOL AKAR POHON KAYU BUTA-BUTA (Excoecaria agallocha L.) Fath Dwisari 1*, Harlia 1, Andi Hairil Alimuddin 1 1 Progam Studi Kimia, Fakultas MIPA, UniversitasTanjungpura, Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi 78124, Pontianak * fathdwisari07@gmail.com ABSTRAK Telah dilakukan isolasi senyawa terpenoid dari ekstrak metanol akar pohon kayu buta-buta Excoecaria agallocha L. Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi dan fraksinasi, pemisahan dan pemurnian dengan kromatografi vakum cair dan kromatografi kolom gravitasi. Identifikasi terpenoid dilakukan dengan kromatografi lapis tipis menggunakan reagen semprot liebermanbuchard. Analisis menggunakan spektrofotometri Fourier Transform-Infra Red terhadap isolat menunjukkan adanya serapan gugus -OH (3456,44 dan 3410,15 cm -1 ), C-H alifatik (2924,09 dan 2862,36 cm -1 ), C=O (1712,79 cm -1 ), C=C aromatik (1643,35 dan 1512,19 cm -1 ), dan C-O (1273,02 dan 1226,73 cm -1 ). Kata kunci: Excoecaria agallocha L., Isolasi, Karakterisasi, Terpenoid PENDAHULUAN Wilayah pantai dan pesisir mempunyai sifat dan ciri yang unik yaitu merupakan wilayah peralihan antara ekosistem darat dan laut serta mengandung kekayaan sumber daya alam yang beranekaragam seperti ekosistem hutan mangrove (Fahriansyah dan Yoswaty, 2012). Menurut Soemardji, et al (2002), Indonesia dikenal sebagai salah satu negara yang mempunyai keanekaragaman hayati berupa tumbuhan yang banyak digunakan sebagai obat tradisional. Beberapa bagian dari mangrove bermanfaat sebagai obat. Ekstrak dan bahan mentah dari mangrove telah banyak dimanfaatkan oleh masyarakat pesisir untuk keperluan obat-obatan alamiah. Patil, et al (2012) menyatakan bahwa Excoecaria agallocha L., family Euphorbiaceae, terdistribusi secara luas di daerah pesisir laut dan tepi-hutan bakau di seluruh daerah tropis Afrika, Asia, dan laut Tanaman dari genus Excoecaria terdiri hampir 40 spesies yang terdistribusi di seluruh daerah bakau tropis Afrika, Asia dan Australia barat laut. Spesies yang paling banyak dilaporkan adalah bakau Excoecaria agallocha Linn.Australia. Tanaman ini dikenal berperan penting dalam segi ekonomis, ekologis serta perannya dalam obat-obatan. Getah dari tanaman ini telah digunakan sebagai obat pencahar dan aborsi, serta dalam pengobatan maag, rematik, lepra dan kelumpuhan. Daun dan getah dari pohon ini telah digunakan sebagai racun ikan di beberapa negara seperti India, Kaledonia Baru dan Malaysia. Kulit dan kayu tanaman ini digunakan sebagai obat untuk perut kembung di Thailand (Poorna et al., 2011). Beberapa penelitian pada bagian pohon kayu Buta-buta didapatkan kandungan metabolit sekunder antara lain alkaloid, flavonoid, steroid, saponin dan terpenoid. Sejumlah senyawa terpenoid telah diisolasi dari bagian kulit batang, daun dan getahnya. Serangkaian diterpenoid, triterpenoid derivatif juga telah diisolasi dari beberapa bagian dari pohon E. agallocha yang telah terbukti bioaktif terhadap serangga dan parasit. Terpenoid dan steroid pada bagian akar tanaman ini telah diketahui melalui uji pendahuluan fitokimia Namun, isolasi terpenoid dari akar pohon ini belum dilakukan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi senyawa terpenoid dari akar pohon kayu Buta-buta dengan menggunakan spektrofotometri Fourier Transform-Infra Red (FT-IR). 25

2 METODOLOGI PENELITIAN Alat Alat-alat yang digunakan antara lain seperangkat alat gelas, neraca analitik Ohaus Pioneer TM, seperangkat alat KKG, KLT, KVC, pipet tetes, rotary evaporator Heidolph Laborota 4000 efficient, spektrofotometer Fourier Transform-Infra Red (FT-IR ) Prestige-21 Shimadzu. Bahan Bahan-bahan yang digunakan antara lain asam klorida p.a, asam sulfat p.a, asam asetat p.a, pelarut teknis : etil asetat, metanol, n-heksana, serbuk magnesium, pereaksi Meyer dan Wagner, pereaksi Lieberman-Buchard, silika gel G-60 Merck, dan plat KLT UV 254. CARA KERJA Preparasi Sampel Sampel akar pohon kayu Buta-buta (E. agallocha) yang diambil dari desa Sungai Mas, Kecamatan Sebangkau, Kabupaten Sambas, Kalimantan Barat. Tumbuhan Buta-buta dideterminasi di Laboratorium Biologi FMIPA Universitas Tanjungpura. Sampel akar kering yang telah dibersihkan, kemudian dihaluskan. Ekstraksi dan Partisi Ekstraksi menggunakan metode maserasi. 1,1 kg akar Buta-buta direndam menggunakan metanol selama 3x24 jam Maserat disaring dan ditampung lalu dikentalkan dengan rotary evaporator. Ekstrak kental metanol yang dipartisi secara bertahap dengan pelarut n-heksana dan etil asetat. Skrining Fitokimia a. Uji Alkaloid Ekstrak akar kayu Buta-buta diteteskan pada dua plat tetes. Satu bagian dijadikan sebagai kontrol dan bagian kedua ditetesi dengan pereaksi Mayer dan bagian ketiga ditetesi dengan pereaksi Wagner. Alkaloid dinyatakan positif apabila pada ekstrak yang ditetesi pereaksi Mayer berwarna putih serta pada bagian yang ditetesi pereaksi Dragendorf berwarna coklat kekuningan maka keduanya positif mengandung alkaloid. b. Uji Flavonoid Uji flavonoid dilakukan dengan cara menambahkan asam klorida pekat dan Alat dan Bahan logam Mg pada ekstrak. Tes positif bila terjadi warna merah-jingga. c. Uji Saponin Uji saponin dilakukan dengan mengocok lapisan air dalam tabung reaksi bila terbentuk busa yang tahan selama lebih kurang 15 menit berarti positif untuk uji saponin. d. Uji Terpenoid dan Uji Steroid Uji terpenoid dan steroid dengan cara sampel ditambahkan asetat anhidrat dan asam sulfat pekat. Uji positif menunjukkan golongan senyawa terpenoid dengan terbentuknya warna merah keunguan dan warna biru dan hijau untuk steroid. Isolasi dan Pemurnian Isolasi dan pemurnian ekstrak dilakukan dengan beberapa metode, yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Vakum Cair (KVC), dan Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG): Kromatografi Vakum Cair (KVC) Ekstrak dielusi menggunakan KLT untuk menentukan eluen yang pola pemisahannya paling baik. Fase diam yang digunakan adalah silika gel G60 F 254 dan fasa gerak n-heksana :etil asetat (8:2) (6:4) (4:6)(2:8);etil asetat 100%; etil asetat: metanol (8:2)(6:4)(4:6)(2:8) ; metanol 100%. Fraksi tersebut kemudian dipisahkan dengan Kromatografi Vakum Cair (KVC). Masing-masing eluen yang digunakan adalah 100 ml. Fraksi hasil pemisahan ditampung setiap 100 ml. Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG) Sebelum dilakukan kromatografi kolom, dilakukan terlebih dahulu KLT. Tujuannya adalah untuk menentukan senyawa yang positif mengandung terpenoid dengan menggunakan reagen semprot Lieberman-buchard. Selanjutnya fraksi positif terpenoid ini dielusi dengan Kromatografi Kolom Gravitasi dengan eluen bergradien yaitu : n-heksana:etil asetat (8:2) (6:4)(4:6)(2:8); etil asetat 100%; etil asetat:metanol (8:2)(6:4)(4:6)(2:8); metanol 100%. Eluat hasil pemisahan ditampung setiap 5 ml. Eluat dianalisis menggunakan KLT untuk melihat kesamaan pola pemisahan untuk selanjutnya digabungkan. 26

3 Karakterisasi Isolat menggunakan Spektrofotometri Fourier Transform-Infra Red (FT-IR) Isolat yang diperoleh dianalisis menggunakan spektrofotometer FT-IR.. HASIL DAN PEMBAHASAN Sampel serbuk akar pohon kayu Butabuta (E. agallocha) sebanyak 1,1 kg yang telah dimaserasi menghasilkan sebanyak 100,7612 gr. Sebanyak 85,2339 gr dilarutkan kembali dalam 700 ml metanol dan dipartisi dengan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang yaitu n-heksana dan etil asetat. Skrining fitokimia Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia No Metabolit Sekunder Ekstrak kasar Fraksi N-heksana Etil asetat Metanol 1 Flavonoid Alkaloid Steroid Terpenoid Saponin Penentuan alkaloid hasil yang didapatkan untuk penambahan reagen mayer negatif untuk semua fraksi. Menurut Marliana, et al (2005), hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kaliumalkaloid. Pada pembuatan pereaksi Mayer, larutan merkurium (II) klorida ditambah kalium iodida akan bereaksi membentuk endapan merah merkurium (II) iodida. Jika kalium iodida yang ditambahkan berlebih maka akan terbentuk kalium tetraiodomerkurat (II) (Svehla, 1990). Alkaloid mengandung atom nitrogen yang mempunyai pasangan elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion logam (McMurry, 2004). Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K + dari kalium tetraiodomerkurat(ii) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap. Endapan inilah yang tidak terbentuk pada uji yang dilakukan pada semua fraksi, sehingga dapat dikatakan semua fraksi negatif terhadap alkaloid dengan pereaksi mayer. Hasil positif alkaloid untuk semua fraksi pada uji Wagner ditandai dengan terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning. Diperkirakan endapan tersebut adalah kalium- alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Wagner, iodin bereaksi dengan ion I - - dari kalium iodida menghasilkan ion I 3 yang berwarna coklat. Pada uji Wagner, ion logam K + akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada alkaloid membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap. Uji flavonoid dilakukan dengan penambahan serbuk Mg dan HCl pekat pada tiap fraksi, hasil positif terhadap flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna jingga sampai merah. Hasil uji flavonoid didapatkan negatif untuk fraksi n- heksan dan fraksi etil asetat dan positif untuk fraksi metanol dan pada ekstrak kasar. Uji terpenoid-steroid dilakukan dengan dengan menggunakan pereaksi liebermanbuchard menghasilkan positif terhadap terpenoid untuk semua fraksi. Hasil yang didapatkan untuk fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat pada penambahan liebermanbuchard menghasilkan positif terhadap steroid yang ditandai dengan terbentuknya warna hijau pada fraksi. Penambahan lieberman-buchard pada fraksi metanol dan ekstrak kasar juga menghasilkan positif terhadap terpenoid. Hal ini dapat dilihat dari warna merah-keunguan yang terbentuk. Pengujian saponin dilakukan dengan diberikan perlakuan yang sama pada setiap fraksi yaitu setiap fraksi dilarutkan dengan setiap pelarutnya lalu dipanaskan dan dikocok. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya busa yang bertahan cukup lama setlah pengocokkan selama 15 menit (Harborne, 1987). Untuk fraksi n-heksana terbentuk dua fasa dan terbentuk busa. Pada fraksi etil asetat terbentuk warna kuning susu dan sedikit berbusa sedangkan untuk fraksi metanol adanya warna orange susu tetapi tidak terbentuk busa. Namun, dari keseluruhan busa yang terbentuk dari setiap fraksi, busa hanya bertahan dalam waktu yang sangat singkat sehingga diduga 27

4 busa yang terbentuk adalah hasil dari pengocokkan yang dilakukan bukan karena saponin yang terkandung Isolasi dan Pemurnian. Fraksi yang selanjutnya digunakan untuk isolasi dan pemurnian adalah fraksi metanol. Hal ini dikarenakan pada fraksi metanol menunjukkan hasil positif terhadap terpenoid pada uji pendahuluan fitokimia. Proses pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan metode kromatografi kolom. Sebelum pemisahan dan pemurnian dilakukan terlebih dahulu fraksi dianalisis menggunakan KLT, analisis ini bertujuan untuk menentukan pelarut yang akan digunakan pada saat pemisahan dengan KVC dan KKG. terdapat pola pemisahan pada ekstrak yang digunakan. Pemisahan pertama dilakukan dengan menggunakan KVC dengan diameter kolom 3 cm dan tinggi 16 cm. Kolom yang digunakan diisi dengan silika terembankan dengan perbandingan 5gr : 5gr dan silika kosong dengan perbandingan 1:4 yaitu 5 gr : 20 gr dengan tinggi silika kosong 6 cm dan tinggi silika terembankan 1 cm, kemudian dielusi dengan eluen yang telah didapat dari KLT preparatif dengan volume 100 ml setiap kali elusi dan dihasilkan 10 fraksi. Gambar 2. Hasil KLT hasil KVC Fraksi yang dihasilkan kemudian di KLT untuk melihat pola kromatogram yang sama sehingga dapat digabungkan dan didapatkan 4 fraksi gabungan. Gambar 1. Hasil Kromatografi Lapis Tipis untuk penentuan pelarut Fraksi metanol diuji kemampuan distribusinya menggunakan KLT untuk mendapatkan pola pemisahan yang baik dengan pelarut n-heksana : etil asetat dan metanol dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (8:2)(6:4)(4:6)(2:8);etil asetat 100%; etil asetat : metanol (8:2) (6:4) (4:6) (2:8); metanol 100%. Dari hasil KLT yang dilakukan didapatkan pola pemisahan dan didapatkan eluen yang akan digunakan untuk KVC yaitu eluen dengan perbandingan n-heksana : etil asetat dan metanol dengan perbandingan n-heksana : etil asetat (8:2) (6:4) (4:6) (2:8) ; etil asetat 100%;etil asetat:metanol (8:2) (6:4) (4:6) (2:8); metanol 100%. Dalam hal ini eluen dengan kandungan n-heksan 100% tidak digunakan untuk perlakuan selanjutnya dikarenakan pada n-heksan 100% tidak (a) (b) Gambar 3. Hasil KLT fraksi gabungan, (a) Hasil KLT setelah diterangi lampu UV 254, (b) Hasil KLT setelah disemprot reagen spesifik Lieberman-buchard. Penentuan senyawa terpenoid dilakukan dengan KLT menggunakan reagen semprot Lieberman-buchard terhadap keempat fraksi gabungan. dan didapatkan fraksi dengan kode F 2 sebanyak 5,0023 gr kemudian dilakukan pemurnian kembali dengan KKG dengan eluen yang sama dengan yang digunakan untuk KVC. Hasilnya ditampung setiap 5 ml dan didapatkan sebanyak 88 fraksi yang kemudian dilakukan KLT untuk melihat pola 28

5 pemisahan yang mempunyai kemiripan sehingga dapat digabungkan sehingga didapatkan 9 fraksi gabungan. Gambar 4. Hasil KLT fraksi gabungan hasil KKG setelah disemprot reagen spesifik Leberman-buchard dan di terangi lampu UV 254. (eluen N- heksana : Etil Asetat ; 2:8) Hasil yang didapatkan dari hasil KLT didapatkan adanya pendaran saat sampel disinari UV 254. Menurut Irianti, et al (2011), Suatu senyawa yang berpendar pada UV 254 mengidentifikasikan adanya gugus karbonil, fenolik, atau gugus lain yang mengandung setidaknya 2 ikatan rangkap terkonjugasi. Fraksi yang positif mengandung terpenoid dengan noda tunggal ini kemudian dilakukan KLT kembali dengan eluen yang mempunyai perbedaan kepolaran untuk melihat kemurniannya. Dalam ini digunakan eluen etil asetat:metanol (8:2). Gambar 5. Hasil KLT dengan eluen etil asetat:metanol (8:2) Hasil KLT yang didapatkan, diperkirakan isolat F 2,1 merupakan suatu isolat yang relatif murni secara KLT yang selanjutnya akan dikarakterisasi dengan menggunakan Spektrometer FT-IR. Analisis Spektrum Inframerah Spektrum FT-IR isolat F 2,1 menunjukkan adanya pita-pita dalam daerah serapan pada daerah bilangan gelombang 3456,44 cm -1, mengindikasikan adanya gugus hidroksil -OH, pita serapan pada bilangan gelombang 2924,09 cm -1 menunjukkan adanya regangan C-H dari CH 3, 2862,36 cm -1 diduga adalah regangan dari C-H. Adanya gugus fungsi karbonil (C=O) diindikasikan dengan munculnya serapan pada daerah bilangan gelombang 1712,79 cm -1. Serapan lemah pada bilangan gelombang 1643,35 dan 1512,19 cm -1 meng-indikasikan adanya gugus C=C aromatik. Bilangan gelombang 1273,02 dan 1226,73 cm -1 menunjukkan adanya serapan C-O. SIMPULAN Gambar 6. Spektrum FT-IR Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, karakterisasi isolat menggunakan spektrofotometer FT-IR menunjukkan adanya serapan gugus -OH (3456,44 dan 3410,15 cm -1 ), C-H alifatik (2924,09 dan 2862,36 cm -1 ), C=O (1712,79 cm -1 ), C-O (1273,02 dan 1226,73 cm -1 ), dan C=C aromatik (1643,35 dan 1512,19 cm -1 ). DAFTAR PUSTAKA Fahriansyah dan Yoswaty, D., 2012, Pembangunan Ekowisata di Kecamatan Tanjung Balai Asahan, Sumatera Utara : Faktor Ekologis Hutan Mangrove, Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis, 4 (2) : Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Penerjemah: Padmawina ta K. dan Soediro, I, Terbitan ke-2, Penerbit ITB, Bandung. 29

6 Irianti, T.; Puspitasari, A.; Suryani, E., 2011, Aktivitas Penangkapan Radikal 2,2- Difenil-1-Pikrilhidrazil oleh Ekstrak Etanolik Batang Brotowali (Tinospora crispa (L.) Miers) dan Fraksi- Fraksinya, Majalah Obat Tradisional, 16(3), Marliana, D.S.; Suryanti, V. dan Suyono., 2005, Skrining Fitokimia dan Analisis Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Labu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi. 3 (1) : McMurry, J.; dan Fay, R.C., 2004, McMurry Fay Chemistry, Edisi Keempat, C.A : Pearson Education International, Belmont. Patil, R.C.; Manohar, S.M.; Katchi, V.I.; Rao, A.J., 2012, Ethanolic Stem Extract of Excoecaria agallocha Induces G1 Arrest or Apoptosis in Human Lung Cancer Cells Depending on Their P53 Status, Taiwania. 57 (2): Poorna, C.A.; Resmi, M.S.; Soniya, E.V., 2012, In Vitro Antioxidant Analysis and the DNA Damage Protective Activity of Leaf Extract of the Excoecaria agallocha Linn. Mangrove Plant, International Journal of Agricultural Chemistry, 1(4) : 1-6. Soemardji, A.A.; Endang, K.; Cucu, A., 2002, Toksisitas Akut dan Penentuan DL 50 Oral Ekstrak Air Daun Gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F.) pada Mencit Swiss Webster, Matematika dan Sains Journal, 7 (2) : Svehla, G., 1990, Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semimikro, Edisi kelima. Penerjemah: Setiono, L. dan Pudjaatmaka, A.H., Kalman Media Pustaka, Jakarta. 30