BAB III BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitiantelah dilaksanakan mulai Februari 2013 sampai dengan Juni Pengambilan sampel lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii dilakukan pada bulan Februari 2013 di Perairan Pulau Pramuka Kepulauan Seribu DKI Jakarta. Identifikasi metabolit sekunder dan ekstraksi dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) Universitas Padjadjaran (Unpad). Uji aktivitas antioksidan dan Uji Total Kadar Polifenol dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pelayanan Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Unpad. Sedangkan Uji Peroksida dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik, Jurusan Kimia, FMIPA Unpad. 3.2 Alat dan Bahan Alat Tabel 1. Alat dan Kegunaannya NO Alat Kegunaan 1 Global Positioning System (GPS) Untuk menentukan titik pengambilan sampel 2 Termometer Untuk mengukur suhu perairan sampel 3 Refraktometer Untuk mengukur salinitas perairan sampel 4 ph meter Untuk mengukur ph perairan sampel 5 Kotak Styroform Untuk menyimpan sampel selama perjalanan 6 Kantong plastik Untuk menyimpan sampel 7 Gunting Untuk memotong sampel 8 Pisau Untuk mencacah sampel 9 Talenan Untuk tempat alas saat proses pencacahan sampel 10 Blender Untuk menghaluskan sampel menjadi serbuk 11 Kertas label Untuk memberi tanda 12 Pipet tetes Untuk mengambil cairan kimia 13 Pipet volum Untuk mengambil cairan kimia 14 Tabung reaksi Untuk tempat terjadinya reaksi/pencampuran 20

2 21 Tabel 1 (lanjutan). Alat dan Kegunaannya NO Alat Kegunaan 15 Kaca arloji Untuk tempat meneteskan cairan uji 16 Penangas air Untuk memanaskan 17 Alumunium Foil Untuk menutup gelas ukur/erlenmeyer 18 Erlenmeyer Untuk maserasi 19 Gelas kimia Untuk maserasi 20 Gelas ukur Untuk mengukur volume pelarut 21 Timbangan analitik Untuk mengukur berat padatan 22 Spatula Untuk mengambil padatan 23 Orbital shaker Untuk pengadukan saat maserasi 24 Kertas saring Untuk memisahkan filtrat dan residu 25 Rotatory evaporator Untuk menguapkan pelarut 26 Botol vial Untuk menyimpan ekstrak pekat 27 Mikropipet Untuk mengambil cairan kimia dalam jumlah kecil 28 Magnetic stirrer Untuk menghomogenkan larutan 29 Spektrofotometri UV-vis Untuk mengukur serapan/absorbansi 30 Buret Untuk titrasi 31 Inkubator Untuk mempercepat oksidasi Bahan Tabel 2. Bahan yang digunakan No Bahan No Bahan 1 Sampel daun, rimpang,, akar, buah, bunga, lamun 13 H 2 SO 4 Uji Fitokimia dan Ekstraksi 14 NaOH 10% 2 Pereaksi meyer 15 Etanol 70% 3 Pereaksi wagner 16 FeCl 3 5% 4 Serbuk magnesium 17 Es Batu 5 Amil alcohol 18 Amil alkohol 6 Kloroform Uji Aktivitas Antioksidan 7 Metanol 19 Vitamin C (Asam askorbat) 8 Akuades 20 Kristal 2,2 difenil-2-pikrihidrazil (DPPH) 9 Asetat Anhidrida Uji Total Kadar Polifenol 10 Asam sulfat pekat 21 Asam Galat 11 Air panas 22 Na 2 CO 3 5% 12 HCl 2N 23 Follin Ciocalteau 50%

3 22 Tabel 2 (Lanjutan). Bahan yang digunakan No Bahan No Bahan Uji Bilangan Peroksida 24 Minyak Ikan, Minyak Nabati 27 Kalium Iodida 25 Cairan Tween Indikator pati 1% 26 Asam asetat glasial 29 Natrium tiosulfat 0,1 N 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode observasi dengan melakukan eksperimen di laboratorium menggunakan faktor perbedaan konsentrasi ekstrak. Penelitian ini meliputi identifikasi metabolit sekunder, ekstraksi, uji aktivitas antioksidan, uji total kadar polifenol, dan uji bilangan peroksida. Identifikasi kandungan metabolit sekunder menggunakan uji kualitatif fitokimia dengan prinsip reaksi warna, pengendapan, serta pembentukan busa (Harborne 1987). Ekstraksi menggunakan metode maserasi (Quinn 1998 dalam Agustiningrum 2004) yaitu perendaman sampel berulang dengan menggunakan pelarut sampai tidak berwarna lagi, prinsipnya adalah proses difusi karena perbedaan konsentrasi di luar dan di dalam sel. Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (Blois 1958 dalam Molyneux 2004) pada berbagai konsentrasi sampel serta menggunakan Vitamin C sebagai pembanding dengan prinsip penyerapan hidrogen oleh radikal bebas dari antioksidan ditunjukkan dengan nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer. Uji total kadar polifenol menggunakan metode total phenolic content (TPC) folin-ciocalteu dengan prinsip reaksi oksidasi dan reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua senyawa fenolik dalam sampel uji (Singleton dan Rossi 1965). Uji bilangan peroksida menggunakan prinsip oksidasi-reduksi pengurangan bilangan peroksida pada emulsi minyak yang telah ditambahkan sampel dengan cara titrasi iodometri (Santoso et al dalam Prabowo 2009).

4 Prosedur Penelitian Pengambilan dan Persiapan Sampel Bahan lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii diambil dari lapangan secara lengkap mulai dari ujung akar sampai ujung daun, lalu dibawa ke laboratorium. Setelah itu bagian-bagian dari tegakan yaitu daun, rimpang, akar, bunga, daging buah, dan biji dipotong serta dipisahkan dengan menggunakan gunting. Kemudian dicuci dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Selanjutnya setiap bagian yang telah dipisahkan dipotong kecil/ dicacah dengan menggunakan gunting untuk kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sampai menjadi serbuk Identifikasi Metabolit Sekunder (Harborne 1987) a. Alkaloid Serbuk sampelditimbang sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dalam kloroform, dan ditambahkan beberapa tetes amonia (NH 4 OH).Larutan ekstrak disaring dalam tabung reaksi tertutup, Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H 2 SO 4 2M, ditambahkan pereaksi 2 tetes pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner. Perubahan ada tidaknya endapan diamati. b. Flavonoid Sampel serbuk 1 g diekstraksi dengan menggunakan metanol kemudian dibagi menjadi tiga tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan Amil alkohol, HCl pekat 2 tetes kemudian ditambah 0,1 g Mg serbuk. Tabung reaksi kedua ditambahkan H 2 SO 4 2N sebanyak 2 tetes.tabung terakhir ditambahkan NaOH 10% sebanyak 2 tetes.ketiga tabung dikocok kuat. Perubahan warna diamati. c. Steroid/Triterpenoid Sebanyak 1 g sampel diekstraksi dengan menggunakan kloroform, disaring. Kemudian diteteskan ke dalam kaca arloji dan dibiarkan kering. Kemudian ditambahkan pereaksi Lieberman Burchad yaitu satu tetes asam asetat anhidrida dan satu tetes asam sulfat pekat. Perubahan warna diamati.

5 24 d. Fenol hidroquinon Sebanyak 1 g serbuk sampel dilarutkan dalam 20 ml etanol 70%, setelah dikocok kemudian diambil 1 ml, selanjutnya ditambahkan2 tetes pereaksi FeCl 3 5%. Perubahan warna diamati. e. Saponin Sebanyak 1 gserbuk sampel dimasukan dalam erlenmeyer, ditambahkan 10 ml air panas, didihkan selama 5 menit, kemudian disaring dalam keadaan panas, larutan diambil sebanyak 10 ml kemudian dikocok kuat secara vertikal selama 10 detik. Pembentukan busa diamati. f. Tanin Sebanyak 1 gserbuk sampel ditambahkan air, dididihkan selama beberapa menit dan saring, diambil 2ml hasil penyaringan (filtrat) dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi FeCl 3 5 %. Perubahan warna diamati Ekstraksi (Quinn 1998 dalam Agustiningrum 2004) Tujuan dilakukan ekstraksi iniadalah untuk mengambil atau mendapatkan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam tegakan lamun. Bagianbagian sampel lamun (daun, rimpang, akar, bunga, daging buah, serta biji) yang telah dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 40 g dan direndam dengan pelarut metanol sebanyak 400 ml selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring sehingga didapat filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh di evaporasi hingga diperoleh ekstrak pekat dengan menggunakan Rotatory evaporator pada suhu 40 C-50 C. Sedangkan pada residu dilakukan pengulangan perendaman sampai tidak berwarna lagi. Dari proses ini maka diperoleh ekstrak pekat metanol daun, rimpang, akar bunga, daging buah, serta biji Uji Aktivitas Antioksidan (Blois 1958 dalam Molyneux 2004) Berdasarkan penelitian Putri (2011) dan Rumiantin (2011) yang dijadikan sebagai acuan, maka ekstrak pekat dari bagian-bagian lamun hasil ekstraksi menggunakan pelarut metanol dilarutkan dalam metanol dengan berbagai

6 25 konsentrasi, dengan membuat larutan stok terlebih dahulu (Lampiran 3). Sebagai pembanding dan kontrol positif, digunakan antioksidan yang biasa digunakan masyarakat yaitu Vitamin C yang dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 0,25, 0,5, 1, 2 dan 4 ppm. Larutan DPPH 160 ppm dibuat denganmelarutkan 1,6 mgdpph dengan pelarut metanol sebanyak 10 ml. Proses pembuatan larutan DPPH dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari sinar matahari. Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding (kontrol positif)yang telah dibuat masing-masing diambil 4,5 ml dan direaksikan dengan 500 μl larutan DPPH dalam tabung reaksi yang berbeda serta diberi label. Larutan blanko sebagai kontrol negatif juga dibuat dengan melarutkan 500μl larutan DPPH ditambahkan metanol 4,5 ml. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm Uji Total Kadar Polifenol (Singleton dan Rossi 1965) Ekstrak lamun masing-masing sampel sebanyak 5 mg dilarutkan dengan 2 ml etanol 96% dalam tabung reaksi. Campuran tersebut ditambahkan 5 ml akuades dan 0,5 ml reagen Follin-Ciocalteau (50% v/v), kemudian didiamkan selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml larutan natrium karbonat (7.5% b/v), dihomogenasi dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam dalam kondisi tanpa cahaya (gelap). Kandungan total fenol diukur dengan spektrofotometer UV- Visible (UV-Vis) pada panjang gelombang 765 nm Uji Bilangan Peroksida (Santoso et al dalam Prabowo 2009) Minyak yang digunakan dalam penelitian adalah minyak ikan yang diperoleh dari pengumpul minyak daerah Cimahi Jawa Barat, minyak goreng yang masih baru diperoleh dari pasaran, minyak goreng bekas pakai yang sudah dipakai untuk menggoreng sebanyak kurang lebih tiga kali dalam skala rumah tangga. Sistem emulsi minyak dibuat mengacu pada metode Santoso et al. (2003) yang dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 5 g (6 ml)dan 30 ml akuades yang telah ditambahkan 1,25 ml tween 20. Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak

7 26 bagian lamun terbaik dari tahap sebelumnya yaitu daunenhalus acoroides dengan konsentrasi136,40 ppm, dan 200 ppm yang selanjutnya disebut sampel minyak. Kemudian sampel minyak disimpan selama empat belas hari untuk minyak ikan dan satu hari untuk minyak goreng dalam inkubator bersuhu 40 C untuk mempercepat oksidasi. Sampel minyak selanjutnya ditimbang sebanyak 5 g (6 ml) di dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat glacial dan 40% kloroform). Setelah larut kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan didiamkan 10 menit sambil dikocok. Iodin yang terbentuk dititrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1 N dengan penambahan indikator pati 1%. Titrasi dihentikan saat larutan sampel berubah dari berwarna biru setelah ditambahkan indikator pati menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap volume awal larutan Na2S2O30,1 N yang ditunjukkan oleh skala buret merupakan volume total larutan Na2S2O30,1 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara yang sama seperti prosedur diatas ddibuat juga untuk penetapan blanko sebagai kontrol negatif namun tidak dilakukan penambahan sampel (0 ppm). Kemudian dilakukan analisa perhitungan nilai bilangan peroksida. 3.5 Parameter yang diamati Parameter yang diamati dari penelitian ini adalah meliputi identifikasi metabolit sekunder dan uji aktivitas antioksidan Identifikasi Metabolit sekunder Tabel 3. Parameter uji fitokimia Uji Fitokimia Parameter yang diamati Uji Alkaloid + jika adanya endapan putih kekuningan + jika adanya endapan cokelat Uji Flavonoid + jika terbentuk warna orange/kuning/merah/cokelat Uji Steroid/ Triterpenoid + jika terbentuk warna merah/biru/ungu Uji Saponin + jika terbentuk busa stabil 1-10cm, tidak hilang pada penambahan HCl 2 N Uji Fenol Hidrokuinon + jika terbentuk warnahijau-biru/ungu Uji Tanin + jika terbentuk warna biru/hijau kehitaman Sumber tabel : Harborne (1987)

8 Inhibisi antioksidan Perhitungan yang digunakan adalah nilai EC50 (Effecient Concentration 50%) untuk menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat menangkal radikal sebesar 50%. Berikut perhitungannya (Molyneux 2004) Nilai EC50 % Inhibisi = dalam sumbu x dan y. EC50 Y=a+bx absorbansi blanko absorbansi sampel absorbansi sampel x 100% diperolehdengan menggunakan persamaan regresi linier, diplotkan Semakin kecil nilai EC50maka semakin tinggi aktivitas antioksidan yang dimilikinya (Molyneux 2004) Kadar Total Fenol Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai milligram ekivalen asam galat (GAE= Galic Acid Equivalent) per gram sampel (mg GAE/g sampel) kemudian dipersentasikan (Singleton 1965). Kadar polifenol % = Pengukuran kadar polifenol rata rata konsentrasi awal sampel x Evaluasi Aktivitas Antioksidan (Penghitungan Bilangan Peroksida) Tahapan ini bertujuan untuk menentukan seberapa besar konsentrasi ekstrak terpilih yang mampu menghambat pembentukan peroksida dalam emulsi minyak dinyatakan dengan nilai peroksida. Nilai bilangan peroksida dinyatakan miliequivalen per 1 kg minyak atau lemak dapat dihitung dengan rumus berikut (Ketaren 1986) : h = A x N x 1000 x100% G A = Jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasi N= Normalitas larutan Na2S2O3 G=Berat sampel (g) Semakin tinggi bilangan peroksida maka semakin tinggi pula tingkat ketengikan suatu minyak (ASA 2000 dalam Wildan 2002).

9 Analisa Data Data yang diperoleh berupa reaksi perubahan warna, terbentuknya endapan, dan adanya busa pada identifikasi metabolit sekunder, nilai daya inhibisi EC 50, total kadar polifenol, serta nilai bilangan peroksida pada uji aktivitas antioksidan kemudian dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.