Bahan mentah yang digunakan adalah ketimun, ikan

Transkripsi

1 III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN A. BAHAN DAN MEDIA Bahan mentah yang digunakan adalah ketimun, ikan rucah segar (ikan peperek/ Leigona thidae), acar (berisi ketimun, bawang merah, dan cabai rawit) yang diperoleh dari penjual sate di sekitar Bogar, garam, dan gula. Bakteri yang digunakan adalah Alcaligenes sp. atau Achromobacter sp. DSM dan Pseudomonas fluorescens DSM dari Jerman, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dari Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Teknologi Pangan, Fateta, IPB, Salmonella typhimuri"um, Vibrio parahaemolyticus, dan Listeria monocytogenes dari Balai Penelitian Veteriner, Bogar. Isolat bakteri asam laktat dipelihara dalam media agar MRs-CaC0 3 semi padat. Untuk P. fluorescens digunakan media agar Pseudomonas, untuk L. monocytogenes media TSA, untuk V. parahaemolyticus media agar Marine, dan untuk bakteri penguji lain digunakan agar Nutrien. Broth yang digunakan untuk menumbuhkan kultur kerja bakteri asam laktat adalah MRS broth, untuk L. monocytogenes digunakan BHI broth, dan untuk bakteri penguji lain ditumbuhkan dalam Nutrien broth. Untuk identifikasi bakteri asam laktat digunakan Reagen Nessler, MRS arginin broth, Streptokoki

2 31 arginin broth, agar Leuconostoc, Litmus Milk, Gibson semi padat, dan MRS broth. Untuk menguji aktivitas antimikroba bakteri asam laktat terhadap Alcaligenes sp. digunakan media TSA, P. fluorescens: PA, E. coli: EMBA, L. monocytogenes: TSA, S. aureus: BPA, S. typhimurium: agar McConcey, V. parahaemolyticus: TCBSA. Untuk menghitung jumlah bakteri asam laktat yang dikontakkan. dengan P. fluorescens dalam media ekstrak ikan rucah digunakan agar MRS, agar MRS-Natrium azida digunakan untuk menghitung bakteri asam laktat yang dikontakkan dengan Alcaligenes sp., agar Nutrien untuk menghitung jumlah P. fluorescens dan Alcaligenes sp. baik yang dikontakkan dengan bakteri asam laktat atau tidak dalam media ekstrak ikan rucah. Bahan-bahan lain yang digunakan yaitu NaCl sebagai pengencer, air pepton sebagai media pertumbuhan bakteri asam laktat untuk menghasilkan hidrogen peroksida, dan media sintetik asam laktat sebagai media pertumbuhan bakteri asam laktat untuk memproduksi asam. Bahan kimia yang digunakan adalah NaOH, HC1, asam oksalat, KI, KI0 3, asam sulfat, natrium sulfat, dan amonium molibdat.

3 32 B. METODE PENELITIAN "1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat"dari Pikel Ketimun Dan Acar a. Pembuatan Pikel Ketimun Untuk pembuatan pikel ketimun, dipilih ketimun yang masih muda, dicuci, dipotong-potong agar didapat ukuran yang seragam dan dimasukkan ke dalam stoples yang berisi larutan garam dengan konsentrasi 5% NaCl. Sebanyak 1% glukosa ditambahkan untuk membantu proses fermentasi. diusahakan supaya terendam di bawah Ketimun permukaan larutan garam. Toples ditutup rapat. Fermentasi dilakukan pada suhu kamar. b. Isolasi Bakteri Asam Laktat Isolasi bakteri asam laktat dari pikel ketimun dilakukan pada waktu fermentasi 2, 4, 6, 9, 12/ dan 16 hari. Isolasi bakteri asam laktat dari acar yang dibeli dari tukang sate dilakukan sehari setelah pembelian. Cairan dari pikel ketimun dan acar diencerkan dengan larutan NaCl 0,85% sampai pengenceran Sebanyak 1 ml contoh dari pengenceran diambil dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril (dilakukan duplo untuk setiap pengenceran).

4 33 agar MRS dituang ke dalam cawan petri dan digoyang secara mendatar. Setelah agar membeku, cawan diinkubasi dalam posisi terbalik pada suhu 37 C selama dua hari. Cawan dengan koloni-koloni yang terpisah dipilih, koloni-koloni yang mempunyai warna dan ukuran yang berbeda di~indahkan ke dalam cawan petri yang berisi agar MRS dengan membuat goresan kuadran. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2 hari. Jika koloni dalam cawan petri belum murni (misalnya besar koloni tidak seragam) maka diambil satu koloni dan dibuat goresan kuadran lagi pada agar MRS sampai diperoleh koloni-koloni dengan ukuran yang seragam. Isolat-isolat bakteri asam laktat yang telah murni ditumbuhkan dalam MRS broth selama 2 hari. Kultur ini akan digunakan sebagai inokulum untuk identifikasi awal. c. Identifikasi Bakteri Asam Laktat 1. Identifikasi awal Identifikasi awal meliputi uj i katalase dan pewarnaan gram. Uji katalase (Fardiaz, 1987) Satu loop kultur cair disebarkan pada gelas obyek. Larutan H % diteteskan di at as kultur

5 34 tersebut. Timbulnya gelembung-gelembung oksigen pada kultur menunjukkan uji positif. Bakteri asam laktat akan menunjukkan uji katalase negatif. Pewarnaan gram (Fardia'z, 1987). Satu loop kultur cair disebarkan pada gelas obyek. Kultur cair dikeringkan di udara dan difiksasi dengan nyala api kecil. Pewarna kristal violet diteteskan di atas film pada gelas obyek selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air kran. sisa air yang tertinggal dibuang, dan lapisan film kultur ditetesi dengan larutan Lugol (yodium Gram) selama 1 menit. Setelah dicuci kembali dengan air, kemudian dihilangkan warnanya dengan menggunakan alkohol 95% selama detik atau sampai warna biru tidak luntur lagi. Setelah dicuci sebentar, kemudian lapisan film kultur diwarnai dengan larutan safran in selama detik. Setelah dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap, lapisan film bakteri diperiksa di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali. Bakteri asam laktat merupakan bakteri gram positif ditandai dengan kultur yang berwarna biru-ungu.

6 35 Isolat yang menunjukkan uji katalase negatif dan hasil pewarnaan gram biru-ungu disimpan di dalam MRS-CaC0 3 semi padat. 2. Uji Biokimia Bakteri AS~ Laktat (Nuraida, 1988) Sebagai inokulum untuk identifikasi, diambil satu sampai dua loop isolat dari media MRS-CaC0 3 semi padat. Ditumbuhkan pada media MRS broth selama 2 hari pada suhu 37 C Produksi CO 2 dari glukosa. Tes ini untuk membedakan bakteri homofermentatif dan heterofermentatif 4engan menggunakan media. Gibson semi padat. Cara pembuatan media Gibson semi padat adalah sebagai berikut 10 ml mangan sulfat dieampur dengan 800 ml susu skim. Ke dalam eampuran tersebut ditambahkan 2,5 gr ekstrak khamir dan 50 gr glukosa. Larutan dipanaskan dalam penangas air. ditambahkan 200 ml agar nutrien. Selagi panas, Media,didistribusikan ke dalam tabung reaksi dengan kedalaman 5-6 em, Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan penangas air masing-masing 30 menit selama 3 hari berturut-turut, Media Gibson semi padat steril dieairkan dan diturunkan suhunya sampai 45 C. Kira-kira

7 36 1 tetes inokulum ditambahkan dengan menggunakan pipet tetes steril, kemudian ditambahkan 1 ml agar cair steril 1,5%. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 2-5 hari. Bakteri laktat heterofermentatif akan membentuk gas ditandai dengan pecahnya atau meloncatnya agar. Produksi amonia dari arginin. Tes ini digunakan untuk membedakan laktobasili heterofermentatif dan homofermentatif. Tes ini juga digunakan untuk membedakan Leuconostoc dengan bakteri asam laktat heterofermentatif lainnya. Cara pembuatan MRS arginin broth 3 gr L- arginin monohidrat dilarutkan dalam 1 liter MRS broth, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121 C selama 15 menit. Streptokoki arginin broth: 5 gr tripton, 2,5 gr ekstrak khamir, 0,5 gr glukosa, 2 gr K 2 2HP0 4, 3 gr L arginin monohidrat dilarutkan dalam 1 liter air destilata, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121 C, 15 menit. MRS arginin broth dan streptokoki arginin broth diinokulasi dengan 1 tetes inokulum. Kultur kemudian diinkubasikan selama 2 5 hari pada suhu 37 C. Sebanyak 1 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan Reagen Nessler dengan volume yang

8 37 sarna. Pembentuk~n amonia ditandai dengan pembentukan warna oranye kecoklatan setelah penambahan Reagen Nessler. Produksi dekstran dari sukrosa. Tes ini digunakan untuk membedakan 'Leuconostoc tertentu dengan bakteri laktat berbentuk koki lainnya. Cara pembuatan agar Leuconostoc 10 gr tripton, 5 gr ekstrak khamir, 5 gr K 2 HP0 4, 5 gr triamonium sitrat, 5 gr sukrosa, 15 gr agar bacto dilarutkan dalam 1 liter air destilata, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121 C selama 15 menit. Kemudian agar cair tersebut dipindahkan' ke dalam cawan petri steril. Sebagai kontrol digunakan media yang mengandung 0,1 % sukrosa. Bakteri asam laktat digores secara kuadran pada agar Leuconostoc. Cawan petri diinkubasi pad a suhu 37 C selama 2-5 hari. Pembentukan dekstran ditandai dengan pembentukkan koloni mukoid. Pertumbuhan pada suhu berbeda. Satu tetes inokulum ditambahkan-ke dalam tabung MRS broth (masing-masing duplo). Satu seri tabung diinkubasi pada suhu 15 C dan seri lainnya pada suhu 45 C selama 5-14 hari.

9 38 Pertumbuhan pada 6.5% NaCl. MRS broth dengan 6.5% NaCl diinokulasi dengan 1 tetes inokulum. Kultur kemudian diikubasikan pada suhu 37 C selama 5 hari. Reaksi pada Litmus Milk. Cara pembuatan Litmus Milk 100 gr susu skim dan 0,75 gr litmus dilarutkan dalam 1 liter air destilata, larutan didistribusi ke dalam tabung reaksi, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf 121 C, 15 menit. Satu tetes inokulum diinokulasikan ke dalam Litmus Milk, kemudian diinkubasi pad a suhu 37 C s~lama 2-5 hari. Reaksi yang terjadi pad a Litmus Milk diamati a. Pemisahan whey atau penggumpalan susu karena enzim proteolitik tanpa pembentukan asam sehingga warna litmus tetap biru. b. Pembentukan asam dengan atau tanpa penggumpalan susu yang ditandai dengan perubahan warna litmus menjadi merah muda. C. Pembentukan gas yang ditandai dengan adanya gelembung-gelembung. Diagram isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat yang diisolasi dari pikel ketimun dan acar dapat dilihat pada Gambar 1.

10 39 Isolasi bakteri asam laktat Purifikasi uji katalase ----~.~) Katalase positif Katalase negatif Pewarnaan gram ~ Gram negatif Gram positif Bakteri asam laktat Uji biokimia: - produksi CO 2 dari glukosa - produksi amonia dari arginin - produksi dekstran dari sukrosa - pertumbuhan pad a suhu berbeda - pertumbuhan pada 6.5% NaCl - reaksi pada Litmus Milk Gambar 1. Isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat dari pikel ketimun dan acar

11 40 2. SELEKSI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT Seleksi isolat bakteri asam laktat berdasarkan kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan mikroba pembusuk dan patogen dengan uji difus~ sumur seperti yang dilakukan oleh Garriga et al. (1993) dengan beberapa modifikasi. Ke dalam medium agar steril diinokulasikan 0.2 % bakteri indikator yang telah diinkubasi selama sehari (suhu 37 C). Setelah membeku dibuat lubang/sumur pada medium agar tersebut dan dispotkan sebanyak 50 Ml kultur bakteri asam Iaktat yang telah diinkubasi selama 2 bari pada suhu 37 C. Sebagai kontrol dispotkan MRS broth yang belum diinokulasi ke dalam sumur. Setelah diinkubasi selama 2 hari (37 C), areal penghambatan yang terbentuk diukur. Areal penghambatan berupa areal bening di tepi lubang/sumur sampai tepi dimana terjadi pertumbuhan bakteri penguji, dinyatakan dalam mm. Pengukuran dilakukan di beberapa sisi, kemudian dirata-ratakan. Uji ini dilakukan sebanyak 2-3 ulangan. 3. IDENTIFlKASI SENYAWA ANTIMIKROBA a. Uji Bakteriosin Untuk melihat kemampuan isolat bakteri asam laktat dalam memproduksi bakteriosin digunakan uji

12 41 difusi sumur seperti yang dilakukan oleh Garriga et al. (1993) dengan beberapa modifikasi. Kultur bakteri asam laktat setelah diinkubasi selama 2 hari, dinetralkan dengan memakai NaOH 0,1 N hingga mencapai ph 7,0. Urituk memisahkan sel, kultur yang telah dinetralkan disaring dengan memakai kertas millipor berukuran steril 0,22 Mm. Tahap selanjutnya sarna dengan metode di atas, kecuali yang dispotkan ke dalam sumur adalah filtrat kultur bakteri asam Iaktat dan sebagai bakteri indikator digunakan P. fluorescens dan Alcaligenes sp.. b. Kemampuan memproduksi asam Untuk menentukan kemampuan bakteri asam laktat dalam memproduksi asam, digunakan medium sintetik asam Iaktat yang dibuat berdasarkan Buchta (1983) dalam Wirjantaro (1993), yang terdiri dari 50 gil glukosa, 0.4% urea, 0.1% K 2 HP0 4, 0.05% MgS0 4, 0.05% KCI, 0.001% FeS0 4.7H 2 0, dan 0.05% ekstrak khamir. Dua ose isolat dari MRS-caC0 3 semi padat dipindahkan ke dalam MRS broth. Setelah inkubasi 2 hari, kultur digunakan sebagai inokulum untuk produksi asam. SepuIuh persen inokulum diinokulasi ke dalam media sintetik asam laktat, kultur

13 42 diinkubasi dalam inkubator bergoyang pad a suhu 30 C. Analisa terhadap asam laktat yang terbentuk dilakukan setiap hari sampai 4 hari inkubasi. Setiap hari sejumlah media sintetik asam laktat yang telah ditumbuhi oleh bakteri asam laktat diambil secara aseptis. untuk memisahkan sel bakteri asam laktat dari hasil metabolitnya maka kultur disentrifus. Filtrat hasil sentrifus yang akan digunakan untuk analisa asam. Analisa asam dilakukan dengan cara titrasi. Sebelum NaOH digunakan untuk penetapan total asam tertitraii, dilakukan standarisasi NaOH Filtrat hasil sentrifus diencerkan sampai 50 kali, sebanyak 10 ml filtrat diambil untuk dititrasi dengan NaOH 0.01 N dengan indikator fenoftalein 1% (Apriyantono et al, 1989). Hasilnya dinyatakan sebagai per sen asam laktat. ml NaOH x N NaOH x 0.09 x 100 % asam x pengenceran ml sampel c. Pengujian Hidrogen Peroksida (price dan Lee, 1969) Dua ose isolat dari MRS-CaC0 3 semi padat dipindahkan ke dalam MRS broth. Setelah inkubasi 2

14 43 hari. kultur digunakan sebagai inokulum untuk produksi hidrogen peroksida. Sepuluh persen inokulum diinokulasi ke dalam air pepton 1%. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C. Ke da1am 5 ml sampel bebas sel bakteri asam laktat, ditambahkan 0.5 ml KI jenuh, 0.5 ml M amonium molibdat dalam 1 N asam sulfat, digoyang selama 1 menit, dan dititrasi dengan N Natiosulfat sampai warna kuning yang terbentuk hampir hilang. Sejumlah indikator amilum 1% ditambahkan ke da1am sampel dan titrasi dilanjutkan sampai warna biru mendadak lenyap. Untuk menentukan kon~entrasi H 2 0 2, digunakan kurva standar hidrogen peroksida. Sebelum digunakan Na-tiosulfat distandarisasi dengan cara sebagai berikut: ke dalam erlenmeyer ditambahkan 10 ml KI0 3,.10 ml KI, dan 10 ml HC1. Sampel segera dititrasi dengan Na-tiosulfat sampai warna muda sekali. Sejumlah 2 ml indikator amilum ditambahkan ke dalam sampel, titrasi dilanjutkan sampai warna mend adak lenyap. 4. PENGARUH WAKTU KONTAK BAKTERI ASAM LAKTAT DENGAN BAKTERI PERUSAK DALAM MEDIA EKSTRAK lkan RUCAH Untuk menguji kemampuan bakteri asam laktat dalam menekan pertumbuhan mikroba perusak ikan (Alcaligenes

15 44 sp. dan P. fluorescens) dilakukan uji kontak dalam media ekstrak ikan (Gambar 2). Media ekstrak ikan dibuat berdasarkan prosedur Vatana dan Rosario (1983) dalam Olympia et al (1992). Dua belas gram ikan diblender dengan 50 ml air destilata. Disaring dengan memakai kain saring. Ekstrak ikan kemudian ditepatkan phnya menjadi 6 dengan HCl 0.1 N. Untuk kontrol, ke dalam media ekstrak ikan hanya ditambahkan bakteri penguji saja. Interval waktu kontak yang digunakan adalah 0, 4, 8, dan 24 jam, suhu inkubasi 30 C. Untuk mempermudah pembahasan maka dilakukan analisis data dengan menghitung nilai log (Nc/No), dimana Nc adalah jumlah mikroba pad a waktu c dan No adalah jumlah mikroba tepat setelah inokulasi (0 jam). Jika log (Nc/No) sama dengan nol berarti tidak terjadi pertumbuhan mikroba, kalau lebih besar dari nol berarti terjadi pertumbuhan, kalau lebih kecil dari nol berarti terjadi kematian. Untuk melihat efek bakterisidal atau bakteristatik nilai log (Nc/No) contoh harus dibandingkan dengan nilai log (Nc/No) kontrol. Jika nilai log (Nc/No) contoh berkurang sedangkan nilai log (Nc/No) kontrol bertambah berarti terjadi efek bakterisidal. Jika nilai log (Nc/No) kontrol bertambah dan nilai log (Nc/No) contoh juga bertambah tetapi tidak sebesar pertambahan nilai kontrol berarti terjadi efek bakteristatik.

16 45 Isolat bakteri asam laktat.j, MRS Broth 37 C, 2 hari Mikroba penguji 1 Nutrient Broth 37 C, 2 hari j pemekatan (109_10 10 koloni/ml broth) pengenceran ( koloni/ml broth) 1% 1% media ekstrak ikan 30 C, 0, 4, 8, 24 jam 1 Analisa -total bakteri asam laktat -total bakteri penguji -total asam dan ph Gambar 2. Diagram alir uji kontak

17 46 5. ANALISIS a. Total Bakteri Asam Laktat dengan Metode Hitungan Cawan secara Agar Tuang (Fardiaz, 1987) Dari pengenceran , sebanyak 1 ml ekstrak ikan rucah yang telah diinokulasi dipindahkan ke dalam cawan petri. Ke dalam cawan petri dimasukkan agar cair st~ril. Cawan petri segera digoyang secara mendatar. Setelah agar membeku, cawan diinkubasi pada posisi terbalik pada suhu 30 C selama 2-3 hari. Untuk menghitung total bakteri asam laktat yang dikontakkan dengan P. fluorescens digunakan media agar MRS. Untuk bakteri asam laktat yang dikontakkan dengan Alcaligenes sp. digunakan media agar MRS yang telah ditambah % natrium azida. Penambahan natrium azida dimaksudkan untuk menghambat pertumbuhan Alcaligenes sp.. b. Total Bakteri Penguji dengan Metode ~les and ~sra Surface Co~ony Count (Miles and Misra, 1969 dalam Harrigan dan Cance, 1976 ). Pada pemupukan dengan metode ini, agar nutrien steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. Setelah membeku dengan sempurna, kemudian sebanyak 0.02 ml contoh yang telah diencerkan (pengenceran )

18 47 dipipet pada permukaan agar tersebut. Inkubasi dilakukan pada. suhu kamar selama sehari. Jumlah koloni per cawan yang memenuhi syarat untuk dihitung adalah koloni per cawan. Jumlah koloni per ml yang sebenarnya didapatkan dengan mengalikan jumlah koloni per cawan dengan faktor 50. Pemupukan dilakukan duplo. c. Analisa Total Asam dengan Metode Titrasi (Apriyantone et ai, 1989) Ke dalam 5 ml contoh ditambahkan 15 air destilata. Larutan ini dititrasi dengan NaOH 0,01 N, indikator fenolftalein 1 %. Sebelum digunakan, NaOH distandarisasi dengan (COOH)2.2H20. Hasilnya dinyatakan sebagai persen asam laktat. 4. Pengukuran Nilai ph (Apriyantono et ai, 1989). Sebelum digunakan ph-meter dinyalakan terlebih dahulu selama menit. Elektroda kemudian dibilas dengan air destilata dan dikeringkan dengan kertas tissue. Setelah itu elektroda dicelupkan ke dalam media ekstrak ikan, pengukuran ph diset. Elektroda dibiarkan tercelup beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil. Sebelum pengukuran sampel, ph-meter distandarisasi dengan buffer fosfat ph 7. Langkah-langkah yang harus dilakukan dalam standarisasi ph-meter sarna dengan

19 48 cara pengukuran sampel, hanya saja setelah pembacaan ph yang stabil, tombol kalibrasi disesuaikan sampai diperoleh angka ph yang sesuai dengan ph buffer.