BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Bahan dan Alat

Transkripsi

1 30 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2009 sampai dengan Mei 2010, bertempat di Laboratorium Kimia Hasil Hutan Fakultas Kehutanan IPB, Laboratorium Rekayasa Bioproses, Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB, Laboratorium Afiliasi, Departemen Kimia FMIPA, Universitas Indonesia dan Laboratorium Instrumen dan Proksimat Terpadu Pusat Penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan Bogor. Bahan dan Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah parang, hammer mill, saringan 40 dan 60 mesh, penangas air, stirrer, gelas piala 400 ml, Erlenmeyer 250 ml, filter, pengaduk kaca, glass filter, timbangan, oven, gelas piala 200 ml, thermometer, thimble ekstraksi, sohklet, kondensor, corong buchner, glass filter, filtering flask, Erlenmeyer 1000 ml, gelas piala 100 ml, gelas piala 50 ml, pipet volume, Erlenmeyer 300 ml, tank stainless steel, digester, mixer, lampu spirtus, ruang laminar, inkubator, bulb, sprayer, autoklaf, sentrifuse, ph meter, toples, gelas kimia, labu ukur, pengaduk, labu semprot, pipet skala, pipet mikron, labu isap, corong, alat fermentasi, ose, tabung reaksi, sprayer, buret, hot plate, timbangan digital, botol Schott, alat fermentasi, X ray difraction merk Shimadzu, Spektrofotometer, dan GC (Gas Chromatography). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk dari beberapa kayu tropis yaitu dua jenis kayu daun lebar yaitu kayu sengon (Paraserianthes falcataria (L) Nielsen.) dan gmelina (Gmelina arborea Roxb.), satu jenis kayu daun jarum yaitu pinus (Pinus merkusii Jung. et de Vr.) serta satu jenis tumbuhan monokotil yaitu kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq.), bahan-bahan kimia seperti NaOH, Na 2 S, asam asetat (CH 3 COOH) 10%, etanol (C 2 C 5 OH), benzena (C 6 H 6 ), asam sulfat (H 2 SO 4 ), natrium klorit (NaClO 2, asam asetat glasial, asam nintrat (HNO 3 ) 3.5%, Na 2 SO 3. Isolat yang digunakan adalah kapang Aspergillus niger dan khamir Saccharomyces cereviceae serta enzim selulase komersial produksi

2 31 Sigma Aldrich, Japan (0,83 U/mg). Bahan lain adalah foil aluminium, air suling (aquadest), glukosa, kertas saring, tissue, kapas, dan kertas label, kertas saring, kertas label, tabung epperdorf, botol sampel 30 ml, potatoe dextrose agar (PDA), alkohol 96%, ekstraks khamir, malt, pepton, glukosa, 3,5-dinitrosalisilat, aliumnatriumtartrat-tetrahydrat (C 4 H 4 KNaO 6.4H 2 O), phenol, Na-Metabisulfit, HCl, indikator fenolptalein, buffer sitrat ph 5, nutrisi media yang terdiri atas (NH 4 ) 2 HPO 4 dan MgSO 4.7H 2 O. Metode Penelitian Prosedur pembuatan bioetanol dapat dibagi ke dalam beberapa tahapan yaitu analisis komponen kimia, persiapan bahan baku, peremajaan mikroba, perlakuan pendahuluan dengan kraft, sakarifikasi dan fermentasi secara simultan. Analisis Komponen Kimia Bahan Baku Pengambilan sampel dan persiapan kayu untuk analisis dilakukan berdasarkan TAPPI T 257 om-85 tentang Sampling and Preparing Wood for Analysis. Kayu dibuat seukuran korek api, kemudian sampel tersebut dikeringkan di bawah sinar matahari selama 2 hari, selanjutnya dikering udarakan selama 5 hari, sampai mencapai kadar air sekitar 12%. Sampel kemudian digiling dengan menggunakan hammer mill dan disaring menggunakan 40 dan 60 mesh. Sampel uji dari beberapa jenis kayu kemudian ditentukan komponen kimianya yang meliputi kadar selulosa, lignin, hemiselulosa dan kelarutan zat ekstraktifnya dalam alkohol-benzena, air dingin, air panas dan NaOH 1%. Selain itu juga dilakukan penentuan derajat kristalinitas selulosa bahan baku dengan menggunakan difraksi sinar X merk Shimadzu. Sebelum dilakukan pengujian sifat kimia bahan baku, terlebih dahulu dilakukan penentuan kadar air. Pengukuran kadar air merujuk pada standar TAPPI T 264 om-88. Metode analisis komponen kimia bahan baku dilakukan dengan TAPPI T 207 om-93.

3 32 Pengukuran Kadar Air Sekitar 2 g sampel ditimbang g (A) dalam botol timbang. Selanjutnya sampel dikeringkan selama 2 jam dalam oven pada suhu 105 ± 3 o C, dinginkan dalam desikator dan selanjutnya ditimbang. Sampel kemudian dioven kembali selama 1 jam, dinginkan dan selanjutnya ditimbang. Proses tersebut diulang hingga dicapai berat konstan (B). Menghitung kadar air yang dinyatakan dalam persen. Kadar Air, % = ((A-B)/B) x 100% Kelarutan dalam Air Dingin Sebanyak 2 ± 0.1 g sampel kayu ditempatkan ke dalam gelas piala 400 ml dan dengan perlahan ditambahkan dengan 300 ml air suling. Kemudian diekstraksi pada suhu 23 ± 2 o C selama 48 jam sambil diaduk. Sampel selanjutnya dipindahkan ke dalam glass filter yang telah dikeringkan hingga beratnya konstan pada suhu 105 ± 3 o C. Sampel dicuci dengan 200 ml air suling dingin dan kemudian dikeringkan hingga beratnya konstan pada suhu105 ± 3 o C, setelah itu didinginkan dan ditimbang. Kelarutan dalam Air Panas Sebanyak 2 ± 0.1 g sampel ditempatkan dalam Erlenmeyer 250 ml, lalu ditambahkan dengan 100 ml air suling panas dan selanjutnya ditempatkan dalam penangas air. Sampel dipanaskan selama 3 jam dengan permukaan air dalam penangas air di atas permukaan air dalam Erlemeyer. Selanjutnya sampel dipindahkan ke dalam glass filter yang telah dikeringkan pada suhu 105 ± 3 o C hingga beratnya konstan. Sampel kemudian dicuci dengan 200 ml air suling dingin dan dikeringkan hingga beratnya konstan pada suhu105 ± 3 o C. Kelarutan dalam air dingin dan air panas, % = ((A-B)/A) x 100% A = bobot kering sampel awal, g B = bobot kering sampel setelah ekstraks, g

4 33 Kelarutan Zat Ekstraktif dalam Natrium Hidroksida (NaOH) 1% Penentuan komponen zat ekstraktif dalam natrium hidroksida 1% didasarkan pada metode TAPPI T 212 om-93. Sebanyak 2.0 ± 0.1 g sampel ditempatkan dalam gelas piala 200 ml. Selanjutkan ditambahkan dengan 100 ± 1 ml larutan NaOH 1% dan diaduk dengan pengaduk kaca. Gelas piala ditutup dengan gelas arloji dan ditempatkan dalam penangas air pada suhu o C selama 60 menit. Diusahakan agar permukaan air dalam penangas air berada di atas permukaan larutan dalam gelas piala. Larutan diaduk dengan pengaduk kaca selama masing 5 detik setelah pemanasan 10, 15, dan 25 menit. Setelah 60 menit sampel dipindahkan ke dalam glass filter dan selanjutnya dicuci dengan 100 ml air panas. Kemudian ditambahkan dengan 25 ml asam asetat 10% dan sampel dibiarkan terendam selama 1 menit sebelum larutan asam asetat dihilangkan. Tahap ini diulangi dengan 25 ml larutan asam asetat 10% yang kedua. Selanjutnya sampel dicuci dengan air panas hingga bebas asam. Glass filter dikeringkan dengan sampel dalam oven pada suhu 105 ± 3 o C hingga beratnya konstan, selanjutnya didinginkan dan ditimbang. Kelarutan dalam Natrium Hidroksida 1%, % = ((A-B)/A) x 100% A = bobot kering kering sampel sebelum ekstraks, g B = bobot kering sampel setelah ekstraksi, g Kelarutan Zat Ekstraktif dalam Alkohol-Benzena Penentuan komponen zat ekstraktif dalam alkohol benzena didasarkan pada metode TAPPI T 264 om-88. Labu ekstraks dibersihkan dan dikeringkan. Bahan yang akan diekstraks ditempatkan dalam thimbel dan selanjutkan ditempatkan dalam alat sokhlet. Thimbel ditutup dengan kasa halus untuk menghindari hilangnya sampel. Sampel selanjutnya diekstrak dengan 200 ml larutan campuran ethanol-benzena selama 6-8 jam, dan diusahakan agar tingkat pendidihan larutan minimal 4 kali pembilasan per jam ekstraks. Setelah diekstraks dengan etanol benzena, sampel dipindahkan ke dalam corong buchner, pelarut dihilangkan dengan vakum, dan selanjutnya thimbel dan kayu dicuci dengan etanol untuk menghilangkan benzena. Sampel selanjutnya dipindahkan kembali ke dalam

5 34 thimbel ekstraks, kemudian diekstraks dengan etanol 95% selama 4 jam atau lebih hingga ethanol tidak berwarna. Sampel uji selanjutnya dioven dan ditimbang sampai diperoleh berat konstan. Kelarutan dalam alkohol-benzena, % = ((A-B)/A) x 100% dengan, A = bobot kering sampel awal, g B = bobot kering sampel setelah ekstraksi, g Kadar Lignin (Lignin Klason) Penentuan kadar lignin Klason dilakukan merujuk pada prosedur dalam Dence (1992). Serbuk kayu bebas ekstraktif ekuivalen 500 mg disiapkan dan ditempatkan dalam gelas piala 50 ml. Selanjutnya ditambahkan 5 ml larutan asam sulfat 72% secara perlahan sambil diaduk hingga serbuk terdispersi sempurna. Sampel uji selanjutnya disimpan pada suhu kamar selama 3 jam sambil diaduk sesekali. Sampel selanjutnya disimpan ke dalam Erlenmeyer 500 ml dan diencerkan hingga konsentrasi asam sulfat 3% yaitu dengan penambahan air hingga total volume 191 ml (total volume 381 ml untuk penggunaan asam sulfat 72% sebanyak 10 ml). Sampel uji kemudian dipanaskan dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 121 o C. Selanjunya dilakukan penyaringan dengan menggunakan glass filter, lalu dioven dan ditimbang sampai diperoleh berat konstan. Kadar lignin, % = (A/B) x 100% dengan, A = bobot lignin, g B = bobot kering kayu, g

6 35 Kadar Holoselulosa (Hemiselulosa dan Selulosa) Sampel kayu bebas ekstraktif ekuivalen 2.5 g bobot kering ditempatkan dalam Erlenmeyer 250 ml. Sampel uji kemudian ditambahkan dengan 100 ml air suling, 1 g natrium klorit dan 1 ml asam asetat glasial. Kemudian dipanaskan dengan penangas air pada suhu 80 o C. Diusahan agar permukaan air dalam penangas air lebih tinggi dari permukaan larutan dalam Erlenmeyer. Sebanyak 1 g natrium klorit dan 0,2 ml asam asetat ditambahkan ke dalam contoh uji setiap interval pemanasan selama 1 jam, penambahan dilakukan sebanyak 4 kali. Sampel uji kemudian disaring dengan menggunakan glass filter, selanjutnya dicuci dengan menggunakan air panas. Sebanyak 25 asam asetat 10% ditambahkan ke dalam sampel uji, lalu dicuci dengan air panas hingga bebas asam. Sampel dioven pada suhu 105 ± 3 o C hingga beratnya konstan. Holoselulosa, % = (A/B) x 100% dengan: A = bobot holoselulosa, g B = bobot kering kayu, g Kadar Selulosa Sebanyak kurang lebih 2.5 g serbuk bahan baku bebas ekstraktif ditempatkan dalam Erlenmeyer 300 ml. Selanjutnya ditambahkan 125 ml larutan asam sitrat 3.5% ke dalam sampel uji dan selanjutnya dilakukan pemanasan dalam penangas air selama 12 jam pada suhu 80 o C. Setelah pemanasan, sampel uji disaring dengan air suling hingga tidak berwarna dan selanjutnya dikeringudarakan. Sampel uji dipindahkan ke dalam Erlenmeyer kembali lalu ditambahkan 125 ml larutan campuran NaOH dan Na 2 SO 3 dan dilakukan pemanasan selama 2 jam pada suhu 50 o C. Sampel uji disaring dengan cawan saring dan selanjutnya dicuci dengan air suling hingga filtrat tidak berwarna. Sebanyak 50 ml larutan natrium klorit 10% ditambahkan dan dilakukan pencucian dengan menggunakan air hingga diperoleh endapan berwarna putih. Selanjutnya sebanyak 100 ml asam asetat 10% ditambahkan ke dalam contoh uji lalu dicuci hingga bebas asam. Sampel uji kemudian dioven pada suhu 105 ± 3 o C dan ditimbang hingga beratnya konstan.

7 36 Selulosa, % = (A/B)x 100% A = bobot selulosa, g B = bobot kering kayu, g Kadar Hemiselulosa Kadar hemiselulosa diperoleh dengan cara mengurangkan persentase kadar holoselulosa dengan kadar selulosa. Hemiselulosa, % = holoselulosa (%) selulosa (%) Persiapan Bahan Baku Pembuatan Serpih Dolok kayu dipotong menggunakan gergaji ke arah transversal dengan ukuran tertentu (± 3 cm). Setelah kulitnya dibuang kemudian kayu dicacah menggunakan golok dengan ketebalan antara 2-4 mm, panjang ± 3 cm dan lebar 2-3 cm kemudian diangin-anginkan. Sebelum dimasak, serpih ditentukan kadar airnya terlebih dahulu dan disimpan dalam kantong tertutup. Pembuatan Larutan Pemasak Larutan Natrium Hidroksida (NaOH) Ditimbang kira-kira 1 kg padatan NaOH teknis, dilarutkan dengan air dalam tank stainless steel. Setelah larut diencerkan sampai volume larutan menjadi 2 L dan disaring dengan kain penyaring. Larutan disimpan dalam botol dan dibiarkan 2-3 hari, kemudian ditentukan konsentrasinya. Larutan Natrium Sulfida (Na 2 S) Ditimbang kira-kira 1 kg padatan natrium sulfida teknis, dilarutkan dengan air dalam tank stainless steel dan sambil dilakukan pengadukan. Setelah padatan larut diencerkan sampai volume larutan mencapai kira-kira 2 L. Larutan selanjutnya disaring dengan kain kasa dan disimpan dalam botol. Larutan disimpan selama seminggu, kemudian ditentukan konsentrasinya.

8 37 Peremajaan Mikroba Pembuatan PDA (Potatoe Dextrose Agar) Peremajaan mikroba dilakukan pada kondisi yang steril dengan menggunakan media potatoe dextrose agar (PDA). Sebanyak 3,9 gram media padat PDA dilarutkan dalam 100 ml air. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian dipanaskan di atas hot plate. Larutan diaduk dengan menggunakan stirrer. Setelah warna larutan menjadi agak bening kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak ± 5 ml, kemudian ditutup dengan kapas dan foil aluminium. Kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Tabung reaksi kemudian dimiringkan dan disimpan pada suhu kamar. Persiapan kultur Aspergillus niger Isolat A. niger diperbanyak dan diremajakan dengan mengkultivasikan ke dalam media PDA, kemudian diinkubasikan dalam inkubator pada suhu kamar o C selama 5 hari. Pembuatan media YMGP Media YMGP dibuat dengan melarutkan sebanyak 5 g/l yeast extract, 5 g/l malt, 10 g/l pepton dan 5 g/l glukosa ke dalam 50 ml air suling. Larutan kemudian diaduk dengan menggunakan stirrer untuk selanjutnya disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Kemudian didinginkan selama sehari. Persiapan Kultur Saccharomyces cerevisiae Isolat khamir S.cerevisiae diremajakan pada media PDA dan diinkubasi selama 2 hari. Setelah itu, dikultivasikan pada media YMGP 50 ml. Inkubasi dilakukan pada shaker dengan kecepatan 125 rpm pada suhu 30 o C selama 24 jam.

9 38 Penelitian Tahap I (Proses Perlakuan Pendahuluan) Perlakuan Pendahuluan dengan Menggunakan Proses Kraft Sampel uji ekuivalen 200 g bobot kering ditempatkan dalam digester. Larutan pemasak NaOH dan Na 2 S disiapkan sesuai dengan kebutuhan. Banyaknya kebutuhan larutan pemasak dihitung berdasarkan kondisi pemasakan yang digunakan sebagai berikut: alkali aktif (Na 2 O) sebanyak 16, 18 dan 20%, rasio serpih dengan larutan pemasak 1 : 4, sulfiditas 20 dan 25%. Suhu maksimum pemasakan sekitar 170 o C dengan lama pemasakan 4 jam. Setelah itu, akan diperoleh pulp hasil delignifikasi kayu. Pulp kemudian dihitung rendemen dan bilangan kappanya. Pulp yang dihasilkan ditimbang (A gram). Sebagian pulp diambil dan ditimbang B gram, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 103 o C sampai beratnya konstan dan ditimbang (C gram). Rendemen pulp = C/B x A x 100% BKT Keterangan: BKT = Bobot kering tanur kayu yang dimasak Bilangan kappa dihitung berdasarkan metode TAPPI T 241 su-71. Sebanyak 1 gram pulp kering oven dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 1000 ml dan ditambahkan air suling 500 ml. dikocok dengan stirrer sampai homogen. Tambahkan 25 ml KMnO N dan 25 ml H 2 SO 4 4 N serta 200 ml air suling. Biarkan selama 5 menit, kemudian tambahkan 15 ml KI 10%. Titrasi dengan tiosulfat 0.1 N dengan indikator kanji. Indikator ditambahkan setelah larutan berwarna kuning. Lakukan pula penitaran blanko. Bilangan kappa = (b-a) x N tio 0.1 dengan, a = banyaknya ml tio pada penitaran contoh b = banyaknya ml tio pada penitaran blanko N = normalitas

10 39 Penelitian Tahap II (Proses Sakarifikasi dan Fermentasi Secara Simultan) Penelitian tahap II merupakan kelanjutan dari metode penelitian I. Setelah diperoleh metode perlakuan pendahuluan yang tepat pada masing-masing jenis bahan baku maka dilakukan proses sakarifikasi dan fermentasi dengan menggunakan berbagai metode sakarifikasi enzim selulase pada konsentrasi berbeda yaitu (4 dan 8% bobot kering sampel). Selain itu, diperlakukan juga sakarifikasi dengan A. niger (5 x 10 7 CFU/cc). Semua proses sakarifikasi difermentasi menggunakan ekstraks jamur S.cereviciae (1.5 x10 9 CFU/cc) dengan menggunakan metode sakarifikasi dan fermentasi secara simultan (SSF). SSF dengan Isolat Jamur A. niger SSF dilakukan dalam satu fermentor (Erlenmeyer). Berat substrat yang digunakan adalah 5 g untuk masing-masing substrat. Pulp yang diperoleh dari perlakuan pendahuluan dan fraksinasi kemudian diencerkan sampai mencapai keenceran 2.5% dari total media (5 gram/200 ml total media). Media SSF diberi dengan nutrient dengan konsentrasi masing-masing 0.5 g/l (NH 4 ) 2 HPO 4 ; g/l MgSO 4.7H 2 O. ph awal yang digunakan adalah sekitar diatur dengan menggunakan NaOH dan HCl, kemudian dipertahankan dengan buffer sitrat ph 5. Substrat dan media nutrient dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 20 menit. Setelah itu ditambahkan isolat jamur A.niger (6.5 x 10 7 CFU/cc) dan ekstrak jamur S.cereviciae (1.5 x 10 9 CFU/cc) masing-masing sebanyak 10%. Proses SSF dilakukan selama 96 jam pada suhu konstan 30 o C. Pengamatan dilakukan setiap 24 jam. Pada akhir fermentasi dihitung kadar etanol, gula pereduksi, total gula dan jumlah A. niger dan khamir S. cereviciae. SSF dengan Hidrolisis Menggunakan Enzim Selulase Komersial SSF dilakukan dalam satu fermentor. Berat substrat yang digunakan adalah 5 g untuk masing-masing substrat. Pulp yang diperoleh dari perlakuan pendahuluan dan fraksinasi kemudian diencerkan sampai mencapai keenceran 2.5% dari total media (5 gram/200 ml total media). Media SSF diberi dengan nutrien dengan konsentrasi masing-masing 0.5 g/l (NH 4 ) 2 HPO 4 ; g/l MgSO 4.7H 2 O. ph awal yang digunakan adalah sekitar diatur dengan

11 40 menggunakan NaOH dan HCl. Substrat dan media nutrient dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 20 menit. Setelah itu, dilakukan penambahan enzim selulase dengan konsentrasi 4% dari bobot kering substrat kayu, lalu ditambahkan dengan ekstraks jamur S. cereviciae 10 % (1.5 x 10 9 CFU/cc) dari total media, setelah itu, ditambahkan buffer sitrat ph 5. Proses SSF juga dilakukan dengan menggunakan enzim selulase 8%. SSF dilakukan selama 96 jam pada suhu konstan 37 o C. Pada akhir fermentasi dihitung kadar etanol, gula pereduksi, total gula dan jumlah khamir S. sereviciae. Metode Analisis Selama Kultivasi Penentuan Total Gula dengan Metode Fenol H 2 SO 4 Penentuan total gula didasarkan pada metode Dubois et al. (1956). Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar fenol yang digunakan. Kurva standar fenol adalah sebagai berikut: 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 mg/l glukosa masingmasing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5% dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat (H 2 SO 4 ) pekat ditambahkan dengan cepat. Biarkan selama 10 menit, kemudian dikocok lalu tempatkan dalam penangas air selama 15 menit. Absorbannya diukur pada 490 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva standar fenol, hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode DNS Penentuan gula pereduksi dilakukan berdasarkan metode Miller (1959). Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) membentuk senyawa yang akan diukur absorbannya pada panjang gelombang 550 nm.

12 41 Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10.6 gram asam 3,5-dinitrosalisilat dan 19.8 NaOH ke dalam 1416 ml air. Setelah itu, ditambahkan 306 gram Na-K- Tatrat, 7.6 g fenol yang dicairkan pada suhu 50 o C dan 8.3 g Na-Metabisulfit. Larutan ini diaduk rata, kemudian 3 ml larutan ini dititrasi dengan HCl N dengan indikator fenolftalein. Banyaknya titran berkisar 5 sampai dengan 6. Jika kurang dari itu harus ditambahkan 2 gram NaOH untuk setiap ml kekurangan HCl 0,1 N. Kurva standar dibuat dengan mengukur nilai gula pereduksi pada glukosa 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; dan 0.6 g/l. Nilai gula pereduksi diukur dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam grafik secara linear. Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut: sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit. Biarkan sampai dingin pada suhu ruang. Ukur absorbansnya pada panjang gelombang 550 nm. Pengujian Kadar dan Rendemen Etanol Pengujian kadar etanol dilakukan dengan menggunakan GC (Gas Chromatography). Sebelum pengukuran dibuatkan dulu kurva standar dengan menggunakan etanol murni. Rendemen dihitung dengan membandingkan volume etanol yang diperoleh dengan berat sampel bahan baku yang digunakan. Pemilihan proses produksi terbaik didasarkan pada rendemen etanol tertinggi. Rumus yang digunakan untuk menghitung rendemen etanol adalah sebagai berikut: Rendemen (% v/v) = Volume etanol yang diperoleh secara aktual (ml)x 100% Volume Bahan Baku (ml) Perhitungan Jumlah Mikroba Jumlah mikroba dihitung dengan pengamatan di bawah mikroskop dengan metode hitungan mikroskop (Haemacytometer) pada perhitungan jamur S. cereviciae dan metode total plate count (TPC) pada perhitungan jamur A. niger.

13 42 Persiapan Bahan Baku Penghilangan Kulit (Debarking) Hammer Mill Chipping Alkalinitas: 16; 18 dan 20%) Sulfiditas: 20 dan 25% Perhitungan Rendamen dan Bilangan Kappa Serpih (Chips) Delignifikasi (Proses Kraft) Sampel Kayu Ukuran Korek Api Penentuan Komponen Kimia Kayu dan Derajat Kristalinitas Selulosa Tahap I: Optimasi Pretreatment Pulp Peremajaan Mikroba Tahap II: Hidrolisisi dan Fermentasi Simultan Selulase: 4% Selulase: 8% A. niger (6.5 x 10 7 CFU/cc) S. cereviciae (1.5 x 10 9 CFU/cc) Sakarifikasi dan Fermentasi secara Simultan (SSF) Etanol Kadar dan Rendemen Etanol Gambar 8 Diagram Alir Penelitian

14 43 Analisis Data Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan software spss 15.0 for windows. Pada penelitian analisis komponen kimia bahan baku, rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) sederhana, dengan 4 perlakuan jenis bahan baku yaitu A 1 (pinus), A 2 (sengon), A 3 (gmelina) dan A 4 (kelapa sawit). Model matematis untuk rancangan RAL menurut Gaspertz (1991) adalah sebagai berikut: Y ij = + I +ε ij dengan, Y IJ I ε ij : Nilai pengamatan yang memperoleh perlakuan ke-i : Rata-rata umum hasil pengamatan : Pengaruh perlakuan ke-i : Galat percobaan dari perlakuan ke-i pada pengamatan ke-j Jika perlakuan yang berpengaruh terhadap nilai respon, selanjutnya diuji dengan uji beda nyata (BNJ) atau uji Tukey dengan rumus adalah sebagai berikut: w = q a (p,fe) s Ў dengan, w = Nilai uji Tukey (BNJ) q a p = Nilai tabel Tukey = Jumlah perlakuan fe = Derajat bebas galat s Ў s 2 r = Galat baku nilai tengah = (s 2 / r ) ½ = Kuadrat tengah galat = Jumlah ulangan Pada penelitian tahap I, analisis rendemen, bilangan kappa dan kadar lignin pulp hasil pemasakan dilakukan dengan menggunakan rancangan percobaan faktorial dengan rancangan dasar rancangan acak lengkap (RAL). Setiap kombinasi perlakuan diulang masing-masing sebanyak dua kali yang terdiri atas 3 faktor, yaitu:

15 44 1. Jenis Kayu yang terdiri atas 4 taraf: A 1 A 2 A 3 A 4 = Kayu pinus (P) = Kayu sengon (S) = Kayu gmelina (G) = Kelapa sawit (KS) 2. Konsentrasi Alkalinitas terdiri atas 3 taraf: B 1 B 2 B 3 = 16% (A16) = 18% (A18) = 20% (A20) 3. Konsentrasi Sulfiditas terdiri atas 2 tataf: C 1 C 2 = 20% (Su20) = 25% (Su25) Model matematis untuk rancangan faktorial menurut Gaspertz (1991) sebagai berikut: Y ijk = μ + α i + β j + γ k + (αβ) ij + (αγ) ik + (βγ) jk + (αβγ) ijk + Є ijk Dengan, Y ijk = Nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij (taraf ke-i dari faktor A dan taraf ke-j dari faktor B dan taraf ke-k faktor C). Μ = Nilai tengah populasi (rata-rata yang sesungguhnya) α i = Pengaruh aditif taraf ke-i dari faktor A. β j = Pengaruh aditif taraf ke-j dari faktor B. γ k = Pengaruh aditif taraf ke-j dari faktor C. (αβ) ij = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor A dan taraf ke-j faktor B. (αγ) ik = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor A dan taraf ke-k faktor C. (βγ) jk = Pengaruh interaksi taraf ke-j faktor B dan taraf ke-k faktor C. (αβγ) ijk = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor A dan taraf ke-j faktor B dan taraf ke-k faktor C. Є ijk = Pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi ijk.

16 45 Hasil analisis ragam yang menunjukkan perlakuan yang berpengaruh terhadap respon, selanjutnya diuji lanjut dengan uji Tukey. Setelah dilakukan penelitian tahap I, maka dilanjutkan dengan penelitian tahap II dengan memilih proses perlakuan pendahuluan (konsentrasi alkalinitas dan sulfiditas) yang menghasilkan rendemen tertinggi dan bilangan kappa yang rendah pada penelitian tahap I. Rancangan yang digunakan pada penelitian tahap II adalah rancangan percobaan faktorial dengan rancangan dasar RAL. Setiap kombinasi perlakuan diulang masing-masing sebanyak dua kali yang terdiri atas 2 faktor, yaitu: 1. Jenis Kayu yang terdiri atas 4 taraf: A 1 A 2 A 3 A 4 = Kayu pinus (P) = Kayu sengon (S) = Kayu gmelina (G) = Kelapa sawit (KS) 2. Metode Hidrolisis terdiri atas 5 tataf: B 1 B 2 B 3 = Selulase 4% (E4) = Selulase 8% (E8) = Aspergillus niger (AN) Variabel pengamatan pada penelitian tahap II ini adalah yaitu gula pereduksi, total gula, jumlah S. cereviciae, jumlah A. niger, kadar etanol dan rendemen etanol. Data diamati setiap 24 jam selama 96 jam. Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis untuk mengetahui pengaruh masing-masing perlakuan.