II. TINJAUAN PUSTAKA

Transkripsi

1 9 II. TINJAUAN PUSTAKA Budidaya Tanaman Anggrek Anggrek secara taksonomi diklasifikasikan ke dalam Phylum Spermatopytha, yaitu digolongkan ke dalam tumbuhan berbiji, Kelas Angiospermae atau berbiji tertutup, Subkelas Monokotiledonae atau bijinya berkeping satu, Ordo Gynandrae karena alat reproduksi jantan dan betina bersatu sebagai tugu bunga, Famili Orchidaceae atau keluarga anggrek (Puspitaningtyas et al. 2003). Orchidaceae merupakan famili tanaman terbesar, terdiri dari sekitar 900 genera dan hampir spesies. Dendrobium, genus terbesar dalam famili Orchidaceae terdiri dari sekitar 1100 spesies (Cordel 1999). Anggrek dapat diperbanyak secara generatif dari biji atau secara vegetatif (konvensional dan kultur in vitro). Tanaman anggrek hibrida diperoleh dari biji hasil silangan dan perbanyakannya dilakukan secara vegetatif untuk mempertahankan hibrida yang telah diseleksi. Penggunaan teknik pembiakan vegetatif konvensional, potensinya terbatas karena hanya sejumlah kecil tanaman yang dapat dihasilkan dalam satu kurun waktu tertentu (George 1996). Beberapa jenis tanaman anggrek yang populer di masyarakat antara lain: Oncidium, Cattleya, Phalaenopsis, Dendrobium, Vanda dan Aranthera. Anggrek dipasarkan dalam bentuk bunga potong maupun tanaman dalam pot. Anggrek dari genus Dendrobium menghasilkan anakan dari umbi semu yang disebut dengan keiki yang seringkali berakar tapi masih melekat pada tanaman, dan hanya membutuhkan pemisahan untuk ditanam untuk mendapatkan tanaman baru (George 1996). Dendrobium Dendrobium adalah salah satu genus dari Famili Orchidaceae. Genus Dendrobium memiliki lebih dari 600 spesies yang menyebar di daerah tropis Asia Selatan dan Tenggara, mulai dari Himalaya, Filipina sampai ke Australia. Dendrobium dibedakan menjadi dua macam yaitu evergreen Dendrobium atau Dendrobium yang selalu berwarna hijau berasal dari Australia dan deciduous Dendrobium atau yang berganti daun berasal dari sebelah utara Equator (Logan & Lloyd 1955). Saat ini sudah banyak jenis Dendrobium spesies yang telah

2 10 ditemukan antara lain adalah D. aureum, D. brymerianum, D. chrysotoxum, D. jamesianum, D. phalaenopsis, D. saisar. Anggrek Dendrobium tumbuh menyebar di Asia Selatan, India, dan Srilanka. Di Asia Timur bunga ini banyak dibudidayakan oleh masyarakat Jepang, Taiwan dan Korea. Kebanyakan anggrek Dendrobium tumbuh liar di daerah tropis seperti Asia. Di Asia Tenggara, tanaman ini menjadi andalan Negara Thailand, Singapura, Indonesia dan Filipina. Sebarannya pun meluas ke Papua, Selandia Baru dan Tahiti. Dalam jumlah terbatas ditemukan di Selatan Amerika Serikat, dan daerah jajahan Inggris. Di Indonesia, Dendrobium banyak ditemukan di hutan Pulau Jawa, Kalimantan, Sulawesi, Sumatera, Papua, Maluku dan Nusa Tenggara. Beberapa spesies menyebar secara sangat luas, diantaranya D. anosmum, tersebar dari India sampai Papua (Chan et al. 1994). Dendrobium termasuk anggrek epifit (menempel pada tanaman lain tetapi tidak merugikan tanaman induk yang ditumpanginya) (Ashari 1997). Dendrobium tergolong anggrek simpodial, yaitu anggrek dengan pertumbuhan ujung batang yang akan terhenti bila telah mencapai maksimum dan pertumbuhan anggrek akan dilanjutkan dengan pertumbuhan anakan baru. Batang anggrek Dendrobium berbentuk menggelembung dan berdaging, karena batang ini berfungsi sebagai tempat penyimpanan cadangan makanan dan air (Arditi 1984). Batang anggrek ini berbentuk gada, pada bagian pangkal kecil dan pada bagian tengah membesar kemudian bagian ujung batang anggrek ini mengecil lagi. Daun berbentuk lanset dengan ujung yang tidak simestris, panjang daun sekitar 12 cm dengan lebar 2 cm. Bunga tersusun dalam satu rangkaian yang berbentuk tandan yang tumbuh pada buku batangnya dan agak menggantung dengan panjang tandan sekitar 60 cm, jumlah bunga dalam tiap tandan sekitar 6-24 kuntum dengan diameter sekitar 6 cm (Sastrapraja et al. 1976). Akar anggrek umumnya lunak dan mudah patah. Ujung akar meruncing, licin, sedikit lengket dan berwarna putih. Akar anggrek mempunyai lapisan velamen yang mengandung klorofil dan berongga sebagai tempat penyimpanan air. Akar memiliki daya lekat pada bagian yang bentuknya agak pipih mengikuti permukaan batang penyangga dan terdapat rambut-rambut yang pendek untuk menyerap air dan makanan (Arditi 1984; Puspitaningtyas et al. 2003).

3 11 Phalaenopsis Salah satu genus yang ada pada Famili Orchidaceae adalah Phalenopsis. Genus Phalaenopsis terdiri atas 60 spesies yang menyebar dari Himalaya ke berbagai negara seperti Thailand, Indo-Cina, Malaysia, Indonesia, New Guinea, Australia, Taiwan dan Cina Selatan. Di Indonesia, plasma nutfah anggrek Phalaenopsis tumbuh secara alami dalam habitat hutan di berbagai wilayah, misalnya Maluku, Sulawesi, Pulau Seram, Ambon, Buru, Kalimantan, Sumatra dan Jawa (Setiawan 2002). Pada tahun 1753, Linnaeus memberikan nama Epidendrum amabila pada spesies anggrek bulan di Nusa Kambangan. Pada tahun 1825 spesies ini diberi nama P. amabilis oleh seorang ahli botani Belanda yang bernama Prof.C.L. Blume, karena beliau melihat sekumpulan kupu-kupu yang hinggap di dahan dan tidak mau bergerak dari tempatnya, ketika didekati ternyata sekumpulan anggrek kupu-kupu atau anggrek bulan. Sejak saat itu hingga sekarang, anggrek bulan dikategorikan dalam genus Phalaenopsis (Rukmana 2000). Phalaenopsis tumbuh monopodial yang berarti hanya mempunyai batang utama yang tumbuh terus ke atas dan tidak terbatas. Batang pendek dan tidak mempunyai pseudobulb. Akar berdaging muncul dari batang atau buku bagian bawah. Tangkai bunga tumbuh menembus upih daun, seringkali bercabang, agak pendek atau panjang, berbunga sedikit atau banyak. Bunga mekar bersamaan atau tidak, ukuran kecil, sedang atau besar, tidak berbau atau berbau harum, warna putih, kuning atau ungu (Nursandi 1997). Oncidium Oncidium merupakan genus yang terdiri dari lebih 750 spesies, terbanyak ditemukan di Amerika Selatan, beberapa di Amerika Tengah dan Kepulauan Karibia, dan sedikit di Florida. Oncidium pada umumnya epifit dan beberapa diantaranya merupakan anggrek tanah. Oncidium memiliki pseudobulb, tetapi beberapa diantaranya tidak memiliki psudobulb (Shuttleworth et al. 1970). Menurut Morrison (2000) genus Oncidium dikarakterisasi oleh adanya pseudobulb unifoliat dan bifoliat dari internode tunggal yang terlindung oleh pelepah daun yang menggelembung. Infloresens dihasilkan dari ujung pelepah tersebut, bagian dasar dari tangkai keluar dari pseudobulb. Spesies dari genus ini dapat tumbuh pada ketinggian 4000 m dpl.

4 12 Bunga umumnya berwarna kuning, namun terdapat juga yang berwana merah muda dan coklat. Ukuran bunga bervariasi antara ¼ inchi sampai di atas 4 inchi. Beberapa dari spesies Oncidium disebut sebagai dancing ladies sebab memiliki rangkaian tangkai bunga yang panjang dengan membentuk formasi seperti kelompok penari balet. Beberapa contoh jenis Oncidium diantaranya adalah O. nubigenum dari Kolombia, O. triquetrum dari Jamaika, O. bicallosum dari Meksiko dan Guatemala serta O. cebolleta dari Meksiko dan Paraguay (Shuttleworth et al. 1970). Kultur Jaringan Tanaman Anggrek Kultur jaringan secara luas dapat didefinisikan sebagai usaha mengisolasi, menumbuhkan, memperbanyak, dan meregenerasikan protoplast, sel utuh atau bagian tanaman seperti meristem, tunas, daun muda, batang muda, ujung akar, kepala sari, dan bakal buah dalam suatu lingkungan aseptik yang terkendali. Pada awalnya metode ini merupakan penelitian laboratorium sebagai bagian dari penelitian fisiologi tentang pertumbuhan dan perkembangan tanaman (Gunawan 1992). Kultur jaringan menggunakan teori sel seperti yang dikemukakan oleh Schleiden & Schwann pada tahun Menurut kedua ahli itu, sel mempunyai kemampuan otonom (mampu tumbuh mandiri), bahkan mempunyai kemampuan totipotensi yaitu kemampuan sel atau jaringan untuk tumbuh dan berkembang seperti sel zigot karena memiliki susunan genetik yang sama (Wattimena et al. 1992). Pertumbuhan dan perkembangan tanaman secara in vitro ditentukan oleh faktor yang kompleks, meliputi hara anorganik, faktor fisik, dan substansi organik. Faktor bahan tanaman yang turut menentukan keberhasilan kultur jaringan antara lain genotipe tanaman, status fisiologi, ukuran, sumber, dan umur eksplan (Pierik 1987). Keberhasilan pertumbuhan jaringan juga sangat dipengaruhi oleh adanya hubungan timbal balik antara tanaman itu sendiri dengan faktor lingkungan, seperti komposisi media dan ph, cahaya, suhu, kelembaban, dan kadar oksigen. Selain itu, juga diperlukan keahlian dalam memotong bahan tanaman yang akan ditanam dalam media steril dan dalam mendesinfeksi jaringan, dasar pengetahuan Kimia dan Biologi yang memadai, serta ketekunan dan ketelitian kerja yang tinggi. Kelengkapan sarana yang memadai juga dapat meningkatkan persentase jaringan yang tumbuh (Widiastoety 1997).

5 13 Seiring dengan perkembangan ilmu dan teknologi dan dengan ditemukannya auksin dan sitokinin serta prinsip pengaturan perimbangan kedua zat pengatur tumbuh tersebut, regenerasi dari sel menjadi tanaman lengkap pada banyak spesies sudah berhasil dilakukan (Gunawan 1992). Dewasa ini kultur jaringan telah digunakan untuk tujuan perbanyakan tanaman seperti kentang, jahe, pisang, asparagus, dan beberapa tanaman hias seperti anggrek, krisan, dan Dianthus (Wattimena et al. 1992). Beberapa kebun pembibitan dan pengembangan anggrek kemudian menerapkan metode ini untuk memperoleh klon-klon anggrek yang sangat eksklusif. Perbanyakan anggrek secara kultur jaringan dapat dilakukan melalui eksplan berupa mata tunas, biji, dan meristem untuk tujuan tertentu. Perbanyakan vegetatif anggrek melalui kultur meristem dapat dibagi dalam tiga tahap yaitu transformasi meristem menjadi protocorm like body (plb), perbanyakan protocorm dengan memotongnya menjadi potongan yang lebih kecil, dan perkembangan protocorm-protocorm tersebut berakar dan berpucuk (Pierik 1987). Istilah plb merupakan istilah untuk struktur yang mirip protocorm yang terbentuk dari jaringan tanaman dan atau kalus secara in vitro. Istilah ini pertama kali diperkenalkan oleh Georges Morel (Arditti & Ernst 1992). Sumber lain menyebutkan bahwa istilah protocorm diperkenalkan pertama kali oleh Melchior Trueb, yang pernah menjabat sebagai direktur Botanical Gardens di Bogor (sekarang Kebun Raya Bogor), untuk menggambarkan suatu tahap dalam perkembangan lumut (Arditti & Ernst 1992). Kemudian Noel Bernard menggunakan istilah tersebut untuk anggrek antara tahun 1899 dan Istilah tersebut sekarang digunakan untuk menggambarkan suatu badan yang mirip bulatan-bulatan umbi kecil yang terbentuk pada biji-biji anggrek yang berkecambah (Arditti & Ernst 1992; Ratnadewi et al. 1991). Individu Protocorm saat dipisah-pisahkan dan disubkultur sering menghasilkan protocorm adventif (George 1996). Massa protocorm yang dipisah-pisahkan dan ditumbuhkan di media serupa yang baru akan memperbanyak diri menjadi massa protocorm yang baru. Bila pisahan protocorm tersebut ditumbuhkan dalam media lain yang mengarah ke proses pendewasaan dan perakaran, maka protocorm akan tumbuh menjadi tanaman baru yang sempurna dan siap dipindahlapangkan (Gunawan 1992). Biji-biji anggrek mengandung embrio berdiameter kurang Iebih 0,1 mm, tidak mengandung endosperm atau kotiledon. Saat berkecambah, embrio ini

6 14 akan membentuk protocorm, suatu struktur seperti corm yang berwarna hijau dan mampu melakukan fotosintesis. Tunas dan akar akan terbentuk bila kandungan senyawa-senyawa organik dalam protocorm cukup, dan kecambah normal terbentuk (Wattimena et al. 1992). Kultur Jaringan dan Virus Tumbuhan Kultur jaringan tanaman sejak lama telah digunakan untuk mengatasi penyebaran penyakit. Penghambatan penyebaran penyakit dapat dilakukan dengan menghasilkan plantlet yang bebas penyakit dengan perlakuan tertentu pada eksplan. Teknik kultur jaringan menjadi metode yang sering digunakan untuk manipulasi genetik dan eliminasi virus melalui kultur meristem apikal. Pemanfaatan kultur jaringan untuk pengendalian virus dilakukan dalam hal tahapan untuk perlakuan lain yang akan dilakukan. Misalnya untuk menghasilkan tanaman tahan terhadap virus dengan memberikan perlakuan pada kalus yang ditumbuhkan pada kultur menggunakan kemoterapi (actinomycin-d, Ribavirin, 2- thiouracil) (Srivastava et al. 1999). Hal lain yang dilakukan adalah perlakuan seleksi kalus yang diberikan perlakuan penyinaran sinar Gamma seperti dilaporkan Mukerji et al. (1999) untuk ketahanan terhadap TMV. Untuk perlakuan mediasi menggunakan Agrobacterium, DNA transfer langsung, electroporation, microprojectil, juga menggunakan kultur jaringan pada tahapan penumbuhan kalus (Srivastava et al. 1999). Wattimena et al. (1992) menyatakan bahwa tanaman hasil kultur jaringan dapat dinyatakan bebas penyakit sistemik tertentu jika telah diidentifikasi dan telah dihilangkan dari tanaman. Hal ini dilakukan pada penyakit yang bersifat sistemik yang disebabkan oleh virus dan mikoplasma. Eliminasi patogen dapat dilakukan melalui termoterapi, kultur meristem, kombinasi keduanya, pembentukan tunas adventif dan teknik penyambungan mikro (Pierik 1987). Eliminasi dengan termoterapi dan kultur meristem paling umum dilakukan. Tanaman hasil perlakuan kemudian diuji telah terbebas dari virus dengan menggunakan tanaman indikator, serologi dan mikroskop elektron. Tanaman kultur jaringan yang bebas virus akan menjadi sumber bahan tanaman baik untuk keperluan penukaran plasma nutfah, pelestarian plasma nutfah, bahan perbanyakan dan bahan untuk pemuliaan. Purwito & Wattimena (1991) menggunakan kombinasi ribavirin dan kultur meristem untuk eliminasi virus pada tanaman kentang. Hasil yang diperoleh

7 15 menunjukkan konsentrasi ribavirin 30 mg/l cukup efektif mengeleminasi Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY), Potato leaf roll virus, Potato virus S, dan Potato virus M. Lopez-Delgado et al. (2004) mengkombinasikan perlakuan asam salisilat dan termoterapi untuk mengeliminasi PVX pada umbi mikro kentang. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa umbi mikro yang diberi perlakuan asam salisilat dengan konsentrasi 10-5 M dapat meningkatkan toleransi terhadap paparan pemanasan hingga 42 o C selama 30 hari. Toleransi ini menyebabkan dapat mengeliminasi PVX yang tidak tahan terhadap suhu tinggi. Paludan (1985) melaporkan bahwa perlakuan pendinginan (5 o C) pada titik tumbuh kultur meristem tanaman Chrysanthemum morifolium selama satu bulan dapat meningkatkan keberhasilan menghasilkan tanaman bebas dari Chrysanthemum chlorotic mottle viroid. Perlakuan pendinginan juga dilaporkan Lizarraga et al. (1980) pada kultur jaringan awal tanaman kentang dengan perlakuan 5 o C-15 o C dapat mengeliminasi Potato spindle tuber viroid. Beberapa Virus Tanaman yang Menginfeksi Anggrek Cucumber mosaic virus (CMV) Cucumber mosaic virus (CMV) pertama kali deskripsi secara rinci pada tahun 1916 pada tanaman mentimun dan Cucurbitaceae lainnya oleh Doolittle dan Jagger. Saat ini diketahui bahwa CMV menginfeksi banyak tanaman pertanian dan hortikultura di seluruh dunia pada iklim sedang maupun tropis. Perkembangan ketahanan genetik untuk CMV pada sayuran telah memberi kontribusi yang berharga bagi manajemen penyakit virus yang penting ini (Zitter & Murphy 2009). CMV dilaporkan mampu menginfeksi lebih dari 40 famili tanaman dikotil maupun monokotil (Gibbs & Harrison 1970 ). CMV merupakan anggota genus Cucumovirus famili Bromoviridae. Partikel CMV terdiri dari tiga partikel berbentuk bulat, masing-masing berukuran diameter sekitar 28 nm. Genom CMV terdiri dari tiga molekul RNA beruntai tunggal (ssrna), dengan berbagai ukuran (Tabel 2.3 dan Gambar 2.3). Setiap molekul RNA dienkapsisasi dalam CP dengan masing-masing menjadi satu partikel berbentuk bulat. Jadi CMV terdiri dari tiga partikel, satu partikel mengandung RNA 1, partikel yang lain mengandung RNA 2 dan yang ketiga mengandung RNA 3. Partikel RNA 3 dapat berisi untai RNA keempat, disebut sebagai RNA 4, yang mengkode gen CP. Jenis strategi translasi CMV disebut

8 16 sebagai RNA subgenomic, terdiri dari untai RNA yang dihasilkan terpisah selama replikasi (Zitter & Murphy 2009). Tanaman dapat mengaktivasi mekanisme ketahanan ketika CMV menginfeksi sehingga dapat menghambat pergerakan virus untuk menginvasi jaringan baru. Tipe ketahanan ini disebut sebagai gene silencing, namun protein CMV 2b mampu menghambat inisiasi sinyal gene silencing (silencing suppressor) pada tanaman di bagian jaringan yang jauh dari titik infeksi, sehingga memungkinkan CMV untuk terus menginvasi dan menginfeksi jaringan muda tanaman yang berkembang. Gen CP merupakan protein yang hanya berasosiasi dengan partikel virus dan merupakan satu-satunya penentu untuk transmisi oleh vektor kutu dan. Mutasi pada gen 1a, 2a dan 2b berpengaruh pada pergerakan virus dalam beberapa inang (Zitter & Murphy 2009). Tabel 2.1 Organisasi genom CMV Genom (Protein) Ukuran nukleotida (basa) Fungsi RNA1 (1a) Replikasi, methyltransferase, helikase RNA2 (2a, 2b) N-proksimal, replikasi, RNA-dependent RNA polimerase RNA3 (3a) Protein movement berperan dalam pergerakan virus dari sel ke sel ataupun dalam pembuluh tanaman RNA4 (CP) Protein selubung (CP) (Sumber: ICTVdB Management 2006b) RNA 1 1a RNA 2 2a 2b RNA 3 MP CP RNA 4 CP Gambar 2.1 Skema representasi organisasi genom CMV (Sumber: Zitter & Murphy 2009).

9 17 Beberapa strain CMV memiliki RNA satelit (RNA 5 atau satrna). satrna adalah molekul untai tunggal berukuran panjang sekitar nukleotida dan benar-benar tergantung pada CMV untuk replikasi. Selain itu, satrna dienkapsidasi dalam partikel CMV, yang memungkinkan menyebar dari satu tanaman ke tanaman bersama dengan CMV, oleh vektor kutudaun. satrna, tidak memberikan fungsi yang penting pada CMV (helper virus). Adanya CMV satrna kemungkinan tidak berpengaruh pada gejala atau dapat memperparah gejala klorosis atau nekrosis sistemik atau sebaliknya mungkin menyamarkan gejala (Zitter & Murphy 2009). Sejumlah strain CMV di seluruh dunia diklasifikasi ke dalam dua subgrup, I dan II, berdasarkan kriteria berbagai variasi gejala, serologi (Wahyuni et al. 1992; Hu et al. 1995; Ilardi et al. 1995), hibridisasi asam nukleat (Owens & Palukaitis 1988, Palukaitis et al. 1992), sekuen gen (Owens et al. 1990; Szilassy et al. 1999), dan restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Rizos et al. 1992; Sialer et al. 1999). Subgrup strain I dibagi lagi menjadi IA dan IB, berdasarkan perbedaan patogenisitas pada kacang tunggak (Vigna unguiculata). Strain IA menginduksi gejala-gejala mosaik sistemik dan strain IB menginduksi lesio lokal nekrotik pada daun yang diinokulasi. Selain berdasarkan gejala, CMV subgrup I sekarang ini dibagi menjadi IA dan IB berdasarkan sekuen gen CP strain CMV dan analisis filogenetik. Strain CMV Asia dikelompokkan dalam subgrup IB (Palukaitis & Zaitlin 1997; Roossinck et al. 1999; Roossinck 2002). Beberapa strain CMV yang spesifik inang, menginfeksi inang tertentu dalam famili yang sama seperti strain CMV legum. CMV secara serologi berhubungan dengan Tomato aspermy virus dan Peanut stunt virus (Zitter & Murphy 2009). Potyvirus Potyvirus adalah merupakan grup terbesar dari 34 grup virus tanaman dan famili saat ini diketahui (Ward & Shukla 1991). Genus ini terdiri dari setidaknya 180 anggota definitif (91 spesies resmi dan 89 spesies tentatif). Sebanyak 30% dari semua virus tanaman yang diketahui menyebabkan kerugian signifikan dalam bidang pertanian, tanaman pakan ternak, tanaman hortikultura dan tanaman hias (Ward & Shukla 1991; van Regenmortel et al. 2000). Partikel Potyvirus berbentuk filamen lentur, tanpa envelop berukuran panjang nm dan lebar nm. Material genetik Potyvirus berupa poliprotein tunggal, untai tunggal, utas positif dengan panjang 10 kb. Genom

10 18 RNA terdiri dari satu open reading frame (ORF) yang mengekspresikan satu poliprotein prekusor berukuran 350 kda. Prekursor poliprotein tersebut kemudian ditranslasi menjadi tujuh protein kecil yang memiliki berbagai fungsi, dinotasikan sebagai P1, helper component (HC), P3, cylindrical inclusion (CI), nuclear inclusion A (NIa), nuclear inclusion B (NIb), capsid protein (CP), serta dua protein putatif kecil yang dikenal sebagai 6K1 dan 6K2 (Shukla et al. 1994) (Tabel 2.4 dan Gambar 2.4). Pada bagian terminal 3 diakhiri dengan motif poly-a tail (Hari et al. 1979; Takahashi et al. 1997). Untuk menghasilkan protein utama, genom virus mengkode poliprotein dengan diproses oleh tiga proteinase virus. Dua proteinase diantaranya, P1 dan helper HC-Pro (Helper componen-proteinase) yang mengkatalisis reaksi autoproteolitik masing-masing hanya pada Terminal C (Carrington et al. 1989; Verchot et al. 1991). Satu proteinase lainnya reaksinya dikatalisis oleh NIA-Pro (nuclear inclusion protein) melalui mekanisme trans-proteolitik atau autoproteolitik (Carrington & Dougherty 1987). Tabel 2.2 Organisasi genom Potyvirus Protein Fungsi P1 HC-Pro P3 CI CP NIa-VPg NIa-Pro NIb 6K1 & 6K2 (Sumber: Winterhalter 2005). Proteinase;pergerakan antar sel. transmisi oleh kutudaun; Proteinase; pergerakan antar sel. Belum diketahui Replikasi genom (RNA helikase); membran pengikat; stimulasi asam nukleat aktivitas ATPase ; pergerakan antar sel. Encapsidasi RNA; berperan dalam transmisi oleh vektor; pergerakan antar sel. Replikasi genom (Primer untuk inisiasi sintesis RNA). Proteinase Replikasi genom (RNA-dependent RNA polimerase [RdRp]). Belum diketahui, namun diduga berperan pada: Replikasi RNA, pengatur untuk penghambatan translokasi nuclear NIa, membran pengikat proses replikasi. 33kDA 32kDA 41kDA 6kDA 71kDA 6kDA 22kDA 27kDA 59kDA 31kDA P1 HC-Pro P3 CI NIa NIb VPg Pro NIb CP 6k1 6k2 Gambar 2.2 Skema representasi organisasi genom Potyvirus (Sumber: Winterhalter 2005)

11 19 Tospovirus Virus dalam genus Tospovirus menyebabkan kerugian yang signifikan pada pertanian di seluruh dunia. Nama genus ini berasal dari nama anggota pertama yaitu Tomato spotted wilt virus (TSWV). Awal infeksi virus ini terjadi pada penyakit layu tanaman tomat di Australia pada tahun 1915, kemudian dibuktikan dengan identifikasi penyebabnya adalah TSWV. TSWV awalnya dianggap sebagai satu-satunya anggota kelompok TSWV sampai awal 1990-an. Namun saat ini berdasarkan identifikasi dan karakterisasi beberapa virus, ternyata beberapa jenis virus lain mirip TSWV sehingga digolongkan dalam genus Tospovirus bagian dari famili Bunyaviridae. Lebih dari 12 jenis virus yang masuk dalam genus ini seperti Impatiens necrotic spot virus (INSV), Peanut bud necrosis virus (PBNV), Groundnut ringspot virus (GRV), Watermelon silver mottle virus (WSMV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) dan Iris yellow spot virus (IYSV) (Adkins et al. 2005; Baker et al. 2007). TSWV memiliki kisaran inang yang besar (800 spesies tanaman) dan sebagian besar penyakit yang disebabkan virus ini ditemukan pada tanaman di lapangan. INSV memiliki kisaran inang yang lebih kecil dan sebagian besar virus yang ditemukan menginfeksi tanaman hias di rumah kaca (Baker et al. 2007). Kedua virus telah dilaporkan menginfeksi tanaman anggrek sejak awal 1990-an (Hu et al. 1993, Koike & Mayhew 2001). Di antara virus tanaman, Tospovirus memiliki morfologi partikel, organisasi genom dan strategi ekspresi yang unik. Partikel virus berbentuk pleomorfik berukuran nm dan memiliki envelop pada permukaan yang terdiri dari lipid dan dua glikoprotein. Genom Tospovirus terdiri atas tiga ssrna negatif sense utas tunggal RNA. Setiap genom RNA dienkapsidasi oleh banyak salinan protein nukleokapsid virus untuk membentuk struktur ribonucleoprotein juga dikenal sebagai nukleokapsid (Adkins et al. 2005; Hull 2002) Anggrek Phalaenopsis yang bergejala infeksi virus seperti klorosis bercak cincin telah diamati dan berhasil diisolasi di Taiwan pada tahun 1998 (Chen et al. 1998). Virus yang telah diisolasi tersebut, ketika diinokulasi kembali ke jenis anggrek yang sama tidak berhasil menimbulkan gejala dan perunutan gen nukleokapsid untuk taksonomi virus belum dilakukan pada saat itu. Patogen penyebab penyakit pada anggrek ini belum jelas sehingga saat itu dideskripsikan sebagai virus Taiwan. Hasil penelitian yang dilakukan Zheng et al. (2008) berdasarkan isolasi, inokulasi kembali, serologi dan karakterisasi molekuler, virus

12 20 yang menyebabkan klorosis bercak cincin pada Phalaenopsis anggrek di Taiwan ini berhasil diidentifikasi penyebabnya adalah Tospovirus. Cymbidium Mosaic Potexirus (CymMV) CymMV saat ini oleh sebagian ahli dimasukkan dalam Famili Flexyvirideae dan sebagian ahli menyatakan tidak mempunyai famili yang tepat, sehingga langsung tergolong dalam genus Potexvirus (Adams et al. 2004; Fauquet & Mayo 1999). Partikel Potexvirus berbentuk filamen lentur dengan ukuran panjang nm dan diameter 13 nm. Partikel virus ini mengandung linear, positive-sense, single stranded (ss)-rna dengan ukuran 5,9-7,0 kb, dibungkus oleh banyak subunit coat protein (CP) berukuran kda. RNA diakhiri dengan polyadenilasi pada terminal 3. Genom dari beberapa anggota genus ini telah berhasil disekuen dan memperlihatkan adanya 5 open reading frame (ORF). Beberapa diantaranya memiliki ORF keenam yang kecil yang melengkapi ORF kelima, namum fungsi dari protein yang dikode oleh ORF ini belum diketahui seperti pada Cassava common mosaic virus (CsCMV), Narcissus mosaic virus (NMV), Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), dan White clover mosaic virus (WClMV) (Hull 2002). Saat ini sudah 11 spesies dari genus Potexvirus, termasuk CymMV, telah berhasil disekuen secara lengkap seperti NMV, PVX, WClMV, Bamboo mosaic virus (BaMV), Clover yellow mosaic virus (ClYMV), Foxtail mosaic virus (FoMV), Potato acuba mosaic virus (PAMV), Papaya mosaic virus (PapMV), Plantago asiatica mosaic virus (PlAMV) dan Strawberry mild yellow edge virus (SMYEaV) (Wong et al. 1997). CymMV termasuk ke dalam kelompok Potexvirus dengan partikel berbentuk memanjang lentur dengan ukuran panjang ± nm (Frowd & Tremaine 1977; Steinhart & Oshiro 1990). Genom CymMV berukuran kira-kira 6-7 kb (Srifah et al 1996). Protein CP terdiri atas 257 asam amino dengan berat molekul dalton, dengan perbandingan komposisi basa (G, A, C dan U) RNA virus yaitu 21,1 : 28,9 : 24,4 : 25,6 (Frowd & Tremaine 1977). Seperti halnya kelompok utas positif RNA monopartit, ORF yang mengkode CP berada pada terminal 3 (Chia et al. 1992). Sinyal polyadenylasi bermotif AATAAA ditemukan pada terminal 3 -UTR (Ryu et al. 1995). Organisasi genom CymMV terdiri dari 5 ORF dengan berbagai fungsi (Tabel 2.1 dan Gambar 2.1)

13 21 Tabel 2.3 Organisasi genom CymMV Genom (Protein) Ukuran protein (kda) Posisi nukleotida Fungsi gp Pengkode untuk produksi RNA polimerase, Methyltransferase, helikase gp RNA helikase gp Pergerakan antar sel dan pergerakan melalui pembuluh tanaman gp Protein selubung (CP) gp Protein selubung (CP) (Sumber: Wong et al. 1997; ICTVdB Management 2006a) gp1 gp3 gp5 5 3 Poly A gp2 gp RdRp TGB CP Gambar 2.3 Skema representasi organisasi genom CymMV. Terminal 5 dan 3 noncoding region terletak pada bagian ujung. Angka-angka menunjukkan posisi awal dan akhir urutan genom (ICTVdB Management 2006a). Gejala infeksi virus ini pada helaian daun muda dicirikan berupa adanya area klorotik yang tersamar. Kemudian bercak kecil tersebut membesar dan berubah menjadi bercak mosaik hijau cerah. Kontras antara area bercak cerah dan gelap menjadi lebih nyata ketika daun menjadi tua dan gejala menjadi lebih menyolok. Bercak nekrosis ditemukan pada daun kultivar tertentu, gejala pada bunga jarang terjadi tetapi ditemukan pada beberapa kultivar berupa bercak nekrosis coklat pada kultivar Cymbidium hibrida. Odontoglossum ringspot virus (ORSV) ORSV pertama kali diisolasi dan dikarakterisasi dari spesies anggrek Odontoglossum grande yang memperlihatkan gejala bercak cincin (ringspot) pada daun. Virus ini juga menyebabkan gejala belang (mottle) berbentuk berlian, mosaik dan warna bunga pecah pada Cymbidium serta gejala warna bunga pecah pada Cattleya (Jensen & Gold, 1951). Warna bunga pecah (color break) pada anggrek juga dilaporkan terjadi pada jenis Odontoglossum, Cymbidium, Vanilla, Epidendrum, Encyclia, Oncidium, Phalaenopsis dan beberapa genus

14 22 anggrek lainnya. Warna pecah dapat terjadi bila disebabkan infeksi dua strain virus berbeda, yang lemah dan ganas. Pecah warna dikarakterisasi dengan variasi warna pada bunga, warna normal pada petal dan sepal diselingi oleh bagian warna yang lebih terang atau redup tidak beraturan (Burnett 1965). ORSV dapat menyebabkan nekrosis coklat bergaris dan malformasi serta distorsi pada rangkaian bunga Cattleya (Afieri et al. 1991; McMillan & Vendrame 2005). ORSV diketahui dapat menginfeksi pada 31 genus anggrek lainnya (Chen et al. 2006). ORSV merupakan anggota genus Tobamovirus famili Virgaviridae. Anggota Tobamovirus lainnya yaitu Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), Cucumber virus 4 (CV4), Frangipani virus (FV), Ribgrass mosaic virus (HRV), Sammons' opuntia virus (SOV), Sunn-hemp mosaic virus (SHMV), Tobacco mosaic virus (TMV) dan Tomato mosaic virus (ToMV) (Sammons & Chessin 1961; Siegel & Wildman 1954). Partikel ORSV berbentuk batang kaku memanjang, tidak diselubungi envelop, terdiri atas molekul ssrna berukuran 6 kb. Ukuran partikel virus ini 300 nm x 18 nm, sama seperti TMV (Paul 1975). Organisasi genom ORSV terdiri dari nt dengan 5 ORF (Tabel 2.2 dan Gambar 2.2). ORSV dapat dibedakan dari TMV dan Tobamovirus lainnya berdasarkan kisaran inang, serologi dan urutan nukleotida pada daerah terminal 3' (Ikegami & Inouye 1996). Uji proteksi silang pada tanaman tomat dengan strain TMV lemah menunjukkan pengurangan suseptibilitas tanaman terhadap strain virulen TMV lainnya, hal ini diduga berhubungan dengan terjadinya mutasi pada coat protein (Zaitlin 1976). Tabel 2.4 Organisasi genom ORSV Genom (Protein) Ukuran protein (kda) Posisi nukleotida Fungsi gp Methyltransferase, RNA helikase, RdRP- 2 (RNA dependent RNA polimerase) gp RNA replikase gp Belum diketahui gp pergerakan virus antar sel dan dalam pembuluh tanaman gp Protein selubung (CP) (Sumber: ICTVdB Management 2006b)

15 gp 1 gp4 3 1 gp2 Gp gp5 70 Subunit replikasi kecil Subunit replikasi besar 3 5 Subgenomic RNA 5 3 Gambar 2.4 Skema representasi organisasi genom ORSV (Sumber: ICTVdB Management 2006b). Induksi Ketahanan Secara Sistemik Induksi ketahanan secara sistemik dengan agen penginduksinya patogen atau bahan kimia (systemic acquired resistance/sar) merupakan metode yang telah lama dikembangkan untuk menghasilkan tanaman yang lebih tahan terhadap penyakit. Induksi ketahanan atau imunisasi atau ketahanan buatan adalah suatu proses stimulasi ketahanan tanaman inang tanpa introduksi gengen baru. Induksi ketahanan menyebabkan kondisi fisiologis yang mengatur sistem ketahanan menjadi aktif dan atau menstimulasi mekanisme ketahanan alami yang dimiliki oleh inang. Imunisasi tidak menghambat pertumbuhan tanaman, tetapi dapat meningkatkan hasil pada beberapa tanaman meskipun tanpa adanya patogen dan memberikan suatu cara bertahan terhadap tekanan lingkungan (Stomberg 1994; Tuzun & Kuc 1991). Perlakuan dengan agen penginduksi dapat mengaktifkan secara cepat berbagai mekanisme ketahanan tanaman. Diantaranya akumulasi fitoaleksin dan peningkatan aktivias enzim kitinase, β-1,3-glukanase, dan β -1,4-glukosidase. Salah satu senyawa fenol yang sangat sederhana, 2-hydroxybenzoic acid atau asam salisilat, telah diketahui berperan penting sebagai molekul sinyal dari beberapa respon ketahanan tanaman (Smith-Becker et al. 1998). Asam salisilat ditemukan secara tidak sengaja untuk pertama kali oleh White pada tahun 1979 yang mengamati aspirin (acetylsalicylic acid) yang dapat menginduksi ketahanan pada tembakau (Sticher et al. 1997). Dari semua derivat asam benzoat yang terhidroksilasi, hanya asam salisilat dan 2-dihidroxybenzoic acid yang aktif sebagai agen penginduksi. Ekspresi SAR sangat tergantung dari

16 24 adanya akumulasi asam salisilat dan berasosiasi dengan pathogenesis-related protein (PR protein) yang mempunyai aktivitas sebagai anti patogen (van Loon 2000). Asam salisilat adalah komponen yang dibutuhkan dalam jalur sinyal transduksi untuk induksi SAR sebagai bentuk peningkatan ketahanan tanaman melawan patogen berspektrum luas. Invasi oleh mikroorganisme menyebabkan gen penghasil ketahanan terinduksi untuk mensintesis asam salisilat dan mengaktifkan SAR. Seringkali pengenalan ini disertai oleh respon hipersensitif; suatu bentuk kematian sel inang secara cepat pada bagian sekitar titik masuk patogen. Ketahanan terinduksi pertama kali diteliti secara sistematik oleh Ros pada tahun 1961, yang melakukan pengamatan terhadap tembakau yang terinfeksi TMV. Pengamatan dilakukan terhadap gejala yang ditimbulkan, yakni terjadi reaksi hipersensitif yang tidak terbatas pada sekitar bercak lokal nekrosis tetapi meluas pada bagian tanaman lainnya. Jaringan di sekitar perkembangan bercak sepenuhnya sukar ditembus oleh infeksi berikutnya. Asam salisilat diduga memegang peran dalam sinyal SAR dan ketahanan terhadap patogen. Hal ini terbukti dari adanya peningkatan konsentrasi asam salisilat yang dijumpai pada ratusan tembakau atau mentimun setelah diinfeksi patogen (Huang 2001). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa terdapat korelasi antara konsentrasi asam salisilat dengan peningkatan ketahanan tanaman terhadap penyakit. Salah satu bukti terhadap hal tersebut adalah dengan menginduksi tanaman Arabidopsis thaliana dan tembakau dengan cara transfer gen bakteri Pseoudomonas putida penghasil gen NahG yang mengkode enzim salisilat hidroksilase. NahG yang diketahui sebagai katalisator perubahan asam salisilat menjadi komponen inaktif yang dikenal sebagai Catechol. Berdasarkan hasil percobaan tersebut tanaman yang disisipkan gen NahG dan diinfeksi patogen tidak mengakumulasi asam salisilat, juga tidak mampu meningkatkan respon SAR tarhadap patogen. Hal ini menunjukkan bahwa untuk induksi SAR diperlukan konsentrasi asam salisilat yang tinggi (Delaney 1997). Aplikasi asam salisilat secara eksogen pada konsentrasi 1-5 mm sejauh ini diketahui menginduksi ekpresi gen Pathogen Related (PR) dan ketahanan melawan berbagai patogen mikroba (Xie & Chen 1998). Dua senyawa yang tergolong asam salisilat eksogen yang sudah dikenal yaitu INA (2,6- dichloroisonicotinic acid) dan BTH (benzo(1,2,3)thiodiazole-7-carbothioic acid S- methyl ester) (Friedrich et al. 1996; Sticher et al. 1997).

17 25 Strategi pengendalian dengan mediasi CP membutuhkan tahapan awal kultur jaringan untuk penumbuhan kalus maupun tahapan multiplikasi kalus. Kultur jaringan juga sekaligus digunakan dalam tahapan seleksi in vitro hasil transformasi gen CP untuk mengetahui keberhasilan insersi gen. Seleksi pada tahap in vitro dapat mengurangi biaya dan waktu seleksi yang lama dibandingkan seleksi di lapangan. Seleksi in vitro telah dilakukan pada semua kalus/plantlet hasil transformasi gen. Metode ini didasari pada pemikiran bahwa kultur sel tanaman menyediakan suatu populasi ideal materi genetik yang homogen. Satu botolan kultur suspensi sel embriogenik secara teoritis menghasilkan jutaan tanaman yang dapat secara efektif diseleksi. Seleksi in vitro untuk ketahanan penyakit pertama kali dicobakan untuk tanaman tembakau tahan terhadap wildfire menggunakan methionine sulfoximine yang memiliki struktur analog dengan toksin wildfire (Jayasankar & Gray 2003). Komponen utama yang berperan dalam SAR Sinyal transduksi SAR berfungsi sebagai modulator mekanisme ketahanan penyakit. Pada saat SAR aktif, terjadi interaksi patogen dengan inang secara kompatibel, sebaliknya pada saat SAR inaktif interaksi inkompatibel bisa menjadi interaksi yang kompatibel. Mekanisme bagaimana modulasi ini terjadi masih belum diketahui. Namun sedikitnya sebagian dari respon ketahanan yang dimiliki tanaman dapat diekspresikan oleh gen SAR. Ada dua komponen utama yang berperan dalam mekanisme SAR, yaitu gen penanda molekuler SAR dan asam salisilat. Meskipun kajian tentang SAR telah dilakukan selama hampir 100 tahun, namun demikian informasi tentang SAR kurang terungkap bagaimana secara kuantitatif respon SAR dianalisa. Untuk itu sangat penting dilakukan studi tentang identifikasi dan isolasi senyawasenyawa yang terlibat dalam SAR, yang dapat digunakan sebagai penanda spesifik SAR. Penanda tersebut kemudian disebut sebagai gen SAR, dan telah diidentifikasi sebagai penginduksi yang erat hubungannya dengan awal terjadinya SAR pada daun yang tidak terinfeksi. Hasil analisa terhadap protein (disebut sebagai protein SAR) diklasifikasikan sebagai PR protein, berhasil diidentifikasi dari akumulasi protein yang terjadi setelah infeksi TMV pada tembakau. Sedikitnya terdapat 9-14 jenis protein SAR. Protein penanda ini sangat bervariasi jenisnya, tergantung dari dan jumlah patogen serta spesies tanaman. Karena gen-gen SAR dengan kuat

18 26 diekspresikan pada saat ketahanan tanaman secara sistemik, dimana pengkodean protein oleh gen-gen tersebut berperan, maka dapat dikatakan bahwa protein yang dikode oleh gen-gen SAR selalu berasosiasi dengan ketahanan penyakit. Komponen kedua yang bertanggung jawab terhadap kejadian SAR adalah asam salisilat. Senyawa ini untuk pertama kali diidentifikasi sebagai komponen penginduksi secara endogen dari produksi panas yang dihasilkan oleh sejumlah tanaman yang menyukai kondisi panas (thermogenic plants). Senyawa ini merupakan senyawa metabolit sekunder yang berupa bubuk kristal dengan titik cair o C, dapat larut dalam air dan pelarut organik lainnya, dengan ph sekitar 2,4 dan dapat dengan mudah dideteksi pada tanaman, karena menghasilkan flouresensi pada panjang gelombang 412 nm (Raskin 1992). Biosintesa Asam Salisilat Untuk mengetahui pentingnya peran asam salisilat dalam ketahanan penyakit, maka perlu dipelajari juga bagaimana alur biosintesa dari komponen tersebut yang mungkin dapat mengungkapkan faktor pengendali utama dari respon ketahanan tanaman. Biosintesa asam salisilat diawali dari perubahan phenylalanin ke trans cinnamic acid (asam sinamat) yang dikatalisa oleh enzim phenylalanine ammonialyase (PAL). Ada jalur biosintesa diusulkan untuk konversi asam sinamat, hasil dari PAL membentuk benzoic acid sebelum menjadi asam salisilat. Jalur pertama yaitu rantai samping dari asam sinamat diduga dioksidasi sesaat dengan β-oksidasi dari asam lemak dan diikuti oleh hidrolisis thioester. Rute ini akan menghasilkan trans-cinnamoyl-coa sebagai senyawa intermediet, kemudian reaksi berlanjut membentuk benzoyl CoA hingga akhirnya terhidrolisis menjadi benzoic acid. Jalur kedua yaitu rantai sisi asam sinamat diperpendek secara non-oksidatif untuk membentuk asam p- hydroxybenzoat, kemudian menghasilkan benzaldehide dan akhirnya terbentuk benzoic acid. Benzoic acid dari kedua jalur tersebut kemudian berubah menjadi menjadi asam salisilat yang dikatalisis oleh enzim benzoic acid 2-hidroksilase (Gambar 2.5) (Ribnicky et al. 1998; Leon et al. 1993; Lee et al. 1995). Beberapa penelitian lain menunjukkan bahwa asam salisilat disintesis melalui jalur acetat-malonat dan jalur Sikimat-phenyl propanoid (Vickery & Vickery 1981; Sticher et al. 1997). Phenylalanine dikonversi menjadi asam sinamat yang mungkin ditransformasi menjadi asam koumarik atau asam

19 27 benzoat. Kedua senyawa ini adalah prekusor dari asam salisilat, tergantung spesies tanaman, jaringan tanaman, atau kondisi lingkungan (Sticher et al. 1997). Namun demikian biosintesa asam salisilat hingga kini secara pasti belum digambarkan dengan lengkap karena beberapa siklus masih belum diketahui. Akumulasi asam salisilat sangat diperlukan dalam mediasi SAR. Menurut penelitian Smith-Becker et al. (1998), akumulasi asam salisilat ternyata mampu meningkatkan aktivitas enzim PAL pada bagian batang dan petiol tanaman mentimun. Beberapa laporan menyebutkan bahwa PAL merupakan enzim kunci dalam sintesa asam salisilat dan SAR. Gambar 2.5 Biosintesis asam salisilat pada tanaman (Sumber: Ribnicky et al. 1998).

20 28 Mekanisme Induksi Ketahanan dengan Asam Salisilat Proses translokasi sinyal ketahanan Tanaman yang memiliki ketahanan terhadap infeksi patogen umumnya di kenali dengan adanya reaksi hipersensitif pada bagian daun yang diinokulasi. Gejala hipersensitif ditandai oleh terbentuknya gejala lesio lokal di daerah infeksi. Gejala ini terbentuk karena tanaman segera mengaktifkan program cell death agar virus terlokalisir di sekitar sel yang terinfeksi dan tidak terjadi cell-to-cell movement ataupun long distance movement. Proses ini dimulai dari pengenalan inang terhadap virus karena adanya gen avr pada patogen dan gen R pada inang. Kemudian melalui serangkaian proses terbentuk pertahanan yang melibatkan gen ketahanan (Morel & Dangi 1997). Proses pengaktifan gen ketahanan ini melibatkan asam salisilat. Asam salisilat yang terbentuk tidak hanya berpengaruh di sekitar area infeksi namun juga ditranslokasikan bagian lain tanaman. Adanya asam salisilat yang berhasil diisolasi pada floem mentimun enam jam setelah diinokulasi P.syringae telah dibuktikan melalui percobaan tentang transportasi asam salisilat pada mentimun yang diinokulasi Tobacco nekrosis virus (TNV) (Molders et al. 1996). Bukti kedua adalah tembakau NahG yang telah diinokulasi TMV menunjukkan akumulasi asam salisilat dalam jumlah sedikit di floem jika disambungkan dengan tembakau liar (Ryals 1996). Transduksi sinyal SAR Untuk mengetahui tahapan yang terjadi dalam alur transduksi sinyal SAR dan pola hubungan patogen dengan inang, telah diteliti pada tanaman model A. thaliana. Tanaman ini mempunyai sistem untuk analisa gen mutan dan isolasi gen yang baik. Skema hipotesis alur transduksi sinyal menurut Ryals et al. (1996), bahwa respon ketahanan terjadi melalui beberapa tahapan. Hal ini dibuktikan dengan beberapa percobaan untuk menghambat alur sinyal pada situs-situs tertentu misalnya pada tanaman transgenik yang menghasilkan NahG menyebabkan tidak terakumulasinya asam salisilat. Percobaan lain yaitu pada tanaman mutan yang disisipkan gen nim1 (non inducible immunity1), npr1 (non expressor of PR1), ndr1 (non race specific disease resistance1) juga menyebabkan terhambatnya akumulasi asam salisilat. Skema alur transduksi tersebut juga menunjukkan adanya stimulus oleh komponen bahan kimia yang diberikan

21 29 secara eksogen (BTH/benzo (1,2,3) thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester atau INA/2,6-dichloroisonicotinic acid) dan beberapa mutasi yang membuat sistem pertahanan tanaman menjadi lebih kuat. Alur tersebut pada awalnya dipicu oleh adanya interaksi antara patogen dan tanaman yang dapat menginduksi gejala nekrosis yang mengaktifkan ketahanan secara lokal dan ketahanan sistemik. Rangkaian reaksi tersebut melibatkan asam salisilat endogen dan dibuktikan dapat dihambat pada tanaman mutan NahG yang menyebabkan tidak terakumulasinya asam salisilat karena terbentuknya salisilat hidroksilase. Pada tanaman mutan NahG dan tanaman mutan lsd1 (lesions simulating disease) dan lsd6 dapat membentuk lesio setelah diberikan senyawa asam salisilat eksogen (INA dan BTH) yang mengaktifkan SAR. Meskipun telah diketahui bahwa alur transduksi sinyal dari SAR merupakan pusat dari ketahanan tanaman terhadap penyakit, namun masih banyak yang belum terjawab, seperti misalnya identitas dari sinyal yang ditranslokasikan, bagaimana asam salisilat dapat disintesa setelah terjadi infeksi patogen, serta bagian apo-reseptor tanaman untuk mengenali asam salisilat. Alur transduksi sinyal menurut Delaney (1997) diaktivasi oleh adanya patogen yang direspon oleh inang melaui gen R yang berinteraksi dengan gen Avr patogen (Gambar 2.6). Proses alur tersebut terdiri dari tahapan: A. Sinyal-sinyal tersebut terkumpul pada suatu tempat pada tanaman yang disebut intregator (INT), yang berfungsi sebagai reaksi pertahanan adanya sinyal-sinyal yang masuk ke tanaman, untuk selanjutnya memberi reaksi hipersensitif yang mungkin dibutuhkan atau tidak untuk proses sinyal SAR. B. SAR teraktivasi dengan adanya akumulasi asam salisilat yang membutuhkan produk gen NIM1/NPR1, menimbulkan induksi gen PR. C. Beberapa bentuk ketahanan dihasilkan. Asam salisilat juga berperan penting dalam pertahanan tanaman di luar yang dihasilkan oleh NIMI. D. Berfungsinya sinyal oleh NIMI akan menyebabkan tanaman dengan cepat bereaksi dan memainkan peranannya dalam gene-for-gene resistance. Peran tersebut bisa bersifat rapid activation/cepat (berperan dalam ketahanan genetik), therapeutic (berperan dalam recovery/sembuh kembali, dan persisten (berperan dalam ketahanan berspektrum luas/sar).

22 30 A B C D Peran : Sinyal Interaksi Gen R:AVR Mekanisme pertahanan lain INT HR HR SA Respon SA lain NIM1/ NPR1 Gen PR Reaksi Ketahanan Aktivasi cepat Therapeutic Persisten Ketahanan Genetik Penyembuhan dari penyakit Ketahanan spektrum luas (SAR) Gambar 2.6 Alur transduksi signal yang mengatur terjadinya ketahanan (Sumber : Delaney 1997) Kedua alur transduksi sinyal menurut Ryals et al. (1996) dan Delaney (1997) tersebut menunjukkan substansi yang sama bahwa mekanisme SAR akan terjadi melalui tiga fase yaitu: - Fase pertama: Fase induksi. Induksi dapat terjadi oleh adanya infeksi patogen atau faktor abiotik (bahan kimia), yang menyebabkan respon nekrosis yang terjadi terus menerus. Respon ini kemungkinan bisa berasosiasi dengan respon lokal lainnya seperti reaksi hifersensitif, pembentukan papilla, dll. - Fase kedua: Fase sinyal. Bersifat sistemik, ditranslokasikan melalui floem, bisa dipindahkan melalui grafting/penyambungan, berspektrum luas(tidak spesifik kultivar, spesies, genus). - Fase ketiga: Fase Ekspresi. Fase ini hanya akan terjadi jika terjadi infeksi berikutnya setelah infeksi awal, jika ini tidak ada, maka hanya terjadi mobilisasi tanpa diikuti ekspresi gen. Ekspresi gen ini dapat berupa bentuk ketahanan tanaman, bisa berupa ketahanan fisik/struktural, kimia, maupun genetik. Mekanisme induksi SAR oleh Asam Salisilat Asam salisilat sering diujicobakan dengan cara penyemprotan sebanyak 5 mm untuk mempelajari induksi dan penghambatan pertumbuhan karena SAR, penguningan daun dan nekrosis tepi yang biasanya terjadi pada tanaman yang sensitif, seperti Arabidopsis. Pengaruh asam salisilat untuk menginduksi ketahanan tanaman tidak akan sistemik jika disemprotkan atau diinjeksikan ke daun, tetapi efek sistemik dari asam salisilat baru akan tampak jika diaplikasikan ke tanah. Pada penelitian selanjutnya diketahui bahwa kalau asam salisilat diinjeksikan ke daun akan tersimpan di vakuola sel sebagai glukosa, dan jika diaplikasikan ke tanah akan diserap oleh akar dan ditransportasikan keseluruh tanaman (van Loon 2000).

23 31 Adapun mekanisme bagaimana asam salisilat dapat menginduksi SAR belum diketahui dengan pasti, namun ada beberapa hipotesis yang telah dikemukakan oleh beberapa ahli yaitu: 1. Hidrogen peroksida (H ) berperan sebagai second messanger dari asam salisilat dalam pensinyalan SAR. Hal ini diketahui adanya asam salisilat binding protein, yang diidentifikasi sebagai katalase, ternyata mampu dihambat aktivitasnya oleh asam salisilat, yang diawali dengan konsentrasi H yang meningkat. 2. H bertindak sebagai agen sinyal dari asam salisilat. Hal ini dibuktikan dengan adanya peningkatan konsentrasi H pada bagian daun tembakau yang tidak diinfeksi selama aktivasi SAR. Sesungguhnya senyawa peroksida tersebut dimiliki oleh hampir semua tanaman tingkat tinggi yang merupakan hasil detoksifikasi tanaman terhadap oksigen reaktif yang berbahaya. Adapun reaksi penghasil senyawa peroksida tersebut adalah sebagai berikut (Huang 2001): Superoksida dismutase 2O H+ H 2 O 2 + O 2 Peroksidase H 2 O 2 + AH 2 2H 2 O + A Katalase H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 Pengertian senyawa second messanger menurut Huang (2001) merupakan senyawa metabolit yang memediasi pemindahan sinyal secara intraseluler. Beberapa kriteria yang harus dimiliki oleh metabolit untuk dapat bertindak sebagai second messanger ada tiga yaitu, (1) senyawa tersebut ada dalam sel tanaman pada konsentrasi yang mampu mengelisitor respon fisiologi tanaman, (2) sel tanaman mempunyai mekanisme untuk menanggapi keberadaan senyawa tersebut untuk kemudian ditranslasi menjadi respon fisiologi tanaman, serta (3) adanya mekanisme pemblokiran untuk mencegah timbulnya respon fisiologi lebih lanjut. Akumulasi asam salisilat berhubungan erat dengan enzim yang merombak prekusor phenylalanine yaitu enzim phenylalanine ammonialyase (PAL). Pola aktivitas PAL diinduksi di petiol dan batang menunjukkan bahwa jaringan tersebut merespon pergerakan sinyal yang berasal dari daun yang diinokulasi. Peningkatan aktifitas PAL diduga karena peningkatan ekspresi gen

24 32 untuk enzim dan/atau meningkatnya tingkat penurunan produk asam transsinamat (Smith-Becker et al. 1998). Asam sinamat merupakan suatu inhibitor kuat kegiatan PAL yang bertindak untuk mempercepat berkurangnya enzim dan untuk menghambat de novo produksi enzim (Shields et al. 1982). Salah satu kemungkinan adalah bahwa sinyal awal dari daun yang diinokulasi mengarah untuk aktivasi enzim atau kelompok enzim precursor PAL yang mengkonversi asam sinamat menjadi asam salisilat (Leon et al. 1993).

25 33 DAFTAR PUSTAKA Adams MJ, Antoniw JF, Bar-Joseph M, Brunt AA, Candresse T, Foster GD, Martelli GP, Milne RG, Zavriev SK, Fauquet CM The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Arch Virol 149: Adkins S, Zitter T, Momo T Tospoviruses (Family Bunyaviridae, Genus Tospovirus). Florida: Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida Afieri Jr. SA, Langdon KK, Kimbrough JW, El-Ghol NE, Wehlburg C Diseases and disorders of plants in Florida. Bul FDACS DPI No. 14. Arditti J Orchid Biology. Reviews and Perspectives III. Ithaca: Cornell University Press. Arditti J, Ernst R Micropropagation of Orchids. New York: Departement of Developmental and Cell Biology University of California. Ashari S Hortikultura Aspek Budidaya. Jakarta: UI Press. Baker C, Davidson D, Scoates C White Phalaenopsis ringspots mystery solved. Plant Pathol Circ No Burnett HC Orchid Diseases. Vol 1 No. 3. Florida: State of Florida Dept. Of Agronomi. Carrington JC, Dougherty WG Small nuclear inclusion protein encoded by a plant Potyvirus genome is a protease. J of Virol 61: Carrington JC, Freed DD, Sanders TC Autocatalytic processing of the Potyvirus helper component proteinase in Escherichia coli and in vitro. J of Virol 63: Chan CI, Lamb A, Shim PS, Wood JJ Orchid of Borneo. Introduction and Selection of Spesies. London: The Sabah Society Kota Kinabalu in Association with The Royal Botanical Garden Kew. Chang CA Orchid virus diseases in Taiwan and their control strategies. The 2010 Taiwan International Orchid Show and Symposium. Taiwan, 6-15 Maret 2010, Taiwan: International Commercial Orchid Growers Organization. Hal Chang C, Chen YC, Hsu YH, Wu JT, Hu CC, Chang WC, Lin NS Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobium expressing the viral capsid protein gene. Transgenic Res 14: Chen TC, Hsu HT, Yeh SD A new Tospovirus like virus isolated from orchid. [Abstrak] Di dalam: The 4th International Symposium on Tospoviruses and Thrips in Floral and Vegetable Crops, Netherlands. Chen L, Kawai H, Oku T, Takahashi C, Niimi Y Introduction of Odontoglossum ringspot virus coat protein gene into Cymbidium niveomarginatum mediated by Agrobacterium tumefaciens to produce transgenic plants. J Japan Soc Hort Sci 75 (3):