ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TANIN DARI DAUN BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi L.) SKRIPSI. Oleh: LAILIS SA'ADAH NIM

Transkripsi

1 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TANIN DARI DAUN BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi L.) SKRIPSI Oleh: LAILIS SA'ADAH NIM JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG 2010

2 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TANIN DARI DAUN BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi L.) SKRIPSI Diajukan Kepada: Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan Dalam Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S. Si) Oleh: LAILIS SA'ADAH NIM: JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG 2010

3 SURAT PERNYATAAN ORISINALITAS PENELITIAN Saya yang bertanda tangan dibawah ini: Nama : Lailis Sa'adah NIM : Fakultas / Jurusan : Sains dan Teknologi / Kimia Judul Penelitian : Isolasi dan Identifikasi Senyawa Tanin dari Daun Belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) Menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi yang saya tulis ini benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambil alihan data, tulisan atau pikiran orang lain yang saya akui sebagai hasil tulisan atau pikiran saya sendiri. Apabila di kemudian hari terbukti terdapat unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia untuk mempertanggung jawabkan, serta diproses sesuai paraturan yang berlaku. Malang, 21 April 2010 Yang membuat pernyataan Lailis Sa'adah NIM

4 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TANIN DARI DAUN BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi L.) SKRIPSI Oleh: LAILIS SA'ADAH NIM: Telah disetujui oleh: Pembimbing I Pembimbing II Elok Kamilah Hayati, M.Si NIP Anton Prasetyo, M.Si NIP Tanggal, 21 April 2010 Mengetahui Ketua Jurusan Kimia Diana Candra Dewi, M.Si NIP

5 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TANIN DARI DAUN BELIMBING WULUH (Averrhoa bilimbi L.) SKRIPSI Oleh: Lailis Sa'adah NIM Telah Dipertahankan di Depan Dewan Penguji Skripsi dan Dinyatakan Diterima Sebagai Salah Satu Persyaratan untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains (S. Si) Tanggal, 21 April 2010 Susunan Dewan Penguji Tanda Tangan 1. Penguji Utama : Rini Nafsiati Astuti, M.Pd NIP (... ) 2. Ketua Penguji : Tri Kustono Adi, M.Sc NIP (... ) 3. Sekr. Penguji : Elok Kamilah Hayati, M.Si NIP (... ) 4. Anggota Penguji : Anton Prasetyo, M.Si NIP (... ) Mengetahui dan Mengesahkan Ketua Jurusan Kimia Diana Candra Dewi, M.Si NIP

6 4 MOTTO t ÏΖÏ%θçΗø>Ïj9 M tƒ#u ÇÚö F{$# Îûuρ tβρçåçö7è? Ÿξsùr& ö/ä3å à Ρr& þ Îûuρ Dan di bumi itu terdapat tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orangorang yang yakin. Dan (juga) pada dirimu sendiri. maka apakah kamu tidak memperhatikan? (Q.S. Adz Dzariyaat : 20-21)

7 Persembahan Syukur Alhamdulillah saya panjatkan ke hadirat Allah SWT yang dengan ridho Nya saya dapat menyelesaikan sebuah karya ini dengan baik. Karya kecil ini ku persembahkan untuk Ibu Julaicha dan bapak Syaifullah tercinta. Engkaulah Malaikatku yang dikirim Allah, dengan penuh kasih sayang, melahirkan, mendidik, membesarkan, menasehati, memotivasi, yang selalu ada di saat aku rapuh, yang rela berkorban dengan segenap jiwa dan raga demi kesuksesanku, yang senantiasa meneteskan air mata dalam heningnya malam dan setiap do'anya. Sungguh jasa-jasamu tak akan terbalas oleh apapun, ananda haturkan banyak terima kasih atas semuanya. Kakak-kakak ku tersayang Syaiful Haq S.Pd, Iftachul Jannah, terima kasih banyak atas motivasi dan doa yang engkau berikan, sehingga adik dapat mewujudkan cita-cita. Untuk kakak Nur Cholis Majid, dimanapun engkau berada motivasi dan kasih sayang mu ke adik tak kan pernah putus. Adik-adik ku tersayang Caca, Nauval,Nauvel, Dimas dan Andin, engkaulah yang selalu menghibur tante pada saat suka dan duka, kalian menjadikan ku kuat menghadapi segala kesulitan. Belajarlah terus dan kejarlah cita-citamu sampai setinggi langit. Keluarga besarku; Lek Jem, Nenek, Pak Lek, Bu Lek, Ma' Ita, Santi. Teman2 SMP: V-3, Sofa, Amir, Ansori, H-Nafi, Yanto, H.Crespo, Mansyur, Edy, Munir. Trimakasih atas semangat 'n dorongan yang kalian berikan sehingga ku dapat tetap tegar dalam menghadapi segala cobaan hidup. Keluarga besar Kimia para dosen dan stafnya yang memberikan ilmu dan pengalamnnya serta segala pengertiannya dalam mendampingi perjalanan studiku sampai aku dapat seperti ini. Bu elok dan pak Naim terima kasih atas kesabaran dalam membimbing dan proyek yang diberikan. Kimia angkatan '05, Angkatan paling sedikit jumlah mahasiswanya, semoga tetap bersatu sampai kapanpun. Pantang mundur n tetap semangat OK!!!! Teman2 seperjuangan ngelab (Sieta, Wardah, H5, Aisy, Fajar, Mami, Mb ATA, Mb Devi, Mb Ika, Mb Atus, Mb Uswah, Mb Ci2, Mb Diyah, Ika, Mas Miko, Mas Hairi, Mas Faijal dkk) jangan pernah menyerah. Tiada kesulitan yang tidak dapat diselesaikan Teman2 Asrama Khodijah Mb Lely tetap semangat ya dengan S2 nya, Elok colon Psikolog moga bisa bantu menghibur orang2 yang stress, Irma, Sila lanjutkan skripsimu, Ifo jangan memanjakan penyakit yang hinggap pada dirimu, lawanlah dengan semangat mu. Yuni lawanlah rasa malez yang ada didirimu, Wi2n yang suka tertawa n menghibur teman2, lika yang menemani q ngerjakan karya kecil ini dkk.

8 óó ÎÎ ««$$ ÇÇ uu $$ ÉÉ ÏÏ $$ KATA PENGANTAR ÉÉ ÉΟó É ó Î Î0 «!$ «$# Ç u Ç uη q 9$ $# ÉΟŠÏ É Ïm 9$ $# Puji syukur Alhamdulillah ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat, hidayah dan kemudahan yang selalu diberikan kepada hamba-nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul "Isolasi dan Identifikasi Senyawa Tanin dari Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.)" sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains. Penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini, terutama kepada: 1. Bapak Prof. Dr. H. Imam Suprayogo selaku Rektor Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang beserta para stafnya 2. Bapak Prof. Drs. Sutiman Bambang Sumitro, SU., D.Sc selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang. 3. Ibu Diana Candra Dewi, M.Si selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang. 4. Ibu Elok Kamilah Hayati, M.Si, Bapak A. Ghanaim Fasya, S.Si, dan Bapak Anton Prasetyo M.Si selaku dosen pembimbing yang dengan sabar telah banyak memberikan bimbingan dan arahan dalam penyusunan skripsi ini. 5. Ibu Rini Nafsiati Astuti, M.Pd selaku penguji utama dan Bapak Tri Kustono Adi, M.Sc selaku ketua penguji 6. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi yang telah banyak memberikan ilmunya. 7. Moh. Taufik, S.Si, M. Kholid Al-Ayubi, S.Si, Kurnia Kumala Dewi, S.Si selaku Laboran Kimia UIN Maliki Malang. 8. Ibu dan Bapakku yang dengan penuh kasih sayang dan keikhlasan telah memberi segala kebutuhan yang penulis butuhkan, memberi dorongan dan motivasi baik secara materiil maupun spirituil.

9 9. Kakak-kakakku (Syaiful Haq, Iftahul Jannah dan Alm. Nur Kholis Majid), engkaulah panutan dalam hidupku. 10. Teman-teman chemistry '05 (Sieta, Aisy, Warda, H5, U_mi, Nur RA, Fajar, Ieza, Naily, Asri, Helmi, Agus, Dedy) yang telah memberikan arahan, bantuan serta ilmunya selama perjalanan studiku. 11. Kakak-kakak dan adik-adik keluarga besar kimia tetap semangat dan pantang mundur, kimia adalah mencoba jadi coba dan coba terus 12. Keluarga besar " Asrama Khodijah " yang setia menemani penulis dalam suka dan duka 13. Semua pihak yang telah banyak membantu penulis demi terselesainya skripsi ini. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi penulis pada khususnya dan pembaca pada umumnya dan semoga penulisan skripsi ini mendapatkan ridho dari Allah SWT. Amin. Malang, 30 Maret 2010 Penulis

10 DAFTAR ISI KATA PENGANTAR... i DAFTAR ISI... iii DAFTAR TABEL... v DAFTAR GAMBAR... vi DAFTAR LAMPIRAN... vii ABSTRAK... viii BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Batasan Masalah... 7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA Tanaman belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dalam perspektif islam Tanaman belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dalam perspektif ilmu pengetahuan Manfaat daun belimbing wuluh Kandungan kimia daun belimbing wuluh Tanin Tanin terkondensasi Tanin terhidrolisis Gallotanin Ellagitanin Ekstraksi daun belimbing wuluh Pemisahan senyawa tanin dari daun belimbing wuluh dengan kromatografi lapis tipis Identifikasi senyawa tanin Identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis ditekankan pada reaksi geser Identifikasi dengan spektrofotometer FTIR BAB III METODE PENELITIAN Pelaksanaan penelitian Bahan dan alat penelitian Alat penelitian Bahan penelitian Tahapan penelitian Rancangan penelitian Cara kerja Persiapan sampel Ekstraksi tanin dari daun belimbing wuluh dengan metode modifikasi Nuraini (2002)... 36

11 3.5.3 Uji kualitatif ekstrak daun belimbing wuluh dengan reagen Pemisahan senyawa tanin KLT analitik KLT preparatif Identifikasi senyawa tanin Identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis Identifikasi gugus fungsi senyawa tanin dengan spektrofotometer FTIR Analisis data BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Preparasi sampel daun belimbing wuluh Ekstraksi senyawa tanin dari daun belimbing wuluh Uji fitokimia senyawa tanin Uji fitokimia dengan menggunakan FeCl Uji fitokimia senyawa tanin dengan menggunakan larutan gelatin Uji fitokimia senyawa tanin dengan menggunakan formalin 3 %, HCl 1 N, FeCl 3 1 % Pemisahan ekstrak tanin dengan kromatografi lapis tipis (KLT) KLT analitik KLT preparatif Identifikasi senyawa tanin Identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis Identifikasi dengan spektrofotometer FTIR Hasil Penelitian Senyawa Tanin dalam Daun Belimbing Wuluh dalam Prespektif Islam BAB V KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 79

12 DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Warna dan warna komplementer Tabel 2.2 Nilai bilangan gelombang ekstrak tannin pada daun belimbing wuluh Tabel 4.1 Data penampakan noda dari fasa air hasil KLT analitik dengan beberapa eluen dengan lampu Ultra Violet 254 nm dan 366 nm. 53 Tabel 4.2 Harga Rf dan warna noda hasil KLTA eluen terbaik n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm Tabel 4.3 Data spektrum UV-Vis dari isolat sebelum dan sesudah penambahan pereaksi geser Tabel 4.4 Int Interpretasi Spektra FTIR dari Isolat

13 DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Daun belimbing wuluh Gambar 2.2 Struktur inti tanin Gambar 2.3 Struktur flavan-3,4-diols Gambar 2.4 Struktur flavan-4-ols Gambar 2.5 Reaksi hidrolisis gallotanin Gambar 2.6 Reaksi hidrolisis ellagitanin Gambar 2.7 Spektra inframerah ekstrak tanin Gambar 4.1 Reaksi dugaaan antara tanin dengan FeCl 3 1 % Gambar 4.2 Reaksi dugaan antara tanin dan gelatin Gambar 4.3 A. Foto plat hasil KLTA ekstrak daun belimbing wuluh dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 254 dan 366 nm, B. Ilustrasi noda hasil KLTA ekstrak daun belimbing wuluh dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 254 dan 366 nm, C. Foto hasil KLTA ekstrak mimosa dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 366 dan 254 nm, D. Ilustrasi noda hasil KLTA ekstrak mimosa dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 254 dan 366 nm Gambar 4.4 Struktur inti tanin Gambar 4.5 Spektra UV-Vis isolat 2 yang ditambahkan dengan Na 2 M Gambar 4.6 Struktur senyawa tanin yang ditambah dengan Na 2 M.. 61 Gambar 4.7 Spektra UV-Vis isolat 2 yang ditambahkan dengan AlCl 3 5 %, AlCl 3 5 %/HCl Gambar 4.8 Spektra UV-Vis isolat 2 yang ditambahkan dengan NaOAc, NaOAc/H 3 BO Gambar 4.9 Struktur dugaan senyawa tanin yang ada dalam daun belimbing wuluh... 64

14 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Skema Kerja Lampiran 2. Perhitungan dan Pembuatan Reagen dan Larutan Lampiran 3. Dokumen Penelitian Lampiran 4. Hasil Spektra Spektrofotometer UV-Vis dari Hasil KLT Preparatif 97 Lampiran 5. Hasil Spektra Spektrofotometer FTIR

15 ABSTRAK Sa'adah, L Isolasi dan Identifikasi Senyawa Tanin dari Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.). Pembimbing I : Elok Kamilah Hayati, M.Si. Pembimbing II : Anton Prasetyo, M.Si Kata Kunci : Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L), Tanin, Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Spektrofotometer UV-Vis, Spektrofotometer FTIR Telah dilakukan penelitian tentang isolasi dan identifikasi senyawa tanin dari daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.). Penelitian ini bertujuan untuk mencari eluen terbaik dalam pemisahan senyawa tanin dan mengetahui jenis senyawa tanin dari ekstrak daun belimbing wuluh dengan kromatografi lapis tipis. Senyawa tanin merupakan salah satu senyawa yang ada dalam daun belimbing wuluh seperti firman Allah SWT dalam surat al An'am ayat 99 bahwa dalam tumbuhan-tumbuhan masih banyak rahasia alam yang belum terungkap. Isolasi senyawa tanin dari daun belimbing wuluh dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut aseton : air (7:3) selama 3x24 jam dengan bantuan shaker, kemudian dilakukan fraksinasi. Uji fitokimia dilakukan dengan menambahkan reagen FeCl 3 1 %, larutan gelatin, formalin 3 % : HCl 1 N (2:1) dan FeCl 3 1 % ke ekstrak. Pemisahan senyawa tanin dari ekstrak dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik untuk mencari eluen terbaik dengan variasi eluen yaitu n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5), etil asetat : kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2), asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat (Forestal) (30:10:3), metanol : etil asetat (4:1), etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1), toluen : etil asetat (3:1), kemudian dilanjutkan pemisahan dengan KLT preparatif. Identifikasi senyawa tanin dilakukan dengan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak dari daun belimbing wuluh mengandung senyawa tanin, didukung dari uji fitokimia dari ketiga reagen menunjukkan positif mengandung senyawa tanin. Eluen terbaik dalam pemisahan senyawa tanin dengan KLT analitik adalah n-butanol : Asam asetat : Air (BAA) (4:1:5) yang dapat digunakan dalam pemisahan dengan KLT preparatif. Eluen ini memisahkan 3 noda dengan nilai R f 0,53; 0,61; dan 0,68. Berdasarkan hasil analisis spektrofotometer UV-Vis, isolat 2 dengan nilai R f 0,61 memiliki panjang gelombang maksimum sebesar 331 nm. Hasil identifikasi dengan FTIR menunjukkan serapan-serapan yang spesifik dari senyawa tanin seperti rentangan asimetri pada bilangan gelombang 3372,4 cm -1, overtone aromatik pada bilangan gelombang 2071,8 cm -1, rentangan cincin aromatik pada 1625,8 cm -1 dan benzena pada 782,5 cm -1, sehingga senyawa tanin yang diduga adalah flavan- 3,6,7,4',5'-pentaol atau flavan-3,7,8,4',5'-pentaol.

16 ٢ ٤ ٣ ٤ مستخلص لبحث السعادة ل العزل و التحقيق فى مركبات تنين من ورق ب ل م ب ينج و لو ه (ا فيروا بلمبي لين), المشرفان: ا يلوك كاملة حياتي الماجستير و ا نتون فراسيتيو الماجستير. الكلمات المفتاحية: ورق ب ل م ب ينج ولوه (ا فيروا بلمبي لين) تنين كر و م اتوغرافيا بقشرة رقيقة سطياف مابعدالبنفسجى ف س ي بل سطياف فورير ترانسفوروم ا نفرا ريد) قد ا بحث البحث العلمي عن العزل و التحقيق فى مركبات تنين من ورق ب ل م ب ينج و لو ه (ا فيروا بلمبي لين). من ا هداف هذا البحث هي طلب أخي ار ايلوين في فرق مركبات التنين و لمعرفة جنسه من دقيق ورقه ب ل م ب ينج و لو ه بالكرومتوغفرافيا بقشرة رقيقة. مركبات تنين كان فى ورق ب ل م ب ينج و لو ه قال االله سبحانه و تعالى فى السورة الانعام فى الا ية ٩٩ هذه الا ية تدل على كثير من الاسرار عن الانبات التي لم يفشحالناس. العزل بمركبات تنين من ورق بليمبينج ولوه بوضعه اولا في خرفش من الماء واسيتون (٣:٧) بالوقت ٢٤x٣ ساعات با لة شاكر ثم الا ستخلاص منه ٠ التجريبة على ف توك ي م ي تستعمل بزيادة كاشف كلويد الحديديك ١ جيلاتين و فورمالين ٣ حمض الكلوريك ١ محل ول ) ١) و كلويد الحديديك ١ الى خلاصة. وعزل مركبات تنين من خلاصة عمل با لة كرومتوغرافيا بقشرة رقيقة ا ن تل ي ت يك لا ختار ا خي ار جنس ايلوين من ا نواعها التي هي: بوثانول حمض الخليك الماء ) ١ ٥ ) الخليك الايثيلى كلوروفورم حمض الخليك ١٠ (١٥ ٥ ١) حمض الخليك ثلجى الماء حمض الكلوريك ثلجى (٣٠ ١٠ ٣) ميثانول الخليك الايثيلى (٤ ١) الخليك الايثيلى ميثانول حمض الخليك (٦ ١٤ ١) تولوين الخليك الايثيلى ) ١) ثم تستمر ا لى الفراق بكر و م اتوغرافيا بقشرة رقيقة الا ستعداد. و العزل تنين تستعمل بسطياف مابعدالبنفسجى ف س ي بل و فورير ترانسفوروم ا نفرا ريد. وتناي ج البحث تد ل على ا ن خلاصة من ورقه ب ل م ب ينج و لو ه تتكون على مركبات تنين من تحقيق ف توك ي م ي من ثلاثة كاشف تدل ا يجابي متكون على مركبات تنين ا خي ار ايلوين في عزل مركبات تنين من خلاصة عمل با لة كرومتوغرافيا بقشرة رقيقة ا ن تل ي ت يك هو بوثانول حمض الخليك الماء ) ١ ٥ ) حيث يمكن ا عمال في عزل بكر و م اتوغرافيا بقشرة رقيقة الا ستعدا. هذا ايلوين يفصل ثلاثة نقطة بثمن ريتينسان فلويه ٠ ٥٣; ٠ ٦١; ٠ ٦٨. و على التحقيق سطياف مابعدالبنفسجى ف س ي بل ايسولات ٢ بثمن ريتينسان فلويه ٠ ٦١ وطوله موجه حولى nm ٣٣١ ونتيجة تحقيق بفورير ترانسفوروم ا نفرا ريد تدل ا متصاص الخاص من مركبات تنين كا فاصلة حدراكسي ا سيميرi في نمرة الموج ٣٣٧٢ ٤ ¹ cm اوفرتون مركبات عطرية في نمرة الموج ¹٢٠٧١ ٨ cm ومسافة ختم مركبات عطرية ١٦٢٥ ٨ ¹ cm و بنزين ٧٨٢ ٥ ¹ cm حتى تكون مركبات تنين هي فلافان ٤ ٧ ٦ ٣ ۵ - فنتاٷل او فلافان ٤ ٨ ٧ ٣ ۵ - فنتاٷل.

17 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Indonesia merupakan negara yang terkenal dengan keanekaragaman tanaman terutama hasil pertanian dan rempah-rempah. Hal ini didukung oleh keadaan geografis Indonesia yang beriklim tropis dengan curah hujan sering terjadi sepanjang tahun. Salah satu keanekaragaman hayati yang terdapat di Indonesia adalah belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.). Belimbing wuluh tumbuh hampir di seluruh daerah, namun belum dibudidayakan secara khusus (Abdul, 2008). Tanaman belimbing wuluh dapat dimanfaatkan dalam kehidupan seharihari. Bagian yang dapat digunakan diantaranya bunga, buah, daun dan batangnya. Bunga belimbing wuluh digunakan sebagai obat batuk dan sariawan. Buah belimbing wuluh selain digunakan sebagai bumbu masak juga dapat digunakan sebagai obat menurunkan tekanan darah tinggi, gusi berdarah, jerawat dan batuk. Daun belimbing wuluh selain digunakan sebagai penyedap rasa juga dapat digunakan sebagai obat batuk, obat kompres pada sakit gondokan dan obat rematik, antidiare, sedangkan batang belimbing wuluh dapat digunakan sebagai obat sakit perut (Atang, 2009). Penelitian tentang kimia bahan alam akhir-akhir ini semakin banyak mengeksploitasi sebagai bahan obat-obatan baik untuk farmasi maupun untuk kepentingan pertanian, karena disamping keanekaragaman struktur kimia yang

18 3 4 dihasilkan juga rendahnya efek samping yang ditinggalkan dan mudah didapatkan. Buah belimbing wuluh mengandung banyak vitamin C alami yang berguna sebagai penambah daya tahan tubuh dan perlindungan terhadap berbagai penyakit. Berdasarkan hasil pemeriksaan kandungan kimia buah belimbing wuluh yang dilakukan Herlih (1993) dalam Faradisa (2008) menunjukkan bahwa buah belimbing wuluh mengandung golongan senyawa oksalat, minyak atsiri, fenol, flavonoid dan pektin. Batang belimbing wuluh mengandung saponin, tanin, glukosida, kalsium oksalat, sulfur, asam format, peroksida, sedangkan daunnya mengandung tanin, sulfur, asam format, peroksida, kalsium oksalat, kalium sitrat. Allah menciptakan semua yang ada di dunia ini tidaklah sia-sia dari yang kecil hingga yang besar. Makhluk hidup (hewan, tumbuhan dan lain-lain) semuanya dapat dimanfaatkan oleh manusia jika manusia itu berfikir. Allah menjaga semua yang telah Ia ciptakan agar tetap hidup. Allah membuktikannya dengan diturunkan oleh Nya hujan sebagai sumber kehidupan, dan agar manusia dapat mensyukuri nikmat yang telah Allah berikan kepadanya. Allah telah menjelaskannya dalam surat al An am ayat 99: çµ ΨÏΒ $oψô_t zr'sù & ó x«èe ä. N$t7tΡ ÏµÎ/ $oψô_t zr'sù [!$tβ Ï!$yϑ 9$# z ÏΒ tαt Ρr& ü Ï%!$# uθèδuρ ô ÏiΒ ;M Ψy_uρ πušïρ#yš β#uθ ΖÏ% $yγïèù=sû ÏΒ È Ζ9$# z ÏΒuρ $Y6Å2#utI Β ${6ym çµ ΨÏΒ ßlÌøƒ Υ #ZÅØyz ÿ ϵÏè ΖtƒuρtyϑøOr&!#sŒÎ) ÿ ÍνÌyϑrO4 n<î) (#ÿρãýàρ$# >µî7 t±tfãβ uöxîuρ$yγî6okô±ãβ tβ$ Β 9$#uρtβθçG ƒ 9$#uρ 5>$oΨôãr& tβθãζïβ σム5Θöθs)Ïj9 ;M tƒuψ öνä3ï9 sœ Îû βî) "Dan Dialah yang menurunkan air hujan dari langit, lalu Kami tumbuhkan dengan air itu segala macam tumbuh-tumbuhan maka Kami keluarkan dari tumbuh-tumbuhan itu tanaman yang menghijau. Kami keluarkan dari tanaman

19 yang menghijau itu butir yang banyak; dan dari mayang korma mengurai tangkai-tangkai yang menjulai, dan kebun-kebun anggur, dan (Kami keluarkan pula) zaitun dan delima yang serupa dan yang tidak serupa. Perhatikanlah buahnya di waktu pohonnya berbuah dan (perhatikan pulalah) kematangannya. Sesungguhnya pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman". Firman Allah SWT dalam surat al An'am ayat 99 yang menjelaskan bahwa Allah swt menurunkan air hujan dari awan, kemudian dengan air tersebut Allah mengeluarkan setiap jenis tumbuh-tumbuhan yang bermacam-macam bentuk, ciri khas serta berbeda-beda tingkatan kelebihan dan kekurangannya (al Maraghi, 1992), meskipun semuanya tumbuh di tanah yang sama dan dialiri dengan air yang sama. Selain itu, buah-buahan dan sayur-sayuran juga merupakan sumber vitamin dan nutrisi esensial yang melimpah. Pada surat al An'am ayat 99 Allah menutup ayat dengan Sesungguhnya pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman, karena orang-orang yang beriman itu hidup, bekerja, berfikir dan memahami sehingga untuk mendapatkan bukti dari ayat tersebut yang dapat menunjukkan mereka kepada perbuatan yang mengesakan Allah swt (al Jazairi, 2007). Selain itu, dengan memperhatikan secara mendalam maka akan ditemukan rahasia-rahasia alam tumbuh-tumbuhan seperti kandungan dan manfaat dari tanaman tersebut dengan adanya penelitian (al Maraghi, 1992). Allah telah menjelaskan dalam surat asy Syuara ayat 7: AΟƒÍx. 8l ρy Èe ä. ÏΒ$pκÏù$oΨ Gu;/Ρr& ö/x. ÇÚö F{$# n<î) (# ρttƒ Νs9uρr& Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, berapakah banyaknya tumbuhan di bumi itu berbagai macam tumbuh-tumbuhan yang baik?.

20 Shihab (2002), Surat asy Syuara ayat 7 menjelaskan tentang tumbuhan yang baik, tumbuhan yang baik adalah tumbuhan yang subur dan memberikan manfaat untuk makhluk hidup, termasuk tumbuhan yang bisa digunakan sebagai alternatif pengawet secara alami. Dengan aneka tumbuhan, tanah dan aneka keajaiban yang terhampar pada tumbuhannya, maka sebagai seorang mukmin harus berfikir tentang manfaat dari bagian tumbuhan tersebut. Bagian daun belimbing wuluh banyak mengandung senyawa tanin yang dapat digunakan sebagai antibakteri (Abdul, 2008). Senyawa tanin merupakan senyawa polifenol yang berada di tumbuhan, makanan dan minuman (Makkar and Becker, 1998) dapat larut dalam air dan pelarut organik (Haslam, 1996). Senyawa tanin yang terkandung dalam daun belimbing wuluh bersifat penolak hewan pemakan tumbuhan. Senyawa tanin juga digunakan untuk proses tanning atau penyamakan kulit binatang yang digunakan industri kulit, untuk pembuatan tinta, digunakan untuk obat-obatan sebagai astringen dan untuk pewarnaan (cat) (Ledder, 2000). Secara kimia tanin tumbuhan dibagi menjadi dua golongan yaitu tanin terhidrolisis dan tanin terkondensasi. Tanin terhidrolisis mengandung ikatan ester yang dapat terhidrolisis jika dididihkan dalam asam klorida encer. Asam elagat merupakan hasil sekunder yang terbentuk pada hidrolisis beberapa tanin yang sesungguhnya merupakan ester asam heksaoksidifenat. Tanin terkondensasi merupakan senyawa tidak berwarna yang terdapat pada seluruh dunia tumbuhan tetapi terutama pada tumbuhan berkayu. Tanin terkondensasi telah banyak ditemukan dalam tumbuhan paku-pakuan (Robinson, 1995).

21 Kadar tanin yang tinggi pada simplisia daun belimbing wuluh muda 1,6 % dan pada daun belimbing wuluh tua sebesar 1,28 % (Nurliana, 2006). Lidyawati (2006) menjelaskan dalam penelitiannya bahwa kadar tanin pada daun belimbing wuluh sebesar 26,2 %. Isolasi tanin dari daun belimbing wuluh dapat dilakukan dengan pengambilan daun belimbing wuluh sekitar 20 cm dari pucuk daun, sehingga tanpa merusak pertumbuhan dapat diperoleh tanin dari daunnya (Amnur, 2008). Pansera (2004) menyatakan bahwa proses yang digunakan untuk mengekstrak tanin adalah ekstraksi superkritikal fluida. Namun, hasil yang diperoleh dari proses ini tidak memperoleh hasil yang baik. Uji coba mengekstrak tanin dengan ekstraksi soxhlet menggunakan beberapa pelarut diantaranya etanol, dimetil eter, dan n-heksan, hasil percobaan yang dipantau dengan KLT menunjukkan bahwa dimetil eter dan n-heksan tidak dapat melarutkan senyawa tanin, sedangkan etanol dapat melarutkan senyawa tanin. Tanin yang diperoleh dilihat dari harga Rf dari noda-noda yang terbentuk. Menurut Harborne (1987) tanin dapat diisolasi dari daun belimbing wuluh menggunakan metode maserasi, sedangkan cara terbaik untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa fenol adalah dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dapat digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar untuk uji identifikasi (Townshend, 1995). Nuraini (2002) menyatakan hasil isolasi dan identifikasi tanin dari daun gamal (Gliricidia sepium (jackquin) kunth ex walp.) dengan metode KLT dengan

22 fase gerak asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat (forestal) dengan perbandingan (30:10:3) harga R f tanin 0,7 yang mendekati nilai R f tanin standar yaitu 0,737. Sedangkan Yuliani, dkk (2003) dalam penelitian tentang kadar tanin dan quersetin tiga tipe daun jambu biji (Psidium guajava) dengan KLT dengan eluen toluen:etil asetat (3:1) menunjukkan 9 bercak dengan harga Rf mulai dari 0,23-0,94. Mengingat potensi senyawa tanin dan tingginya kandungan tanin dalam tanaman belimbing wuluh, maka menarik untuk dilakukan pemisahan senyawa tanin dari daun belimbing wuluh dengan metode maserasi, kemudian dengan kromatografi lapis tipis kualitatif dan preparatif. Identifikasi senyawa-senyawa tanin dilakukan dengan spektrofotometri UV-Vis dan diperkuat dengan pereaksi geser serta didukung dengan spektrum IR. 1.2 Rumusan Masalah 1. Eluen apakah yang paling baik dalam pemisahan ekstrak kasar senyawa tanin dari daun belimbing wuluh (A. bilimbi L.) dengan metode kromatografi lapis tipis? 2. Jenis senyawa tanin apa yang terdapat dalam ekstrak daun belimbing wuluh hasil pemisahan dengan kromatografi lapis tipis? 1.3 Tujuan Penelitian 1. Mengetahui eluen terbaik dalam pemisahan ekstrak kasar senyawa tanin dari daun belimbing wuluh (A. bilimbi L.) dengan metode kromatografi lapis tipis.

23 2. Mengetahui jenis senyawa tanin yang terdapat dalam ekstrak daun belimbing wuluh hasil pemisahan dengan kromatografi lapis tipis. 1.4 Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah kepada masyarakat terhadap pemanfaatan daun belimbing wuluh (A. bilimbi L.) sebagai alternatif penghasil senyawa tanin yang digunakan sebagai pemberdayaan atau usaha pembuatan pengawet ikan, sehingga mempermudah pengkajian lebih lanjut tentang aktivitas dan pemanfaatan senyawa tanin dalam bidang industri. 1.5 Batasan Masalah 1. Sampel yang digunakan adalah daun belimbing wuluh yang masih muda sekitar 20 cm dari pucuk daun yang diperoleh dari Jl. Kerto Malang. 2. Identifikasi senyawa tanin menggunakan spektrofometer UV-Vis dan FTIR.

24 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Tanaman Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dalam Perspektif Islam Beraneka ragam tanaman yang terhampar di muka bumi dengan air hujan. Tanaman yang tumbuh yaitu tanaman yang bermula dari tanah yang gersang melalui hujan yang diturunkan Allah, mulai dari tumbuhan tingkat rendah sampai tumbuhan tingkat tinggi. Tumbuhan tingkat tinggi yaitu tumbuhan yang mempunyai akar, batang dan daun secara jelas. Hal ini telah dijelaskan dalam firman Allah surat at Thaha ayat 53 [!$tβ Ï!$yϑ 9$# z ÏΒ tαt Ρr&uρ Wξç7ß $pκïù öνä3s9 y7n=y uρ #Y ôγtβ uúö F{$# ãνä3s9 Ÿ yèy_ Ï%!$# 4 Lx ;N$t7 Ρ ÏiΒ%[` uρø r& ÿ ϵÎ/ $oψô_t zr'sù "Yang telah menjadikan bagimu bumi sebagai hamparan dan yang telah menjadikan bagimu di bumi itu jalan-jalan, dan menurunkan dari langit air hujan. Maka Kami tumbuhkan dengan air hujan itu berjenis-jenis dari tumbuhtumbuhan yang bermacam-macam". Menurut tafsir al Mishbah surat at Thaha ayat 53 menjelaskan bahwa Allah memberikan kepada tiap-tiap sesuatu bentuk kejadiannya, kemudian memberinya petunjuk serta mengaitkannya dengan jawaban Nabi Musa as tentang keluasan ilmu Allah. Allah menempatkan manusia di bumi dengan menghamparkannya agar mereka dapat menikmati hidup dan berakal guna meraih kehidupan yang lebih mulia dan tinggi. Allah menjadikan manusia di bumi ini agar ia menyadari bahwa ada jarak antara ia dan tujuan hidupnya. Ada jalan yang harus ditempuhnya guna mencapai tujuan hidup. Kata salaka dalam surat Thaha

25 ayat 53 berarti jalan, Sedangkan kata as subul bentuk jamak dari sabil yang berarti jalan. Jalan yang dimaksud disini adalah suatu perilaku kata kerja yang dilakukan manusia untuk memikirkan segala hal tentang kekuasaan Allah. Kata thariq berarti jalan yang bersifat kata benda, dapat diartikan sebagai cara yang dilakukan untuk memikirkan kekuasaan Allah. Tafsir al Mishbah juga menjelaskan bahwa Allah menurunkan air dari langit berupa air hujan dan menumbuhkan tumbuh-tumbuhan yang bermacammacam dengan perantara air tersebut. Air hujan mengandung banyak senyawa kimia yang dibutuhkan tumbuhan, salah satunya adalah nitrogen. Atmosfir terdiri 78 % volume unsur nitrogen dan merupakan suatu persediaan yang tidak ada habis-habisnya untuk unsur penting ini. Molekul nitrogen sangat stabil, oleh karena itu pemutusan menjadi atom-atomnya untuk bereaksi dengan bahan kimia membentuk senyawa organik atau anorganik nitrogen merupakan langkah yang terbatas dalam siklus. Ini dapat terjadi dengan proses berenergi tinggi dalam penyinaran cahaya yang menghasilkan nitrogen oksida. Unsur nitrogen dapat terlibat dalam bentuk ikatan kimia atau fiksasi oleh proses biokimia dengan perantara mikroorganisme. Nitrogen biologis dapat dirubah mejadi bentuk anorganik pembusukan atau penguraian biomassa. Sejumlah besar dari nitrogen difiksasi secara sintetik di bawah temperatur tinggi dan juga tekanan tinggi melalui reaksi: N H 2 2 NH 3

26 3 4 Produksi dari gas-gas N 2 dan N 2 O oleh mikroorganisme dan evolusi dari gas-gas ini ke dalam atmosfer menyempurnakan siklus nitrogen melalui suatu proses denitrifikasi. Denitrifikasi suatu proses yang penting di alam, yaitu suatu mekanisme dimana hasil fiksasi nitrogen dikembalikan ke dalam atmosfer (Achmad, 2004). Air hujan yang mengandung nitrogen meresap dalam tanah, kemudian diserap oleh tumbuhan sebagai nutrisi yang sangat penting dalam pertumbuhan. Dari air hujan tersebut mengurai aneka tumbuhan dengan beberapa tingkatan dan jenis tumbuhan yaitu mulai dari tingkat rendah sampai ketingkat tinggi, jenis tumbuhan berkeping dua (dikotil) dan tumbuhan berkeping satu (monokotil) (Shihab, 2002) Salah satu contoh tanaman yang jelas bagian akar, batang dan daunnya adalah belimbing wuluh. Tanaman ini dapat dimanfaatkan sebagai obat diantaranya bagian batang, daun dan buahnya. Setiap tanaman bisa dimanfaatkan seperti firman Allah SWT dalam surat al An am ayat 99 çµ ΨÏΒ $oψô_t zr'sù & ó x«èe ä. N$t7tΡ ÏµÎ/ $oψô_t zr'sù [!$tβ Ï!$yϑ 9$# z ÏΒ tαt Ρr& ü Ï%!$# θèδuρ ô ÏiΒ ;M Ψy_uρ πušïρ#yš β#uθ ΖÏ% $yγïèù=sû ÏΒ È Ζ9$# z ÏΒuρ $Y6Å2#utI Β ${6ym çµ ΨÏΒ ßlÌøƒ Υ #ZÅØyz ÿ ϵÏè ΖtƒuρtyϑøOr&!#sŒÎ) ÿ ÍνÌyϑrO4 n<î) (#ÿρãýàρ$# >µî7 t±tfãβ uöxîuρ$yγî6okô±ãβ tβ$ Β 9$#uρtβθçG ƒ 9$#uρ 5>$oΨôãr& tβθãζïβ σム5Θöθs)Ïj9 ;M tƒuψ öνä3ï9 sœ Îû βî) Dan Dialah yang menurunkan air hujan dari langit, lalu kami tumbuhkan dengan air itu segala macam tumbuh-tumbuhan Maka kami keluarkan dari tumbuh-tumbuhan itu tanaman yang menghijau. kami keluarkan dari tanaman yang menghijau itu butir yang banyak; dan dari mayang korma mengurai tangkai-tangkai yang menjulai, dan kebun-kebun anggur, dan (Kami keluarkan

27 pula) zaitun dan delima yang serupa dan yang tidak serupa. perhatikanlah buahnya di waktu pohonnya berbuah dan (perhatikan pulalah) kematangannya. Sesungguhnya pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman. Surat al An'am ayat 99 menggambarkan bentuk luar dari tumbuhan yang merupakan obyek kajian morfologi tumbuhan. Salah satu morfologi yang ditunjukkan dari ayat tersebut yaitu mayang kurma yang mengurai dari tangkaitangkai yang menjulai adalah ciri-ciri morfologi tumbuhan kurma. Surat al An'am ayat 99 juga menggambarkan morfologi tumbuhan yang berupa daun yaitu fa akhrajna minhu khadhiran (kami keluarkan dari daun-daun yang menghijau) yaitu Allah SWT mengeluarkan dari tanaman tersebut daun yang menghijau (ash Shiddieqy, 2000). Bagian tumbuhan yang nampak dari kejauhan adalah daun yang biasanya berwarna hijau. Walaupun semua daun kelihatan hijau, tetapi secara morfologi masing-masing daun berbeda dari berbagai sisi. Daun belimbing wuluh yang muda lebih lembut dan memiliki rambut halus sedangkan daun yang sudah tua memiliki warna hijau yang lebih tua dan kaku serta kandungan dan manfaatnya berbeda. Seperti dalam surat asy Syuara ayat 7 AΟƒÍx. 8l ρy Èe ä. ÏΒ $pκïù$oψ Gu;/Ρr& ö/x. ÇÚö F{$# n<î)(# ρttƒ öνs9uρr& "Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, berapakah banyaknya kami tumbuhkan di bumi itu pelbagai macam tumbuh-tumbuhan yang baik?" Berbagai tanaman yang tumbuh dengan adanya air hujan yang mengalir ke tanah yang gersang tersebut menyebabkan tanaman tersebut menjadi tanaman yang baik yaitu tanaman yang memiliki nilai manfaat yang sangat besar. Mulai dari akar, batang, daun dan buahnya bisa dimanfaatkan secara maksimal (Shihab, 2002). Salah satu contoh tanaman yang baik adalah tanaman belimbing wuluh.

28 Mulai dari akar, batang, daun dan buahnya bisa dimanfaatkan sebagai obat dan pengawet alami. 2.2 Tanaman Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dalam Perspektif Ilmu Pengetahuan Belimbing wuluh merupakan tanaman yang termasuk dari keluarga Oxalidaceae. Belimbing wuluh (A. Bilimbi L.) dikenal sebagai tanaman pekarangan yang berbunga sepanjang tahun. Belimbing wuluh memiliki pohon kecil, dengan tinggi mencapai 10 m dengan batang yang tidak begitu besar dan mempunyai garis tengah hanya sekitar 30 cm. belimbing wuluh ditanam sebagai pohon buah, ada yang tumbuh secara liar dan kebanyakan berada di daerah dataran rendah dengan ketinggian 500 meter di atas permukaan laut (Arland, 2006). Belimbing wuluh mempunyai batang kasar berbenjol-benjol, percabangan sedikit, arahnya condong ke atas, cabang muda berambut halus seperti beludru, warnanya coklat muda. Daun belimbing wuluh berupa daun majemuk menyirip ganjil dengan pasang anak daun. Anak daun bertangkai pendek, bentuknya bulat telur sampai jorong, ujung runcing, pangkal membundar, tepi rata, panjang 2-10 cm, lebar 1-3 cm, warnanya hijau, permukaan bawah hijau muda. Bunga belimbing wuluh kecil-kecil berbentuk bintang warnanya ungu kemerahan, berkelompok, keluar dari batang atau percabangan yang besar. Buah belimbing wuluh berbentuk bulat lonjong bersegi, panjang sekitar 4-6 cm, warnanya hijau kekuningan, bila sudah masak banyak mengandung air, rasanya asam. Biji belimbing wuluh berbentuk bulat telur, gepeng (Arland, 2006).

29 Terdapat dua varietas dari tumbuhan belimbing wuluh (A. bilimbi L.) yaitu yang menghasilkan buah berwarna hijau dan kuning muda atau sering pula dianggap berwarna putih (Thomas, 2007). Gambar 2.1 Daun belimbing wuluh Klasifikasi ilmiah tanaman belimbing wuluh adalah (Dasuki, 1991) Kingdom : Plantae (tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (berpembuluh) Superdivisio : Spermatophyta (menghasilkan biji Divisio Kelas Sub-kelas Ordo Familia Genus Spesies : Magnoliophyta (berbunga) : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) : Rosidae : Geraniales : Oxalidaceae (suku belimbing-belimbingan) : Averrhoa : Averrhoa bilimbi L

30 2.2.1 Manfaat Daun Belimbing Wuluh Belimbing Wuluh (A. bilimbi L.) banyak ditanam sebagai pohon buah. Tanaman asal Amerika tropis ini dapat digunakan untuk mengobati bermacammacam penyakit. Orang mengambil manfaat belimbing wuluh selama ini hanya sebagai sirup, manisan, atau bumbu masak, padahal secara tradisional tanaman ini banyak dimanfaatkan mengatasi berbagai penyakit seperti batuk, diabetes, rematik, gondongan, sariawan, sakit gigi, gusi berdarah, jerawat sampai tekanan darah tinggi, selain itu juga bisa menyembuhkan kelumpuhan, memperbaiki fungsi pencernaan, radang rektum (Arland, 2006). Daun belimbing wuluh digunakan masyarakat Aceh sebagai penyedap rasa yang disebut asam sunti, selain itu mereka juga menggunakan air belimbing wuluh yang diperoleh dari proses pembuatan asam sunti itu untuk bahan alternatif mengawetkan ikan dan daging (Abdul, 2008). Arifiyani (2007) menyatakan bahwa air daun belimbing wuluh dapat mengobati penyakit stroke karena ekstrak daun belimbing wuluh mengandung senyawa tanin, selain itu daun belimbing wuluh dapat dimanfaatkan sebagai obat sakit perut, rematik, perotitis dan obat batuk. Daun belimbing wuluh berkhasiat untuk mengurangi rasa sakit atau nyeri dan pembunuh kuman serta dapat menurunkan kadar gula darah (Arland, 2006). Daun belimbing wuluh dapat melancarkan pengeluaran empedu, anti radang, pereda nyeri (analgesik), astringen (Dalimarta, 2008).

31 2.2.2 Kandungan Kimia Daun Belimbing Wuluh Arland (2006) menyatakan bahwa daun belimbing wuluh mengandung senyawa metabolit sekunder diantaranya senyawa tanin, selain itu daun belimbing wuluh juga mengandung sulfur, asam format. Faharani (2009) menunjukkan bahwa ekstrak daun belimbing wuluh mengandung flavonoid, saponin dan tanin. Dalimarta (2008) menjelaskan bahwa di dalam daun belimbing wuluh selain tanin juga mengandung peroksidase, kalsium oksalat dan kalium sitrat. Bahan aktif pada daun belimbing wuluh yang dapat dimanfaatkan sebagai obat adalah tanin. 2.3 Tanin Tanin merupakan suatu nama deskriptif umum untuk satu grup substansi fenolik polimer yang mampu menyamak kulit atau mempresipitasi gelatin dari cairan, suatu sifat yang dikenal sebagai astringensi. Tanin ditemukan hampir di setiap bagian dari tanaman; kulit kayu, daun, buah, dan akar (Hagerman, 1998). Tanin dibentuk dengan kondensasi turunan flavan yang ditransportasikan ke jaringan kayu dari tanaman, tanin juga dibentuk dengan polimerisasi unit quinon (Anonymous, 2005). HO O Gambar 2.2 Struktur inti tanin (Robinson, 1995)

32 Secara struktural tanin adalah suatu senyawa fenol yang memiliki berat molekul besar yang terdiri dari gugus hidroksi dan beberapa gugus yang bersangkutan seperti karboksil untuk membentuk kompleks kuat yang efektif dengan protein dan beberapa makromolekul (Horvart, 1981). Sebagai salah satu tipe dari senyawa metabolit sekunder, tanin mempunyai karakteristik sebagai berikut (Giner-Chavez, 2001): - Senyawa oligomer dengan satuan struktur yang bermacam-macam dengan gugus fenol bebas - Berat molekul antara 500 sampai Larut dalam air, dengan pengecualian beberapa struktur yang mempunyai berat molekul besar - Mampu berikatan dengan protein dan terbentuk kompleks tanin-protein yang larut dan tidak larut. Secara kimia terdapat dua jenis tanin yang tersebar tidak merata dalam dunia tumbuhan yaitu tanin terkondensasi (Proantosianidin) dan tanin terhidrolisis (Hydrolyzable tannin) (Harborne, 1987). Kedua golongan tanin menunjukkan reaksi yang berbeda dalam larutan garam Fe (III). Tanin terkondensasi menghasilkan warna hijau kehitaman sedangkan tanin terhidrolisis memberikan biru kehitaman (Etherington, 2002) Tanin Terkondensasi Tanin terkondensasi secara biosintesis dapat dianggap terbentuk dengan cara kondensasi katekin tunggal (galokatekin) yang membentuk senyawa dimer

33 dan kemudian oligomer yang lebih tinggi. Proantosianidin merupakan nama lain dari tanin terkondensasi karena jika direaksikan dengan asam panas, beberapa ikatan karbon penghubung satuan terputus dan dibebaskanlah monomer antosianidin (Harborne, 1987). Proantosianidin didefinisikan sebagai oligo atau polimer flavonoid (flavan-3-ol atau flavan-3-4-diol), dimana ikatan C-C tidak mudah untuk dihidrolisis (Etherington, 2002). Proantosianidin lebih banyak terdistribusi daripada tanin terhidrolisis, merupakan oligomer atau polimer satuan flavonoid (misalnya flavan-3-ol) yang terikat oleh ikatan karbon-karbon yang tidak mudah terpecah dengan adanya hidrolisis (Giner-Chavez, 2001). Proantosianidin dapat dideteki langsung dalam jaringan tumbuhan hijau dengan mencelupkan ke dalam HCl 2M mendidih selama setengah jam. Bila terbentuk warna merah yang dapat diekstraksi dengan amil atau butil alkohol, maka ini merupakan bukti adanya senyawa tersebut (Harborne, 1987). R HO O R' R" Gambar 2.3 Struktur Flavan-3,4-diol (Hagerman,1998)

34 HO O R Gambar 2.4 Struktur Flavan- 4-ol (Hagerman, 1998) Tanin Terhidrolisis Tanin terhidrolisis merupakan molekul dengan poliol (umumnya D- glikosa) sebagai pusatnya. Tanin terhidrolisis adalah pecahnya karbohidrat dan asam fenolik oleh asam lemah atau basa lemah (Hagerman, 1998). Gugus hidroksi pada karbohidrat sebagian atau semuanya teresterifikasi dengan gugus karboksil pada asam gallat (gallotanin) atau asam ellagat (ellagitanin). Tanin terhidrolisis biasanya sedikit terdapat dalam tanaman (Giner-Chavez, 2001) Gallotanin Gallotanin terbentuk dari asam gallat dan gula, biasanya glukosa. Beberapa asam gallat terikat pada satu molekul gula. Asam gallat mungkin terikat bersama pada gugus ester yang terbentuk antara gugus karboksil molekul satu dan gugus hidroksi pada molekul lain (Luchner, 1984 dalam skripsi Nuraini, 2002). Sifat fisik dari gallotanin berupa polimer amorf, berwarna putih kekuningan, mempunyai bau spesifik, dapat larut dalam air, gliserol, dan sangat larut dalam alkohol, aseton. Gallotanin tidak larut dalam benzen, kloroform, eter dan petroleum eter, karbon disulfida, karbon tetraklorida (Gohen, 1976). Sifat kimia dari gallotanin adalah berwarna coklat jika terkena cahaya, dengan albumin, tepung, gelatin, alkaloid dan garam metalik memberikan endapan yang tidak larut, sedangkan dengan FeCl 3 memberikan warna biru

35 kehitaman, pada suhu 215 C akan terdekomposisi menjadi pirogalol dan CO 2 (Tyler, 1947). Gallotanin merupakan suatu ester dimana dalam larutan gugus karbonil dari gugus esternya dapat diprotonkan, kemudian karbon yang bermuatan positif parsial dapat diserang oleh nukleofil lemah seperti air. Untuk reaksi hidrolisis dengan katalisis asam dalam air berlebih dan panas maka suatu ester menjadi asam karboksilat. Kelebihan air akan menggeser kesetimbangan ke arah sisi asam karboksilat (Solomons, 1976). Mekanisme reaksi hidrolisis ester berkatalis asam mempunyai tahap-tahap yaitu tahap protonasi, adisi H 2 O, kemudian eliminasi R yang disusul dengan deprotonasi. Mekanisme reaksinya adalah sebagai berikut:

36 HO O HO C OR HO Gallotanin R= glikosida HO HO HO HO HO HO + H + C C H + OR - H+ OR -R HO HO HO HO HO HO HO HO HO H 2 O + C OR C OR + 2 C + HO HO HO HO HO HO HO O C HO HO asam galat C + -H + C O Gambar 2.5 Reaksi hidrolisis gallotanin (Solomons, 1976) Asam gallat (3,4,5 trihidroksibenzoat) merupakan senyawa turunan dari aromatik karboksilat, dengan berat molekul 170,12, mempunyai titik didih 200 C, titik leleh 110 C, sedikit larut dalam air panas, alkohol, etil asetat, gliserol. Asam gallat tidak larut dalam benzena, kloroform, petroleum eter, dengan FeCl 3 memberikan warna biru kehitaman (Tyler, 1947).

37 Ellagitanin Ellagitanin terbentuk dari asam heksahidroksi difenil yang mungkin terbentuk dari terikatnya dua molekul asam gallat melalui reaksi oksidasi (Fieser, 1961). Ellagitanin merupakan jenis tanin yang terhidrolisis. Hidrolisis dengan asam kuat akan menghasilkan asam ellagat. Asam ellagat memberikan reaksi warna spesifik dengan adanya asam nitrit (HNO 2 ). Reaksi ini digunakan mendeteksi jaringan tumbuhan yang terekstrak dan merupakan metode yang penting dalam penentuan ellagitanin (Bate, 1972). Dalam penentuan ellagitanin diperlukan reaksi warna dengan asam nitrat dalam lingkungan nitrogen, dimana akan memberikan warna merah yang lama kelamaan berubah menjadi biru. Bila ada udara dilingkungannya maka lama kelamaan berubah menjadi kuning (Bate, 1972). Reaksi hidrolisis dari ester ellagitanin dalam katalis asam menjadi asam ellagat adalah sebagai berikut:

38 HO HO O C OR 2H + HO HO + C OR RO C HO RO C HO O + H 2 O HO HO O C OR -2H+ HO HO HO + C OR RO C O RO C + HO HO O C OR -2R HO HO + O C RO C O C O + -2H + HO O O C HO C O O asam ellagat Gambar 2.6 Reaksi hidrolisis ellagitanin (Solomons, 1976) Asam ellagat membentuk kristal jarum hijau kuning dengan piridin, meleleh pada 360 C, tidak larut dalam eter, sedikit larut dalam air dan larut dalam alkali/ basa dengan warna kuning yag kuat. Asam ellagat mewarnai katun chrominum-mordant hijau pudar (Fieser, 1961).

39 2.4 Ekstraksi Daun Belimbing Wuluh Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara berturut-turut mulai dengan pelarut non polar (n-heksan) lalu pelarut yang kepolarannya menengah (diklor metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang bersifat polar (metanol atau etanol) (Harborne, 1987). Ekstraksi digolongkan ke dalam dua bagian besar berdasarkan bentuk fase yang diekstraksi yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair padat, ekstraksi cair padat terdiri dari beberapa cara yaitu maserasi, perkolasi dan ekstraksi sinambung (Anonymous, 2009). Dalam metode ekstraksi bahan alam, dikenal suatu metode maserasi. Maserasi merupakan metode ekstraksi yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam sampel dalam pelarut organik. Pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif sehingga zat aktif akan larut. Karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Keuntungan metode ekstraksi ini, adalah metode dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan (Cheong, et.al, 2005). Metode maserasi merupakan salah satu metode ektraksi bahan alam yang menggunakan lemak panas, akan tetapi lemak-lemak panas itu telah diganti dengan pelarut-pelarut organik yang mudah menguap. Penekanan utama pada

40 maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan jaringan yang diekstraksi (Guether, 1987). Hagerman (1998), mengekstraksi tanin dari daun sorghum dengan metanol yang mengandung 10 mm asam askorbat, penambahan asam askorbat berfungsi sebagai antioksidan setiap ekstraksinya, kemudian diekstrak dengan etil asetat dan lapisan air (bawah) yang digunakan. Tanin dapat diekstrak dengan aseton 70 %, lebih efektif dalam mengekstraksi daripada pelarut alkohol. Hal ini dikarenakan aseton menghambat interaksi tanin dengan protein. Pada banyak tumbuhan, terdapat fraksi besar (kadang lebih besar dari 50 %) tanin yang tidak dapat diekstraksi (insoluble tannin), dimana fraksi yang tidak dapat diekstraksi karena efek nutrisi (Cannas, 2001). Ekstrak dengan air atau air dengan alkohol adalah langkah pertama dalam memproduksi tanin (Subiarto, 2002). Ibrahim, (2005) mengekstrak tanin dari buah kelapa sawit dengan metode maserasi menggunakan pelarut aseton dan air. Subyakto dan Prasetyo (2003) mengekstrak tanin dari kulit kayu akasia dengan air panas (100 C) selama 1 jam dengan perbandingan bahan dan pelarut 1:20, selain ekstrak dngan air panas, dilakukan dengan ekstraksi dengan larutan Na 0,3 % dengan prosedur yang sama. Malik (2009) memperoleh tanin dari kulit mangium kering dengan maserasi menggunakan air panas 70 C dan 90 C selama 4 jam dan dilakukan berulang-ulang sebanyak 9 kali. Olivina (2005) mengekstrak tanin dari kulit batang salam secara refluks dengan pelarut etanol dan air sebanyak tiga kali.

41 Sudarwanti (2004) mengekstrak tanin dari bulbus Allium salivum L dengan dua cara yaitu maserasi-perkolasi dengan pelarut etanol dan ekstraksi sinambung dengan alat soxhlet menggunakan pelarut yang mempunyai kepolaran meningkat yaitu n-heksan, metilen klorida, etil asetat dan metanol. Meiyanto (2008) mengekstrak tanin dari biji buah pinang dengan cara soxhlet dengan pelarut etanol 96 %. Tanin diekstrak dari daun kaliandra dengan menggerus daun bersama es kering dan ditambahkan dengan aseton 70 % yang mengandung asam askorbat 0,1 % (Abdurrahman, 1998). Luthana (2006) mengekstraksi senyawa fenol pada gambir dengan menggunakan metode maserasi. Dalam penelitiaanya sampel gambir yang dihaluskan sampai berukuran mesh ditimbang sebanyak 60 g dimasukkan dalam labu erlenmeyer 1 L dan ditambah pelarut 300 ml, diaduk selama satu jam untuk mencapai kondisi homogen dalam shaker waterbath. Selanjutnya, larutan dimaserasi selama 24 jam pada suhu kamar. Larutan dipisahkan dengan menggunakan kertas saring setelah 24 jam, residu dimaserasi ulang selama 24 jam lagi dan disaring dengan kertas saring, ulangan dilakukan sampai tiga kali. Filtrat pertama, kedua, dan ketiga digabung dan dievaporasi menggunakan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kering. 2.5 Pemisahan Senyawa Tanin dari Daun Belimbing Wuluh dengan Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan yang didasarkan pada distribusi differensial komponen-komponen yang dipisahkan diantara 2 fase, yaitu fase diam dengan permukaan yang luas dan fase gerak yang berupa zat cair

42 yang mengalir sepanjang fase diam. Komponen-komponen hasil pemisahan keluar dari kolom pada waktu yang berbeda. Komponen yang tertahan lebih kuat dalam kolom akan keluar dari kolom dengan waktu yang lebih lama dibandingkan komponen yang tidak tertahan dengan kuat atau bahkan tidak ditahan kolom sama sekali (Sastrohamidjojo, 2007). Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal), kemudian pelat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) dan selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Sudarmadji, 1996). Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi - pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat (Anonymous, 2008).

43 Yuliani (2003) memisahkan senyawa tanin dari 3 daun jambu biji yang berbeda dengan eluen toluen : etil asetat (3:1) dengan pendeteksi besi sulfat menghasilkan harga R f untuk ekstrak I mempunyai 9 bercak dengan R f mulai dari 0,23-0,94, ekstrak II mempunyai 9 bercak dengan R f mulai dari 0,13-0,94, ekstrak III memberikan 5 bercak dengan R f mulai dari 0,16-0,59. Nuraini (2002) memisahkan senyawa tanin dengan menggunakan fasa gerak forestal (asam asetat glasial : air : asam klorida) (30:10:3) menghasilkan harga R f 0,7 yang mendekati harga R f standar yaitu 0,73. Olivina (2005) mengelusi dengan etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) dengan pendeteksi aluminium klorida 5 % menghasilkan 2 bercak berwarna merah muda dan jingga pada R f 0,39 dan 0,53, sedangkan Lidyawati (2006) mengelusi senyawa tanin dengan eluen metanol : etil asetat (4:1) dengan pendeteksi AlCl 3 1%. Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis dapat menggunakan harga R f meskipun harga R f dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga R f didefinisikan sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 2007): Harga R f = Jarak yang ditempuh senyawa...(2.1) Jarak yang ditempuh pelarut Pada gugus-gugus yang besar dari senyawa-senyawa yang susunannya mirip, seringkali harga R f berdekatan satu sama lainnya (Sastroshamidjojo, 2007). Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk tujuan kualitatif dan preparatif, KLT kualitatif digunakan untuk menganalisis senyawa-senyawa organik dalam jumlah kecil (misal menentukan jumlah kumpulan dalam campuran), menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT

44 preparatif atau kromatografi kolom, dan juga untuk mengidentifikasi komponen penyusun campuran melalui perbandingan dengan senyawa yang diketahui strukturnya. Sedangkan KLT preparatifnya digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah yang besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisis berikutnya (Townshend, 1995). 2.6 Identifikasi Senyawa Tanin Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis Ditekankan Pada Reaksi Geser Spektroskopi UV-Vis merupakan suatu metode identifikasi gugus fungsi dari sampel. Spektrum yang diabsorpsi oleh suatu senyawa adalah sejumlah sinar yang diserap oleh satu senyawa pada panjang gelombang tertentu. Untuk senyawa berwarna akan memiliki satu atau lebih penyerapan spektrum yang tertinggi di daerah spektrum tampak ( nm). Spektrum yang terserap pada ultra violet ( nm) dan daerah nampak terjadi karena adanya perubahan energi elektron terluar dari molekul yang disebabkan adanya ikatan atau bukan ikatan. Umumnya elektron yang berpindah tempat ini disebabkan adanya ikatan rangkap karbonkarbon atau pasangan nitrogen dengan oksigen (Sudarmadji, 1996). Biasanya cahaya tampak merupakan campuran dari cahaya yang mempunyai berbagai panjang gelombang, dari nm, seperti pada Tabel 2.1:

45 Tabel 2.1 Warna dan warna komplementer Panjang gelombang Warna Warna komplementer (nm) Violet (ungu) Hijau kekuningan Biru Kuning Biru kehijauan Jingga Hijau kebiruan Merah Hijau Ungu kemerahan Hijau kekuningan Ungu Jingga Biru kehijauan Merah Hijau kebiruan Ungu kemerahan Hijau Sumber: Sastrohamidjojo (2007) Transisi yang penting pada daerah ultraviolet dan tampak yaitu transisi n π * dan π π *, sedangkan transisi n σ * jarang terjadi (Fessenden and Fessenden, 1989). Transisi yang terjadi pada tanin yaitu transisi π π * akibat adanya ikatan rangkap terkonjugasi dan transisi n π * karena adanya elektron bebas. tanin mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi oleh karena itu menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah ultraviolet dan tampak (Harborne, 1987). Senyawa dengan ikatan rangkap terkonjugasi seperti tanin akan mengalami penyerapan radiasi pada panjang gelombang yang lebih besar dari 217 nm (Sastrohamidjojo, 2007). Spektrofotometer UV-Vis dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis senyawa tanin. Kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti tanin dapat ditentukan dengan menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan dan mengalami pergeseran puncak serapan yang terjadi. Metode ini secara tidak langsung juga berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metal yang terikat

46 pada salah satu gugus hidroksil fenol. Pereaksi geser yang biasa digunakan adalah NaOMe/Na, NaOAc, NaOAc/H 3 BO 3, AlCl 3 dan AlCl 3 /HCl (Markham, 1988) Identifikasi dengan Spektrofometer FTIR Pada analisis spektrokimia, spektrum radiasi elektromagnetik digunakan untuk menganalisis spesies kimia dan menelaah interaksinya dengan radiasi elektromagnetik. Dasar analisis spektroskopi adalah interaksi radiasi dengan spesies kimia. Daerah radiasi spektroskopi infra merah atau infrared spectroscopy (IR) berkisar pada bilangan gelombang cm -1, atau panjang gelombang 0, µm. Daerah yang paling banyak digunakan untuk berbagai keperluan praktis adalah cm -1 (2,5-1,5 µm). Daerah ini biasa disebut dengan daerah IR tengah (Khopkar, 1990). Ikatan-ikatan yang berbeda (C-C, C=C, C-O, O-H, N-H) mempunyai frekuensi vibrasi yang berbeda dan ikatan-ikatan tersebut dalam molekul organik dapat dideteksi dengan mengidentifikasi frekuensifrekuensi karakteristiknya sebagai pita serapan dalam spektrum IR (Sastrohamidjojo, 2007). Kegunaan yang paling penting dari spektroskopi inframerah adalah untuk identifikasi senyawa organik, karena spektrumnya sangat kompleks dan terdiri dari banyak puncak-puncak. Spektrum inframerah mempunyai sifat fisik dan karakteristik yang khas, artinya senyawa yang berbeda akan mempunyai spektrum yang berbeda dan kemungkinan dua senyawa mempunyai spektrum sama adalah sangat kecil (Hayati, 2007). Pada dasarnya Spektrofotometer FTIR (Fourier Trasform Infra Red) adalah sama dengan Spektrofotometer IR dispersi, yang membedakannya adalah

47 pengembangan pada sistem optiknya sebelum berkas sinar infra merah melewati sampel (Giwangkara, 2007). Spektrofotometer IR dispersi menggunakan prisma (grating) sebagai pengisolasi radiasi, sedangkan spektrofotometer FTIR menggunakan interferometer yang dikontrol secara otomatis dengan komputer. Jika sinar inframerah dilewatkan melalui sampel senyawa organik, maka terdapat sejumlah frekuensi yang diserap dan ada yang diteruskan atau ditransmisikan tanpa diserap. Serapan cahaya oleh molekul tergantung pada struktur pada struktur elektronik dari molekul tersebut. Molekul yang menyerap energi tersebut terjadi perubahan energi vibrasi dan perubahan tingkat energi rotasi (Suseno dan Firdausi 2008). Spektrofotometer FTIR (Fourier Trasform Infra Red) dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif (Hayati, 2007). Secara umum lebih baik digunakan bagan korelasi (correlation chart) untuk mengidentifikasi gugus fungsi hasil analisis IR (Khopkar, 1990). Analisis FTIR tanin standar, puncak utama yang dikenali adalah 768 cm -1, 782 cm -1, 794,5 cm -1, 822 cm -1, 1062 cm -1, 1110 cm -1, 1202 cm -1, 1250 cm -1, 1284 cm -1, 1350 cm -1, 1450 cm -1, 1520 cm -1, 1620 cm -1 dan 3423 cm -1 (Ibrahim, 2005). Senyawa tanin jika dianalisis dengan spektrofotometri inframerah akan mempunyai serapan yang spesifik, yaitu serapan di daerah frekuensi cm -1 dengan intensitas tajam akibat rentangan C-H aromatik, serapan lebar antara cm -1 akibat rentangan O-H, C=O keton pada cm -1 dan C-O eter pada cm -1 (Sastrohamidjojo, 1991). Senyawa aromatik mempunyai empat puncak serapan di daerah frekuensi cm -1, sekalipun belum tentu keempat-empatnya muncul (Noerdin, 1986). Hal ini diperkuat dengan hasil

48 penelitian dari Hayati dkk (2010) bahwa dalam daun belimbing wuluh terdapat senyawa tanin yang dapat dilihat dari beberapa gugus fungsi hasil analisis dengan spektrofotometer FTIR pada Gambar 2.7 dan Tabel 2.2 Gambar 2.7 Spektra inframerah ekstrak tanin (Hayati dkk, 2010)

49 Tabel 2.2 Nilai bilangan gelombang ekstrak tanin pada daun belimbing wuluh Puncak Bilangan gelombang ekstrak Jenis vibrasi Intensitas tanin (cm - ) ,7 Rentangan asimetri m-s ,1 Rentangan CH sp 3 m-w ,9 CO 2 (udara) w ,2 Rentangan C=C Overtone aromatik w ,0 C=O vs ,4 ; 1448, 1 ; 1404,0 Rentangan cincin aromatik s-m ,7 R-O-Ar (eter aromatik) s ,7 C-O alkohol sekunder s ,8 ; 668,8 ; 553,3 C-H out plane, p-substitusi w-m benzen ,7 ; 606,4 out of plane; o-subtitusi w-m benzen Keterangan: vs = very strong; s = strong; m = medium; w = weak Sumber : Hayati dkk (2010)

50 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Pelaksanaan Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober Februari 2010 di Laboratorium Organik dan Biotek Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang, Laboratorium Organik dan Instrumen Universitas Brawijaya Malang dan Laboratorium Instrumen Universitas Negeri Surabaya. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian Alat Penelitian Alat penelitian yang digunakan pada penelitian ini meliputi beaker glass dengan berbagai ukuran, gelas ukur dengan berbagai ukuran, corong pisah, labu ukur 100 ml, gelas arloji, timbangan mettler, vacum rotary evaporator, pengaduk kaca, waterbath, kertas saring, pipa kapiler, plat KLT silika G60 F 254, bejana pengembang, tabung reaksi, pipet tetes, seperangkat alat UV-Vis merk Shimadzu, seperangkat alat FTIR merk IR Buck M500 Scientific Bahan Penelitian Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun belimbing wuluh, dipilih daun muda yang segar dan diambil diujung ranting. Tanaman ini diperoleh dari daerah Kerto Malang - Jawa Timur. Bahan-bahan kimia yang

51 digunakan berderajat pa meliputi: aseton, akuades, asam askorbat 10 mm, kloroform, etil asetat, gelatin, formaldehid 3 %, natrium asetat, HCl pekat, FeCl 3 1 %, FeCl 3 5 %, toluen, ferri sulfat, asam asetat glasial, asam asetat, n-butanol, metanol, Na 2 M, AlCl 3 5 %, AlCl 3 1 %, H 3 BO 3, pelet KBr. 3.3 Tahapan Penelitian Pada penelitian ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yaitu: a. Preparasi sampel b. Ekstraksi tanin dengan metode maserasi c. Pencarian eluen terbaik senyawa tanin dengan kromatografi lapis tipis d. Fraksinasi tanin dengan kromatografi lapis tipis preparatif e. Identifikasi senyawa tanin dengan UV-Vis dan FTIR f. Analisis data 3.4 Rancangan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dengan rancang bangun penelitian eksperimental laboratorik. Proses ekstraksi dilakukan dengan pelarut aseton : air. Ekstrak dipisahkan menggunakan KLT dengan beberapa eluen, antara lain: toluen : etil asetat (3:1), forestal (asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat) (30:10:3), etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1), n-butanol : asam asetat : air (4:1:5), metanol : etil asetat (4:1), Etil asetat : Kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2). Eluen yang memberikan pemisahan paling baik akan digunakan dalam pemisahan

52 dengan KLT preparatif. Kemudian dilanjutkan dengan identifikasi menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan FTIR. 3.5 Cara Kerja Persiapan Sampel Daun belimbing wuluh yang muda dicuci bersih dengan air dan diiris kecil-kecil kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu ºC selama 5 jam dan diblender sampai diperoleh serbuk. Hasil yang diperoleh digunakan sebagai sampel penelitian (Nuraini, 2002) Ekstraksi Tanin dari Daun Belimbing Wuluh dengan Metode Modifikasi Nuraini (2002) Serbuk daun belimbing wuluh ditimbang sebanyak 50 gram kemudian direndam dengan 400 ml pelarut aseton : air (7:3) dengan penambahan 3 ml asam askorbat 10 mm. Ekstrak tanin dipekatkan dengan menggunakan vakum rotary evaporator dan pemanasan di atas waterbath pada suhu C. Cairan hasil ekstrak kemudian diekstraksi dengan kloroform (4x25 ml) menggunakan corong pisah sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan kloroform (bawah) dipisahkan dan lapisan air 1 (atas) diekstraksi dengan etil asetat (1x25 ml) dan terbentuk 2 lapisan. Lapisan etil asetat 1 (atas) dipisahkan dan lapisan air 2 (bawah) dipekatkan dengan vacum rotary evaporator.

53 3.5.3 Uji Kualitatif Ekstrak Daun Belimbing Wuluh dengan Reagen 1. Filtrat 1 (hasil ekstraksi aseton : air) dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing sebanyak 3 ml. Ekstrak pada tabung pertama direaksikan dengan 3 tetes larutan FeCl 3 1 %. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua. Pada tabung kedua ditambahkan dengan larutan gelatin jika terbentuk endapan putih maka positif mengandung tanin. Pada tabung ketiga digunakan untuk membedakan tanin katekol dan galat dengan cara menambahkan ekstrak dengan formadehid 3 % : asam klorida (2:1) dan dipanaskan dalam air panas dengan suhu 90 ºC jika terbentuk endapan merah muda merupakan tanin katekol. Filtrat dipisahkan dengan disaring dan dijenuhkan dengan Na-Asetat dan ditambahkan FeCl 3 1 % adanya tanin galat ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tinta atau hitam. 2. Lapisan air 1 dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing sebanyak 3 ml. Ekstrak pada tabung pertama direaksikan dengan 3 tetes larutan FeCl 3 1 %. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua. Pada tabung kedua ditambahkan dengan larutan gelatin jika terbentuk endapan putih maka positif mengandung tanin. Pada tabung ketiga digunakan untuk membedakan tanin katekol dan galat dengan cara menambahkan ekstrak dengan formadehid 3 % : asam klorida (2:1) dan dipanaskan dalam air panas dengan suhu 90 ºC jika terbentuk endapan merah muda merupakan tanin katekol. Filtrat dipisahkan dengan disaring dan

54 dijenuhkan dengan Na-Asetat dan ditambahkan FeCl 3 1 % adanya tanin galat ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tinta atau hitam. 3. Lapisan air 2 dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing sebanyak 3 ml. Ekstrak pada tabung pertama direaksikan dengan 3 tetes larutan FeCl 3 1 %. Jika ekstrak mengandung senyawa tanin akan menghasilkan warna hijau kehitaman atau biru tua. Pada tabung kedua ditambahkan dengan larutan gelatin jika terbentuk endapan putih maka positif mengandung tanin. Pada tabung ketiga digunakan untuk membedakan tanin katekol dan galat dengan cara menambahkan ekstrak dengan formadehid 3 % : asam klorida (2:1) dan dipanaskan dalam air panas dengan suhu 90 ºC jika terbentuk endapan merah muda merupakan tanin katekol. Filtrat dipisahkan dengan disaring dan dijenuhkan dengan Na-Asetat dan ditambahkan FeCl 3 1 % adanya tanin galat ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tinta atau hitam Pemisahan Senyawa Tanin KLT Analitik Pada pemisahan dengan KLT analitik digunakan plat silika G 60 F 254 yang sudah diaktifkan dengan pemanasan dalam oven pada suhu 100 C selama 10 menit. Masing-masing plat dengan ukuran 1 cm x 10 cm. Ekstrak tanin ditotolkan pada jarak 1 cm dari tepi bawah plat dengan pipa kapiler kemudian dikeringkan dan dielusi dengan fase gerak toluen : etil asetat (3:1) dengan pendeteksi ferri sulfat (Yuliani, 2003 ), forestal (asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat) (30:10:3) (Nuraini, 2002), etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) dengan pendeteksi

55 aluminium klorida 5 % (Olivina, 2005), n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) (Sudarwanti, 2004), metanol : etil asetat (4:1) dengan pendeteksi AlCl 3 1 % (Lidyawati, 2006), etil asetat : kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2). Setelah gerakan larutan pengembang sampai pada garis batas, elusi dihentikan. Noda yang terbentuk masing-masing diukur harga R f nya, selanjutnya dengan memperhatikan bentuk noda pada berbagai larutan pengembang ditentukan perbandingan larutan pengembang yang paling baik untuk keperluan preparatif. Noda yang terbentuk diperiksa dengan lampu UV-Vis pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm KLT Preparatif Pada pemisahan dengan KLT preparatif digunakan plat silika G 60 F 254 dengan ukuran 10 cm x 20 cm. Ekstrak pekat hasil ekstraksi dilarutkan dengan aseton-air, kemudian ditotolkan sepanjang plat pada jarak 1 cm dari garis bawah dan 1 cm dari garis tepi. Selanjutnya dielusi dengan menggunakan eluen n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) yang memberikan pemisahan terbaik pada KLT analitik. Setelah gerakan larutan pengembang sampai pada garis batas, elusi dihentikan. Noda yang terbentuk masing-masing diukur harga R f nya. Noda-noda diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm Identifikasi Senyawa Tanin Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis Isolat-isolat yang diperoleh dari hasil KLT preparatif, dilarutkan dengan aseton : air dan disentrifuge kemudian dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis

56 merk Shimadzu. Masing-masing isolat sebanyak 2 ml dimasukkan dalam kuvet dan diamati spektrumnya pada bilangan gelombang nm. Identifikasi dilanjutkan dengan penambahan pereaksi geser Na 2 M, AlCl 3 5 %, AlCl 3 5 %/HCl, NaOAc, NaOAc/H 3 BO 3. Kemudian diamati pergeseran puncak serapannya. Tahapan kerja penggunaan pereaksi geser adalah sebagai berikut: a. Isolat yang dapat diamati pada panjang gelombang nm, direkam dan dicatat spektrum yang dihasilkan. b. Isolat dari tahap 1 ditambah 3 tetes Na 2 M kemudian dikocok hingga homogen dan diamati spektrum yang dihasilkan. Sampel didiamkan selama 5 menit dan diamati spectrum yang dihasilkan. c. Isolat dari tahap 1 kemudian ditambah 6 tetes pereaksi AlCl 3 5 % dalam metanol kemudian dicampur hingga homogen dan diamati spektrumnya. Sampel ditambah denga 3 tetes HCl kemudian dicampur hingga homogen dan diamati spektrumnya. d. Isolat dari tahap 1 ditambah serbuk natrium asetat kurang lebih 250 mg. Campuran dikocok sampai homogen menggunakan fortex dan diamati lagi spektrumnya. Selanjutnya larutan ini ditambah asam borat kurang lebih 150 mg dikocok sampai homogen dan diamati spektrumnya Identifikasi Gugus Fungsi Senyawa Tanin dengan Spektrofotometer FTIR Isolat hasil KLT preparatif yang diduga senyawa tanin diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometer FTIR. 0,2 g pelet KBr ditambahkan

57 dengan satu tetes isolat yang diduga senyawa tanin, dikeringkan kemudian diidentifikasi dengan spektrofotometer FTIR merk IR Buck M500 Scientific dengan panjang gelombang cm -1 dengan spesifikasi kondisi alat sebagai berikut: Scan : 32 det/scan Resolusi : 4 Tekanan : 80 Torr 3.6 Analisis Data Data yang diperoleh dianalisa secara deskriptif yaitu dengan memperhatikan pola pemisahan pada kromatogram dari berbagai eluen yang digunakan. Eluen terpilih pada KLT analitik adalah yang memberikan pemisahan yang baik (dilihat dari jumlah spot dan pola pemisahan), digunakan sebagai eluen pada KLT preparatif untuk pemisahan senyawa tanin. Identifikasi senyawa tanin dilakukan dengan memperhatikan bentuk umum spektrum UV-Vis sampel dalam aseton, perubahan spektrum yang disebabkan oleh berbagai pereaksi penggeser. Identifikasi gugus fungsional dapat diamati pada spektrum inframerah, sehingga dapat ditentukan jenis-jenis senyawa tanin yang terdapat dalam daun belimbing wuluh.

58 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Preparasi Sampel Daun Belimbing Wuluh Daun belimbing wuluh yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang masih muda, karena kadar tanin pada daun muda lebih tinggi dari pada tanin pada daun belimbing wuluh yang tua (Nurliana, 2006). Sampel sebanyak 250 g dicuci untuk menghilangkan pengotor seperti debu yang menempel pada daun. Sampel dipotong kecil-kecil dan dikeringkan. Pengeringan sampel dilakukan pada suhu C selama 5 jam untuk menghilangkan air dan mencegah terjadinya perubahan kimia (daun cepat busuk sehingga dapat menghasilkan mikroorganisme yang dapat merubah konformasi senyawaan kimia yang terkandung di daun tersebut). Sampel yang telah kering diblender untuk memperluas permukaan serta membantu pemecahan dinding dan membran sel, sehingga mempermudah d memaksimalkan proses ekstraksi. Sampel yang diperoleh adalah serbuk yang berwarna coklat kehijauan sebanyak 65 g (Lampiran 3). 4.2 Ekstraksi Senyawa Tanin dari Daun Belimbing Wuluh Ekstraksi merupakan proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda (Rahayu, 2009). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi maserasi. Maserasi adalah salah satu metode pemisahan senyawa dengan cara perendaman menggunakan pelarut organik pada temperatur ruangan. Proses ekstraksi ini tidak

59 dilakukan dengan metode soxhlet karena dikhawatirkan ada golongan senyawa tanin yang tidak tahan panas, selain itu senyawa tanin mudah teroksidasi pada suhu yang tinggi yaitu 98,89-101,67 o C. Proses maserasi sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena selain murah dan mudah dilakukan, dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel, sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut. Pelarut yang mengalir ke dalam sel dapat menyebabkan protoplasma membengkak dan bahan kandungan sel akan larut sesuai dengan kelarutannya (Lenny, 2006). Sampel ditimbang sebanyak 50 g kemudian direndam dengan 400 ml pelarut aseton:air yang mengandung 3 ml asam askorbat 10 mm selama 3 x 24 jam. Semakin lama waktu ekstraksi, kesempatan untuk bersentuhan makin besar sehingga hasilnya juga bertambah sampai titik jenuh larutan. Kontak antara sampel dan pelarut dapat ditingkatkan apabila dibantu dengan pengadukan. Pada penelitian ini dilakukan pengadukan dengan menggunakan shaker dengan kecepatan 150 rpm agar kontak antara sampel dan pelarut semakin sering terjadi, sehingga proses ekstraksi lebih sempurna. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah aseton dan air dengan perbandingan (7:3). Pemilihan pelarut ini karena senyawa tanin yang ada dalam belimbing wuluh merupakan senyawa yang bersifat polar. Suatu molekul bersifat polar apabila tersusun atas atom-atom yang berbeda dan molekul yang tersusun atas atom-atom yang sama. Kepolaran suatu molekul ditentukan oleh harga momen dipolnya (µ). Suatu molekul bersifat polar bila µ > 0 atau µ 0 dan nonpolar bila µ = 0 (Effendy, 2006). Robinson

60 (2005) menyatakan semakin banyak gugus hidroksil suatu senyawa fenol memiliki tingkat kelarutan dalam air dan pelarut polar semakin besar. Struktur senyawa tanin tersusun atas atom-atom yang berbeda dan tanin memiliki gugus hidroksi lebih dari satu dan memiliki momen dipol tidak sama dengan nol (µ 0) yang menyebabkan tanin bersifat polar, sehingga harus dilarutkan dengan pelarut yang bersifat polar. Didukung hasil penelititian Ummah (2010) bahwa dengan pelarut campuran aseton dan air didapatkan kadar tanin lebih banyak yaitu 10,92 %. Pemakaian pelarut campuran aseton dan air bertujuan untuk memaksimalkan ekstrak tanin. Pelarut aseton bisa meminimalkan interaksi antara tanin dengan protein sehingga tanin bisa terekstrak semua dalam fasa air dan protein bisa larut dalam aseton. Penambahan asam askorbat ke dalam pelarut bertujuan sebagai antioksidan, sehingga tidak terjadi oksidasi pada senyawa tanin pada saat proses ekstraksi. Maserat yang sudah didapat disaring untuk memisahkan residu dan filtrat. Filtrat yang diperoleh dipisahkan pelarutnya dengan menggunakan vacum rotary evaporator dengan suhu C. Vacum berfungsi untuk mempermudah proses penguapan pelarut dengan memperkecil tekanan dalam vacum dari pada di luar ruangan, sehingga temperatur di bawah titik didih pelarut dapat menguap. Filtrat yang diperoleh berwarna coklat pekat kehijauan. Warna coklat kehijauan terbentuk karena pelarut yang digunakan tidak hanya mengekstrak senyawa tanin melainkan juga mengekstrak klorofil yang ada dalam tumbuhan. Klorofil dalam tumbuhan memiliki dua sifat yaitu bersifat hidrofobik jika mengikat gugus CH 3 dan hidrofilik jika mengikat gugus CHO. Klorofil yang terdapat dalam daun

61 belimbing wuluh adalah klorofil yang bersifat hidrofobik, karena dilihat dari warna pada saat ekstrak dilarutkan dengan kloroform warnanya menjadi hijau. Hal ini dimungkinkan yang terlarut dalam kloroform adalah klorofil. Soekartono (1988) menjelaskan bahwa klorofil tidak dapat larut dalam air tetapi dapat larut dalam etanol, metanol, kloroform dan aseton. Filtrat hasil penyaringan difraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah dengan pelarut kloroform untuk memisahkan senyawa-senyawa nonpolar seperti klorofil, triterpen, lemak dan senyawa non polar lain. Penambahan kloroform sebanyak 25 ml dan diulang 4 kali untuk memisahkan senyawa nonpolar yang ada dalam ekstrak dan meningkatkan koefisien distribusi. Penambahan kloroform menyebabkan terbentuk dua lapisan yaitu lapisan atas (fasa air) yang berwarna coklat pekat dan lapisan bawah (fasa kloroform) berwarna hijau, karena kedua pelarut tersebut memiliki berat jenis dan kepolaran yang berbeda. Berat jenis kloroform lebih besar dari pada air sehingga lapisan kloroform berada di bagian bawah. Lapisan kloroform ditampung dan lapisan air difraksinasi lagi dengan pelarut etil asetat untuk memisahkan senyawa polifenol yang bersifat polar selain senyawa tanin seperti senyawa katekin, karena tanin sangat sedikit larut dalam etil asetat. Penambahan etil asetat menyebabkan terbentuknya 2 lapisan yaitu lapisan atas (fasa etil asetat) yang berwarna hijau muda yang dimungkinkan senyawa polar selain tanin yang terlarut dalam etil asetat dan lapisan bawah (fasa air) berwarna coklat pekat. Warna coklat pada lapisan air dimungkinkan dalam filtrat tersebut terdapat senyawa tanin. Robinson (1995) memperkuat pendapat di atas

62 dengan menyatakan bahwa tanin dapat larut dalam air dan pelarut yang bersifat polar dan menghasilkan warna coklat. Fasa air yang diperoleh dipekatkan dengan vacum rotary evaporator pada suhu C untuk memisahkan pelarutnya yaitu etil asetat yang terlarut dalam filtrat dan pelarut air, sehingga diperoleh ekstrak berwarna coklat tua. Untuk mendapatkan ekstrak pekat maka ekstrak yang diperoleh di pekatkan lagi dengan desikator dan diperoleh ekstrak pekat berwarna coklat tua dengan nilai rendemen sebesar 10,78 % (Lampiran 2). Filtrat dari masing-masing perlakuan di uji fitokimia dengan menggunakan reagen (Lampiran 3). 4.3 Uji Fitokimia Senyawa Tanin Uji fitokimia merupakan uji kualitatif untuk menduga adanya senyawa tanin pada ekstrak daun belimbing wuluh. Uji fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu menambah ekstrak dengan reagen seperti larutan FeCl 3 1 % yang hasil positifnya ditunjukkan dengan perubahan warna yaitu warna hijau kehitaman atau biru tinta. Uji fitokimia yang kedua yaitu dengan menambahkan gelatin dalam ekstrak dan ditunjukkan dengan adanya endapan putih. Reagen yang ketiga untuk membedakan antara tanin katekol dan tanin galat. Larutan formalin 3 % dan asam klorida (HCl) 1 N adalah larutan reagen yang digunakan untuk mengetahui adanya senyawa tanin katekol yang ditunjukkan dengan terbentuknya endapan merah muda, filtrat hasil uji tanin katekol direaksikan dengan FeCl 3 1 % menghasilkan warna biru tinta atau hitam yang menunjukkan adanya tanin galat (Lampiran 3).

63 4.3.1 Uji Fitokimia dengan Menggunakan FeCl 3 Uji fitokimia dengan menggunakan FeCl 3 digunakan untuk menentukan apakah sampel mengandung gugus fenol. Adanya gugus fenol ditunjukkan dengan warna hijau kehitaman atau biru tua setelah ditambahkan dengan FeCl 3, sehingga apabila uji fitokimia dengan FeCl 3 memberikan hasil positif dimungkinkan dalam sampel terdapat senyawa fenol dan dimungkinkan salah satunya adalah tanin karena tanin merupakan senyawa polifenol. Hal ini diperkuat oleh Harborne, (1987) cara klasik untuk mendeteksi senyawa fenol sederhana yaitu menambahkan ekstrak dengan larutan FeCl 3 1 % dalam air, yang menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru atau hitam yang kuat. Terbentuknya warna hijau kehitaman atau biru tinta pada ekstrak setelah ditambahkan dengan FeCl 3 karena tanin akan membentuk senyawa kompleks dengan ion Fe 3+, seperti yang terlihat pada Gambar 4.1.

64 FeCl O Senyawaan Tanin Cl Gambar 4.1 Reaksi yang diusulkan antara tanin dengan FeCl 3 1% Senyawa kompleks adalah senyawa yang pembentukannya melibatkan pembentukan ikatan kovalen koordinasi antara ion logam atau atom logam dengan atom non logam. Dalam pembentukan senyawa kompleks, atom atau ion logam disebut sebagai atom pusat, sedangkan atom yang mendonorkan elektronnya ke atom pusat disebut atom donor. Atom donor terdapat pada suatu ion atau molekul netral. Ion atau molekul netral yang memiliki atom-atom donor yang dikoordinasikan pada atom pusat disebut ligan. Suatu molekul dikatakan sebagai ligan jika atomnya memiliki pasangan elektron bebas, memiliki elektron tak berpasangan, atau atom yang terikat melalui ikatan π (Effendy,2007).

65 Hasil uji fitokimia ekstrak daun belimbing wuluh dengan FeCl 3 menghasilkan suatu warna hijau kehitaman, karena reaksi antara tanin dan FeCl 3 membentuk senyawa kompleks. Berdasarkan hal tersebut dapat diduga di dalam ekstrak daun belimbing wuluh mengandung senyawa polifenol yang diduga adalah senyawa tanin. Terbentuknya senyawa kompleks antara tanin dan FeCl 3 karena adanya ion Fe 3+ sebagai atom pusat dan tanin memiliki atom O yang mempunyai pasangan elektron bebas yang bisa mengkoordinasikan ke atom pusat sebagai ligannya. Ion Fe 3+ pada reaksi di atas mengikat tiga tanin yang memiliki 2 atom donor yaitu atom O pada posisi 4' dan 5' dihidroksi, sehingga ada enam pasangan elektron bebas yang bisa dikoordinasikan ke atom pusat. Atom O pada posisi 4' dan 5' dihidroksi memiliki energi paling rendah dalam pembentukan senyawa kompleks, sehingga memungkinkan menjadi sebuah ligan Uji Fitokimia Senyawa Tanin dengan Menggunakan Larutan Gelatin Uji fitokimia dengan menggunakan larutan gelatin merupakan mengujian awal untuk memperkuat dugaan adanya senyawa tanin dalam ekstrak daun belimibing wuluh. Harborne (1987) menyatakan bahwa semua tanin menimbulkan endapan sedikit atau banyak jika ditambahkan dengan gelatin. Soebagio (2007) menguji fitokimia senyawa tanin dari Ekstrak umbi bawang merah dengan melarutkan sedikit akuades kemudian dipanaskan di atas penangas air lalu diteteskan dengan larutan gelatin 1 % (1:1). Hasil positifnya yaitu terbentuknya endapan putih.

66 Berdasarkan hasil penelitian ekstrak daun belimbing wuluh dari pelarut aseton:air yang ditambah dengan gelatin menunjukkan adanya endapan putih yang jumlahnya banyak, sehingga hasil yang didapat positif mengandung tanin, seperti terlihat dalam reaksi di bawah ini: HO O Tanin O H HN H + HN C C CH3C H O C N O HN C H C CH 2 CH 2 NH C NH 2 NH 2 O C O HN HN H CH C C H Gelatin CH 2 CH 2 C O O O C N C O H H N CH C O N CH O HO HO O O HO O NH H C CH 3 C N H HO H C H O O C N O C HO N H C CH 2 CH 2 NH C NH 2 NH 2 O C H N CH H O C H N H O C C CH 2 CH 2 C O O N C O H H N CH C O N CH O Gambar 4.2 Reaksi yang diusulkan antara tanin dan gelatin (Leemensand, 1991) Reaksi antara tanin dan gelatin menghasilkan endapan berwarna putih. Reaksi ini melibatkan terjadinya ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen terjadi apabila atom hidrogen terikat oleh dua atau lebih atom lain yang memiliki keelektronegatifan tinggi seperti atom N, O dan F (Effendy, 2006). Ikatan hidrogen yang terjadi dalam reaksi di atas adalah ikatan hidrogen jenis

67 intermolekul, karena atom H yang terikat dengan atom O dan N berasal dari dua molekul. Atom H dari molekul tanin terikat dengan atom O pada gelatin dan atom H dari molekul gelatin terikat dengan atom O pada tanin. Apabila suatu protein bereaksi dengan senyawa kimia maka akan terjadi perubahan konformasi protein. Perubahan konformasi alamiyah menjadi konformasi yang tidak menentu merupakan suatu proses denaturasi yang berlangsung secara reversibel. Penggumpalan protein biasanya didahului oleh proses denaturasi yang berlangsung dengan baik pada titik isolistrik protein tersebut (Poedjiadi,1994) Uji Fitokimia Senyawa Tanin dengan Menggunakan Formalin 3 %, HCl 1 N, FeCl 3 1 % Uji fitokimia dengan menggunakan larutan formalin 3 %, HCl 1 N, FeCl 3 1 % merupakan uji awal untuk membedakan antara tanin katekol dan tanin galat. Tanin katekol ditunjukkan dengan adanya endapan merah muda jika ekstrak ditambah dengan larutan formalin 1 % dan HCl 1 N, sedangkan tanin galat ditunjukkan dengan warna biru tinta atau hitam jika filtrat hasil uji tanin katekol direaksikan dengan FeCl 3 1 %. Tanin merupakan senyawa fenol sehingga dapat berkondensasi dengan formaldehid. Hasil kondensasi tanin dengan formaldehid ditambahkan dengan asam panas yaitu asam klorida (HCl), maka beberapa ikatan karbon-karbon penghubung satuan terputus dan akan dibebaskan monomer antosianidin. Jika dalam suatu sampel mengandung senyawa protoantosianidin atau tanin katekol akan terbentuk warna merah jika direaksikan dengan HCl, sehingga apabila

68 ekstrak mengandung senyawa tanin katekol akan terbentuk endapan merah apabila direaksikan dengan Formalin : HCl dengan perbandingan 2:1 (Harborne, 1987). Filtrat hasil uji dengan formalin : HCl dipisahkan jika di dalam sampel setelah diuji terbentuk endapan merah dengan disaring dan ditambahkan FeCl 3 1 % untuk menentukan tanin galat. Adanya tanin galat ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tinta atau hitam. Berdasarkan hasil penelitian endapan merah yang terbentuk banyak, dimungkinkan dengan pelarut aseton : air dapat mengekstrak tanin lebih banyak. Hasil uji fitokimia dari ekstrak tanin dari daun belimbing wuluh menunjukkan bahwa di dalam daun belimbing wuluh diduga mengandung senyawa tanin katekol dan galat. Hasil ini merupakan identifikasi awal adanya kedua jenis tanin dalam daun belimbing wuluh. 4.4 Pemisahan Ekstrak Tanin dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) KLT Analitik Pendugaan senyawa tanin daun belimbing wuluh dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT). KLT merupakan suatu metode pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusi dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. KLT yang digunakan terbuat dari silika gel dengan ukuran 1 cm x 10 cm G60 F 254 (Merck). Penggunaan bahan silika karena pada umumnya silika digunakan untuk memisahkan senyawa asam-asam amino, fenol, alkaloid, asam lemak, sterol dan terpenoid. Plat KLT silika G60 F 254 diaktifasi pada suhu 100 ºC selama 30 menit untuk menghilangkan air yang terdapat pada plat

69 (Sastrohamidjojo, 2007). KLT analitik ini digunakan untuk mencari eluen terbaik dari beberapa eluen yang baik dalam pemisahan senyawa tanin. Eluen yang baik adalah eluen yang bisa memisahkan senyawa dalam jumlah yang banyak ditandai dengan munculnya noda. Noda yang terbentuk tidak berekor dan jarak antara noda satu dengan yang lainnya jelas (Harborne, 1987). Penggunaan beberapa eluen diharapkan mampu memisahkan komponen senyawa tanin yang terdapat dalam ekstrak daun belimbing wuluh dengan baik. Pemisahan senyawa tanin dengan KLT menggunakan beberapa eluen campuran toluen : etil asetat (3:1) dengan pendeteksi ferri sulfat, asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat (forestal) (30:10:3), etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) dengan pendeteksi aluminium klorida 5 %, n-butanol : asam asetat : air (4:1:5), metanol : etil asetat (4:1) dengan pendeteksi AlCl 3 1 %, etil asetat : kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2) (Lampiran 3), sedangkan data penampakan noda dari fasa air hasil KLT analitik dapat dilihat di Tabel 4.1. Tabel 4.1 Data penampakan noda dari fasa air hasil KLT analitik dengan beberapa eluen dengan lampu Ultra Violet 254 nm dan 366 nm No Eluen Jumlah Keterangan noda 1 n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) 3 Terpisah baik 2 etil asetat : kloroform : asam asetat 10 % 2 Terpisah baik (15:5:2) 3 asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat 1 Tak terpisah (Forestal) (30:10:3) 4 metanol : Etil asetat (4:1) - Tak terpisah 5 etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) - Tak terpisah 6 toluene : etil asetat (3:1) - Tak terpisah

70 Hasil pemisahan senyawa tanin dari fasa air dengan KLT analitik menunjukkan bahwa Eluen campuran metanol : etil asetat (4:1), etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1), toluen : etil asetat (3:1) tidak bisa memisahkan senyawa tanin, karena dimungkinkan eluen yang digunakan tidak sama kepolarannya. Senyawa tanin yang dipisahkan adalah senyawa yang bersifat polar, sedangkan kepolaran eluen yang digunakan masih lebih rendah dari senyawa yang akan dipisahkan, sehingga tidak terjadi pemisahan. Eluen asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat (forestal) (30:10:3) mengghasilkan 1 noda, karena dimungkinkan eluen tersebut kurang mampu untuk mengelusi senyawa tanin sehingga senyawa yang akan dipisahkan masih tertinggal sebagian. Eluen Etil asetat : Kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2) menghasilkan 2 noda yang terpisah dengan baik, tetapi masih lebih baik dengan eluen n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) yang menghasilkan 3 noda yang terpisah dengan baik. Eluen campuran n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) mampu memberikan pemisahan terbaik, hal ini dapat dilihat dengan adanya noda yang terpisah dengan baik dan jumlah noda paling banyak yaitu 3 noda. Karena dari komposisinya, eluen tersebut bersifat sangat polar sehingga bisa memisahkan senyawa tanin yang juga bersifat polar. Dengan demikian eluen ini digunakan dalam pemisahan senyawa tanin dengan KLT preparatif. Adapun gambar plat hasil KLT analitik eluen terbaik n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) disajikan pada Gambar 4.3 dan Tabel 4.2.

71 a B c d Gambar 4.3 a. Foto plat hasil KLTA ekstrak daun belimbing wuluh dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 254 dan 366 nm, b. Ilustrasi noda hasil KLTA ekstrak daun belimbing wuluh dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 254 dan 366 nm, c. Foto hasil KLTA ekstrak mimosa dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 366 dan 254 nm, d. Ilustrasi noda hasil KLTA ekstrak mimosa dengan eluen BAA (4:1:5) dengan sinar UV 254 dan 366 nm. Tabel 4.2 Nilai Rf dan warna noda hasil KLTA eluen terbaik n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4:1:5) dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm Noda Nilai Rf Warna noda 254 nm 366 nm 1. 0,53 Coklat kehijauan Coklat kehijauan 2. 0,61 Hijau Ungu kemerahan 3. 0,68 - Ungu kemerahan KLT merupakan suatu metode pemisahan berdasarkan perbedaan distribusi dua fasa. Fasa diam yang digunakan adalah plat silika gel yang bersifat polar, sedangkan eluen yang digunakan bersifat sangat polar karena mengandung air. Kepolaran fasa diam dan fasa gerak hampir sama, tetapi masih lebih polar fasa gerak sehingga senyawa tanin yang dipisahkan terangkat mengikuti aliran eluen, karena senyawa tanin bersifat polar. Dari ketiga noda yang ada maka noda yang

72 kedua adalah noda yang diduga senyawa tanin, yang memiliki nilai Rf sebesar 0,61 dan warna noda saat disinari dengan lampu UV 366 berwarna lembayung. Hal ini diperkuat oleh Harborne (1987) bahwa tanin dapat dideteksi dengan sinar UV pendek berupa noda yang berwarna lembayung, selain itu didukung dengan Rf dari ekstrak tanaman mimosa (memiliki kadar tanin yang tinggi) yang dielusi dengan eluen yang sama dengan nilai Rf sebesar 0, KLT Preparatif Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan suatu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar (Townshend, 1995). Hasil pemisahan dengan KLT preparatif hampir sama dengan KLT analitik hanya berbeda pada jumlah ekstrak yang ditotolkan pada plat dan ukuran plat KLT yang digunakan. Plat yang digunakan pada KLT preparatif adalah plat KLT silika gel G 60 F 254 dengan ukuran yang lebih besar yaitu 10 cm x 20 cm. Eluen yang digunakan pada pemisahan KLT preparatif adalah eluen terbaik hasil pemisahan pada KLT analitik yaitu n-butanol : asam asetat : air (BAA) dengan perbandingan (4:1:5). Noda yang dihasilkan pada plat KLT preparatif menghasilkan 3 noda. Pada panjang gelombang 254 nm noda yang terlihat hanya 2 noda, sedangkan dengan lampu UV dengan panjang gelombang 366 nm terlihat 3 noda dengan nilai Rf seperti pada Tabel 4.2. Pemisahan dengan KLT analitik menghasilkan harga Rf dari noda pertama sebesar 0,53 yang diduga senyawa antosianidin (Olivina, 2005). Noda kedua dan ketiga dengan nilai Rf 0,61 dan 0,68 diduga senyawa tanin terkondensasi. Senyawa tanin diduga mempunyai nilai Rf 0,61, hal ini didukung

73 dari pengukuran standar tanin dari tanaman mimosa yang memiliki kadar tanin yang besar dengan nilai Rf sebesar 0,62. Noda-noda hasil KLT preparatif yang mendekati harga Rf tanin dari tanaman mimosa dan warna yang menunjukkan tanin dikerok dan dilarutkan dalam pelarut aseton:air (7:3), kemudian diidentifikasi menggunakan spektrofotometri UV-Vis dan FTIR. 4.5 Identifikasi Senyawa Tanin Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis Spektrofotometer UV-Vis merupakan suatu metode identifikasi struktur dari suatu senyawa. Spektrofotometer UV-Vis digunakan untuk menentukan secara deskriptif senyawa tanin yang didapat dari hasil pemisahan senyawa dengan KLT preparatif. Metode ini digunakan untuk membantu mengidentifikasi senyawa tanin dan menentukan pola oksigenasinya. Spektrofotometer UV-Vis juga memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang terkonjugasi dan senyawa alifatik rantai jenuh. Dari panjang gelombang maksimum senyawa tanin terdapat satu pita yang mempunyai panjang gelombang nm yang diperkirakan adanya ikatan π π*, seperti ikatan C=C terkonjugasi dan ikatan n-π* berupa kromofor tunggal seperti ikatan C=O (Sastrohamidjojo, 1991). Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai. Apabila pada molekul yang sederhana

74 hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat pada molekul maka akan terjadi satu absorpsi yang merupakan garis spektrum (Gandjar dan Rohman, 2008). Dari hasil identifikasi senyawa tanin dari hasil pemisahan dengan KLTP dengan spektrofotometer UV-Vis, maka isolat yang diduga senyawa tanin memiliki satu garis spektrum pada panjang gelombang 331 nm. Hal ini didukung dengan hasil identifikasi senyawa tanin dari tanaman mimosa yang sebagai standar dari tanin karena memiliki kadar tanin yang besar sama-sama memiliki satu garis spektrum pada panjang gelombang 318 nm. Energi yang dibutuhkan untuk terjadi eksitasi relatif kecil sehingga panjang gelombang maksimum yang teridentifikasi besar, karena struktur senyawa tanin memiliki ikatan π π* yaitu pada cincin aromatik seperti pada Gambar ' 3' 4' HO A 5 1 O ' B 6' 5' Gambar 4.4 Struktur inti tanin Senyawa tanin merupakan senyawa yang termasuk golongan senyawa flavonoid, karena dilihat dari strukturnya yang memiliki 2 cincin aromatik yang diikat oleh tiga atom karbon. Kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan menambahkan pereaksi geser ke dalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Dengan demikian, secara tidak langsung cara ini berguna untuk menentukan kedudukan

75 gula atau metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol. Pada struktur inti tanin di atas terdapat gugus hidroksil pada posisi 7 pada cincin A dan 4', 5' pada cincin B. Berdasarkan struktur tanin pada Gambar 4.4, terlihat adanya gugus karbonil sebagai kromofornya dengan auksokrom misalnya. Substituen gugus yang mempunyai elektron bebas atau elektron π yang berdekatan dengan lingkar benzen akan menyebabkan pergeseran pita serapan ke panjang gelombang yang lebih besar. Pada spektrum tanin puncak serapan maksimum yang dimungkinkan adalah hasil transisi dari π π* dan ikatan n-π*. Ikatan n-π* merupakan transisi forbidden sehingga intensitasnya selalu lebih kecil. Pada spektrum intensitas terlihat hampir sama, hal ini dimungkinkan adanya glukosa, karena pada proses ekstraksi tidak dilakukan suatu hidrolisis, sehingga meningkatkan intensitas n-π*. Metode hidrolisis tidak dilakukan karena tanin memiliki dua jenis yaitu salah satunya tanin terhidrolisis, jika ekstrak dihidrolisis dengan asam dikhawatirkan jenis tannin terhidrolisis yang diduga ada dalam ekstrak tersebut hilang. Sedangkan untuk puncak serapan yang dimungkinkan terjadi karena transisi n-π* atau π -π* disebabkan atom O pada gugus hidroksil yang terikat pada cincin benzen, selain memberikan transisi n-π* bisa juga π -π* karena adanya resonansi. Penentuan spektrum menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan penambahan perekasi geser Na 2 M, AlCl 3 5 %, AlCl 3 5 %/HCl, NaOAc, NaOAc/H 3 BO 3 dapat dilihat dalam Tabel 4.3.

76 Tabel 4.3 Data spektrum UV-Vis dari isolat sebelum dan sesudah penambahan pereaksi geser Pergeseran Panjang gelombang panjang Dugaan distribusi gelombang Pereaksi Isolat Isolat Isolat ,0 331, Na 341,5 333, ,5 +2, Na 5 341,5 333, ,5 +2, menit AlCl % AlCl 3 5 % + HCl 328,0 331,0 - -3,0 tetap - Mungkin o-di pada cincin A 331,0 333,0 - tetap +2,0 - Mungkin o- di pada cincin A NaOAc 329,0 329,0 - -2,0-2,0 - Gugus yang peka terhadap basa, misal 6,7 atau 7,8 atau 3,4 -di NaOAc 330,0 331,5 - -1,0 +0,5 - o-di pada + H 3 BO 3 cincin A (6,7) atau (7,8) Sumber: Markham, 1988 Mungkin o-di pada cincin A Mungkin o-di pada cincin A Gugus yang peka terhadap basa, misal 6,7 atau 7,8 atau 3,4 - di o-di pada cincin A (6,7) atau (7,8) Dari data spektrum di atas didapatkan senyawa tanin yang mungkin dari hasil KLT preparatif dibawah sinar UV 254 dan 366 nm adalah isolat 2. Hal ini dikarenakan isolat 2 memiliki panjang gelombang maksimum yang hampir sama dengan tanin standar. Untuk mengetahui posisi gugus hidroksi pada senyawa tanin dapat ditentukan dengan menambahkan suatu pereaksi geser.

77 Keterangan: 1. Spektra UV-Vis isolat 2 2. Spektra UV-Vis isolat 2 ditambah Na 2M Gambar 4.5 Spektra UV-Vis isolat 2 yang ditambahkan dengan Na 2 M 2' 3' 4' O HO A 5 1 O ' B 6' 5' Gambar 4.6 Struktur senyawa tanin yang ditambah dengan Na 2 M Penambahan Na 2 M menyebabkan adanya pergeseran panjang gelombang yang lebih besar, diduga hal ini disebabkan terjadinya ionisasi pada gugus hidroksil 4 bebas (posisi gugus hidroksil di nomor 4 pada cincin B) sehingga memperpanjang sistem delokalisasi elektron dari struktur inti tanin, akibatnya energi yang digunakan untuk transisi elektron akan lebih rendah. Dengan demikian akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih besar (efek batokromik) (Markham,1988). Pada struktur inti tanin pada Gambar 4.4 terdapat gugus hidroksil pada posisi nomor 4 pada cincin B, sehingga dapat dikatakan bahwa dengan penambahan pereaksi geser Na 2 M dapat menunjukkan gugus hidroksil pada posisi 4 - yang terdapat pada struktur inti tanin.

78 Pereaksi geser AlCl 3 5 % yang ditambahkan menggeser posisi absorbansi maksimum pada isolat 1 sebesar 328,0 nm dan isolat 2 sebesar 331,0 nm yang terlihat cenderung tetap, sedangkan kenaikan intensitas dari spektra yang terbentuk dikarenakan dalam isolat masih terdapat glukosa yang bisa menaikkan intensitas. Hal ini menunjukkan bahwa pada posisi 4 dan 5 terdapat gugus o- di (orto-dihidroksi) yang membentuk komplek dengan Al yang bersifat labil. Sedangkan penambahan AlCl 3 5 %/HCl juga menghasilkan pergeseran pada isolat 1 sebesar 331,0 nm dan isolat 2 sebesar 333,0 nm dan intensitasnya menurun.. Hal ini dikarenakan terputusnya glukosa, sehingga membentuk transisi n-π*. Dengan adanya transisi n-π* maka membutuhkan energi yang kecil sehingga panjang gelombangnya semakin besar. Penurunan intensitas dikarenakan glukosa yang ada dalam isolat sudah terhidrolisis oleh asam, karena glukosa yang terikat pada tanin mudah terhidrolisis dengan adanya penambahan asam (Harborne, 1987) seperti pada Gambar 4.7. Hal ini menunjukkan adanya gugus o-di pada cincin A. Struktur inti senyawa tanin memiliki gugus o-di pada posisi 4' dan 5' pada cincin B dan juga memiliki o-di pada cincin A.

79 Keterangan: 1. Spektra UV-Vis isolat 2 2. Spektra UV-Vis isolat 2 ditambah AlCl 3 5 %/HCl 3. Spektra UV-Vis isolat 2 ditambah AlCl 3 5 % Gambar 4.7 Spektra UV-Vis isolat 2 yang ditambahkan dengan AlCl 3 5 %, AlCl 3 5 %/HCl Penambahan pereaksi geser NaOAc menyebabkan pergeseran lebih kecil. Pergeseran ini terjadi karena ionisasi pada gugus yang peka terhadap basa, yang pada senyawa tanin dimiliki oleh gugus 6,7 atau 7,8 atau 3,4 -di (Markham, 1988). Penambahan NaOAc/H 3 BO 3 akan membentuk kompleks dengan gugus o- di pada semua posisi kecuali atom C 5 dan C 6. Penambahan NaOAc/H 3 BO 3 terjadi pergeseran ke kanan sebesar 0,5 nm yang mengarah pada substitusi posisi o-di pada cincin A (6,7) atau (7,8). Hal ini dikarenakan terputusnya glukosa, sehingga membentuk transisi n-π*. Dengan adanya transisi n-π* maka membutuhkan energi yang kecil sehingga panjang gelombangnya semakin besar. Sedangkan penurunan intensitas disebabkan adanya glukosa yang terikat pada tanin sudah terhidrolisis oleh asam yaitu asam borat. Seperti pada Gambar 4.8.

80 Keterangan : 1. Spektra UV-Vis isolat 2 2. Spektra UV-Vis isolat 2 ditambah NaOAc/H 3 BO 3 3. Spektra UV-Vis isolat 2 ditambah NaOAc Gambar 4.8 Spektra UV-Vis isolat 2 yang ditambahkan dengan NaOAc, NaOAc/H 3 BO 3 Dari hasil identifikasi senyawa tanin dengan spektrofotometer UV-Vis dapat diduga bahwa senyawa tanin yang ada dalam daun belimbing wuluh yaitu flavan-3,6,7,4',5'-pentaol, atau flavan-3,7,8,4',5'-pentaol seperti pada Gambar 4.9. HO O HO O H0 Flavan-3,6,7,4',5'-pentaol Flavan-3,7,8,4',5'-pentaol Gambar 4.9 Struktur yang diusulkan senyawa tanin dalam daun belimbing wuluh Hasil dari identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis diperkuat dengan identifikasi senyawa tanin dengan spektrofotomter FTIR.

81 4.5.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer FTIR Spektrofotometer FTIR merupakan suatu metode identifikasi gugus fungsi dari suatu senyawa berdasarkan perbedaan momen dipol. Molekul yang memiliki perbedaan momen dipol yang dapat bervibrasi dan dapat terbaca oleh sinar FTIR. Sebelum menganalisis senyawa tanin, dibuat pelet KBr sebagai media identifikasi. Bilangan gelombang yang sering digunakan dalam analisis senyawa bahan alam yaitu di daerah IR tengah ( cm -1 ). Hasil identifikasi senyawa tanin dengan spektrofotometer FTIR dapat dilihat pada Tabel 4.4. Tabel 4.4 Interpretasi Spektra FTIR dari Isolat 2 dan ekstrak tanin Bilangan gelombang (cm - ) Puncak Jenis vibrasi Intensitas Ekstrak Isolat 2 Pustaka tanin ,4 3392, Rentangan asimetri m-s , Rentangan CH sp 3 m-w ,9 CO 2 (udara) w , Rentangan C=C , Overtone aromatik w , C=O vs ,8 1515,4 ; 1448, 1 ; 1404, , , ,8 ; 668,8 ; 553, Rentangan cincin aromatik R-O-Ar (eter aromatik) C-O alkohol sekunder C-H out plane, p- substitusi benzen out of plane; o-subtitusi s-m s s w-m 768,7 ; , w-m 606,4 benzene Keterangan: vs = very strong; s = strong; m = medium; w = weak

82 Hasil spektrum inframerah dari hasil pemisahan KLTP menunjukkan bahwa isolat 2 mengandung gugus fungsi seperti rentangan asimetri O-H dari gugus alkohol yang terikat pada gugus alifatik dan aromatik. Puncak serapan sangat lebar terbentuk pada bilangan gelombang 3372,4 cm -1, sebagai akibat dari vibrasi ikatan hidrogen intramolekul (Sastrohamidjojo, 2001). Pelarut yang digunakan adalah aseton : air yang bersifat sangat polar yang mempengaruhi serapan-serapan O-H. Karena dimungkinkan gugus O-H yang terbaca pada spectrum IR dari gugus pelarut (aseton : air) sehingga pada bilangan gelombang cm -1 terbentuk serapan O-H yang sangat melebar. Adanya ikatan hidogen di dalam molekul menyebabkan bergesernya pita serapan ke bilangan gelombang yang lebih rendah. Bilangan gelombang 2071,8 cm -1 menunjukkan puncak serapan C-H deformasi keluar bidang. Pada spektrum ini tidak terlihat adanya pita serapan karbonil di daerah 1700 cm -1, tetapi terdapat pita serapan agak melebar di bilangan gelombang 1625,8 cm -1 dimungkinkan merupakan pita gabungan dari uluran C=O dan serapan ikatan rangkap C=C aromatik. Hal ini mungkin dikarenakan kuatnya efek resonansi gugus karbonil dengan cincin aromatik. Sebab adanya resonansi maka kepadatan elektron pada C=O berkurang dan memberikan karakter ikatan tunggal. Akibatnya menggeser serapan ke frekuensi yang lebih rendah (Sastrohamidjojo,2001). Sedangkan menurut Markham (1988) melebarnya serapan pada bilangan gelombang 1625,8 cm -1 dikarenakan adanya glukosa yang terikat pada tanin. Dugaan senyawa tanin diperkuat dengan adanya cincin aromatik yang tersubstitusi pada posisi orto yang ditunjukkan dengan

83 puncak serapan pada bilangan gelombang 782,5. Puncak-puncak spesifik tersebut merupakan puncak spesifik dari senyawa tanin, sehingga memperkuat dugaan bahwa dalam isolat 2 hasil pemisahan senyawa tanin dengan KLTP mengandung senyawa tanin dapat dilihat pada Lampiran Hasil Penelitian Senyawa Tanin dari Daun Belimbing Wuluh dalam Prespektif Islam Segala sesuatu yang diciptakan Allah dimuka bumi ini pasti memiliki manfaat dan kegunaannya. Demikian pula Allah menciptakan manusia dengan banyak kelebihan dibandingkan dengan makhluk hidup yang lain. Manusia diberi akal dan pikiran dengan tujuan untuk memikirkan dan mengungkap segala sesuatu yang ada di dunia, seperti firman Allah dalam surat at Thaha ayat 53. [!$tβ Ï!$yϑ 9$# z ÏΒ tαt Ρr&uρ Wξç7ß $pκïù öνä3s9 y7n=y uρ #Y ôγtβ uúö F{$# ãνä3s9 Ÿ yèy_ Ï%!$# 4 Lx ;N$t7 Ρ ÏiΒ%[` uρø r& ÿ ϵÎ/ $oψô_t zr'sù "Yang telah menjadikan bagimu bumi sebagai hamparan dan yang telah menjadikan bagimu di bumi itu jalan-jalan, dan menurunkan dari langit air hujan. Maka Kami tumbuhkan dengan air hujan itu berjenis-jenis dari tumbuhtumbuhan yang bermacam-macam". Allah memberikan kepada tiap-tiap sesuatu bentuk kejadiannya, kemudian memberinya petunjuk. Allah menempatkan manusia di bumi dengan menghamparkannya agar mereka dapat menikmati hidup dan berakal guna meraih kehidupan yang lebih mulia dan tinggi. Allah menjadikan manusia di bumi ini agar ia menyadari bahwa ada jarak antara ia dan tujuan hidupnya. Ada jalan yang harus ditempuhnya guna mencapai tujuan hidup itu yakni pendekatan diri kepada

84 Allah dan upaya masuk ke hadirat Nya, sebagaimana halnya ia menempuh jalanjalan di permukaan bumi ini untuk mencapai arah yang ditujunya. Allah menurunkan air dari langit berupa air hujan. Air hujan mengandung banyak senyawa kimia yang dibutuhkan tumbuhan, salah satunya adalah nitrogen. Nitrogen bebas dapat difiksasi terutama oleh tumbuhan yang berbintil akar (misalnya jenis polongan) dan beberapa jenis ganggang. Molekul nitrogen sangat stabil, oleh karena itu pemutusan menjadi atom-atomnya untuk bereaksi dengan bahan kimia membentuk senyawa organik atau anorganik nitrogen dengan proses berenergi tinggi. Nitrogen bebas dapat bereaksi dengan hidrogen atau oksigen dengan bantuan kilat/ petir yang membentuk senyawa amonia (NH 3 ), ion nitrit (N0-2 ), dan ion nitrat (N0-3 ). Tumbuhan memperoleh nitrogen dari dalam tanah berupa amonia (NH 3 ), ion nitrit (NO - 2 ), dan ion nitrat (NO - 3 ). Beberapa bakteri yang dapat memfiksasi nitrogen terdapat pada akar yang berbintil, selain itu terdapat bakteri dalam tanah yang dapat mengikat nitrogen secara langsung, yakni Azotobacter sp. yang bersifat aerob dan Clostridium sp. yang bersifat anaerob. Nitrogen yang diikat biasanya dalam bentuk amonia. Amonia diperoleh dari hasil penguraian jaringan yang mati oleh bakteri. Amonia ini akan dinitrifikasi oleh bakteri nitrit, yaitu Nitrosomonas dan Nitrosococcus sehingga menghasilkan nitrat yang akan diserap oleh akar tumbuhan. Selanjutnya oleh bakteri denitrifikan, nitrat diubah menjadi amonia kembali, dan amonia diubah menjadi nitrogen yang dilepaskan ke udara. Nitrogen yang dilepaskan ke udara terakumulasi dalam atmosfer dan berkumpul dalam awan, sehingga air hujan yang

85 3 4 turun banyak mengandung nitrogen. Air hujan tersebut meresap dalam tanah dan ditumbuhkan dari air itu aneka macam dan jenis tumbuhan kemudian Allah memberi hidayah kepada manusia untuk memanfaatkannya. Orang yang berakal akan mencari tahu segala sesuatu yang akan dan sudah terjadi di dunia ini, seperti halnya tumbuh-tumbuhan yang diciptakan oleh Allah. Tumbuhan-tumbuhan yang diciptakan Allah di muka bumi ini tidaklah siasia. Banyak penelitian menyebutkan bahwa tumbuhan-tumbuhan mengandung senyawa aktif yang dapat dimanfaatkan dalam kehidupan sehari-hari salah satunya pemanfaatan sebagai obat atau pengawet alami. Allah membuktikannya dengan diturunkan oleh Nya hujan sebagai sumber kehidupan, dan agar manusia dapat mensyukuri nikmat yang telah Allah berikan kepadanya. Allah telah menjelaskannya dalam surat al An am ayat 99: çµ ΨÏΒ $oψô_t zr'sù & ó x«èe ä. N$t7tΡ ÏµÎ/ $oψô_t zr'sù [!$tβ Ï!$yϑ 9$# z ÏΒ tαt Ρr& ü Ï%!$# uθèδuρ ô ÏiΒ ;M Ψy_uρ πušïρ#yš β#uθ ΖÏ% $yγïèù=sû ÏΒ È Ζ9$# z ÏΒuρ $Y6Å2#utI Β ${6ym çµ ΨÏΒ ßlÌøƒ Υ #ZÅØyz ÿ ϵÏè ΖtƒuρtyϑøOr&!#sŒÎ) ÿ ÍνÌyϑrO4 n<î) (#ÿρãýàρ$# >µî7 t±tfãβ uöxîuρ$yγî6okô±ãβ tβ$ Β 9$#uρtβθçG ƒ 9$#uρ 5>$oΨôãr& tβθãζïβ σム5Θöθs)Ïj9 ;M tƒuψ öνä3ï9 sœ Îû βî) "Dan Dialah yang menurunkan air hujan dari langit, lalu Kami tumbuhkan dengan air itu segala macam tumbuh-tumbuhan maka Kami keluarkan dari tumbuh-tumbuhan itu tanaman yang menghijau. Kami keluarkan dari tanaman yang menghijau itu butir yang banyak; dan dari mayang korma mengurai tangkai-tangkai yang menjulai, dan kebun-kebun anggur, dan (Kami keluarkan pula) zaitun dan delima yang serupa dan yang tidak serupa. Perhatikanlah buahnya di waktu pohonnya berbuah dan (perhatikan pulalah) kematangannya. Sesungguhnya pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman".

86 Firman Allah SWT dalam surat al An'am ayat 99 yang menjelaskan bahwa Allah SWT menurunkan air hujan dari awan, kemudian dengan air tersebut Allah mengeluarkan setiap jenis tumbuh-tumbuhan yang bermacam-macam bentuk, ciri khas serta berbeda-beda tingkatan kelebihan dan kekurangannya (al Maraghi, 1992), meskipun semuanya tumbuh di tanah yang sama dan dialiri dengan air yang sama. Surat al An'am ayat 99 menggambarkan bentuk luar dari tumbuhan yang merupakan obyek kajian morfologi tumbuhan. Salah satu morfologi yang ditunjukkan dari ayat tersebut yaitu mayang kurma yang mengurai dari tangkaitangkai yang menjulai adalah ciri-ciri morfologi tumbuhan kurma. Surat al An'am ayat 99 juga menggambarkan morfologi tumbuhan yang berupa daun yaitu fa akhrajna minhu khadhiran (kami keluarkan dari daun-daun yang menghijau) yaitu Allah SWT mengeluarkan dari tanaman tersebut daun yang menghijau (ash Shiddieqy, 2000). Bagian tumbuhan yang nampak dari kejauhan adalah daun yang biasanya berwarna hijau. Walaupun semua daun kelihatan hijau, tetapi secara morfologi masing-masing daun berbeda dari berbagai sisi. Daun belimbing wuluh yang muda lebih lembut dan memiliki rambut halus sedangkan daun yang sudah tua memiliki warna hijau yang lebih tua dan kaku serta kandungan dan manfaatnya berbeda. Senyawa tanin yang ada dalam daun belimbing wuluh muda lebih besar dari pada daun yang sudah tua, sedangkan kandungan klorofil yang ada dalam daun belimbing wuluh yang masih muda relatif lebih sedikit dari pada daun yang sudah tua. Hal ini ditunjukkan dari warna daun muda yang hijau kemerahan, sedangkan daun yang sudah tua warnanya hijau

87 gelap. Dari tumbuhan yang menghijau tersebut dikeluarkan butir yang banyak, maksudnya dari tumbuhan yang menghijau khususnya daun memiliki kandungan kimia yang dapat dimanfaatkan dengan maksimal. Daun belimbing wuluh yang terlihat hijau dan sering terbuang sia-sia memiliki kandungan kimia seperti senyawa tanin yang dapat dimanfaatkan sebagai antibakteri, obat antidiare dan pengawet alami. Pada surat al An'am ayat 99 Allah menutup ayat dengan Sesungguhnya pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman, karena orang-orang yang beriman itu hidup, bekerja, berfikir dan memahami sehingga untuk mendapatkan bukti dari ayat tersebut yang dapat menunjukkan mereka kepada perbuatan yang mengesakan Allah SWT (al Jazairi, 2007). Selain itu, dengan memperhatikan secara mendalam maka akan ditemukan rahasia-rahasia alam tumbuh-tumbuhan seperti kandungan dan manfaat dari tanaman tersebut dengan adanya penelitian (al Maraghi, 1992). Hal ini merupakan tanda-tanda kekuasaan Allah SWT bagi orang-orang yang mau berfikir tentang kebesaran Allah SWT dalam makhluk ciptaan Nya (al Maraghi, 1992).

88 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan a. Eluen yang terbaik untuk pemisahan senyawa tanin dari daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik adalah eluen n-butanol : asam asetat : air dengan perbandingan (4:1:5) b. Jenis senyawa tanin yang diperoleh dari hasil pemisahan ekstrak daun belimbing wuluh dengan kromatografi lapis tipis diduga adalah flavan- 3,6,7,4',5'-pentaol atau flavan-3,7,8,4',5'-pentaol Saran Perlu adanya penelitian lebih lanjut tentang identifikasi jenis senyawa tanin yang ada pada daun belimbing wuluh menggunakan metode spektrofotometer lain seperti MS dan NMR.

89 DAFTAR PUSTAKA Abdul Air Belimbing Wuluh Sebagai Alternatif. diakses tanggal 21 maret 2009 Abdurrahman, D Isolasi Tanin Dari Daun Kaliandra (Calliandra calothyrsus). Skripsi Jurusan Kimia Institut Pertanian Bogor Achmad, R Kimia Lingkungan. Yogyakarta: ANDI Yogyakarta Al Jazairi Tafsir Al Qur'an Al Aisar Jilid 2. Jakarta: Darussunnah Al Maraghi, A.M Terjemah Tafsir Al-Maraghi 7. Semarang: CV. Toha Putra Semarang Amnur Cikal Bakal Averrhoa Bilimbi. Diakses tanggal 2 Juni 2009 Anonymous Senyawa Antimikroba Dari Tanaman. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Anonymous Identifikasi Senyawa Isoflavon Pada Limbah Cair Tahu, Diakses tanggal 1 Maret Ekstraksi. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Arifiyani, D Pengaruh Ekstrak Air Daun Belimbing Wuluh Dan Jus Buah Dan Batang Nanas Terhadap Perilaku Model Tikus Stroke. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Arland IPTEK OBAT: Belimbing Wuluh. Diakses tanggal 1 Maret 2009 Ash Shiddieqy, M.H.T. 2000, Tafsir Al-Qur'an Majid An-Nuur. Jakarta: PT. Pustaka Rizki Putra Atang Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.). Diakses tanggal 1 Maret 2009

90 Bate, S Detection And Determinant of Ellagitannin:Phytochemistry And International Journal Of Plant Biochemistry Vol II. England: Pragaman Press Cannas, A Tannins: Chemical Analysis. Animal Science Webmaster CU. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Cheong, W.J., et.al Determination Of Catechin Compounds In Korea Green Tea Influsions Under Various Extraction Conditions By High Performance Liquid Chromatography. department of chemistry ang institute of basic research, inha university, bull. Korea chem.sec.2005.vol.26, no.5 Dalimarta, S Resep Tumbuhan Obat Untuk Menurunkan Kolesterol. Jakarta: Penebar Swadaya Dasuki, U Sisitematika Tumbuhan Tinggi. Bandung: Pusat Universitas Ilmu Hayati ITB Effendy Teori VSEPR, Kepolaran dan Gaya Antarmolekul. Malang: Bayumedia Publishing Effendy Perspektif Baru Kimia Koordinasi. Malang: Bayumedia Publishing Etherington, R A Dictionary Of Descriptive Terminology: Vegetable Tannin. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Faradisa, M Uji Efektifitas Antimikroba Senyawa Saponin Dari Batang Tanaman Belimbing Wuluh (Averrhoa Bilimbi Linn). Skripsi Jurusan Kimia UIN Malang Fessenden R. J. dan J. S. Fessenden Kimia Organik Edisi Ketiga Jilid 1. Terjemahan Aloysius Handyana Pudjatmaka. Jakarta: Erlangga Fieser, F.L Advanced Organic chemistry, Reinhold Publishing Co. New York. hal Faharani, G.B Uji Aktifitas Antibakteri Daun Belimbing Wuluh Terhadap Bakteri Streptococcus Aureus dan Achercia Coli secara Bioautografi. FMIPA UI Jakarta

91 Giner-Chavez, B.I. dan Cannas, A Tannins: Chemichal Structural The Struktur Of Hydrolysable Tannins. cornert university. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Giwangkara, E.G Spektrofotometer Infra Merah Transformasi Fourier. (Online). Diakses tanggal 16 Maret 2009 Gohen Encyclopedia of Chemical Technology, 3 nd. New York. hal 294 Guenther, E Minyak Atsiri. Jilid I. Terjemahan Ketaren S. Jakarta: Universitas Jakarta Hagerman, A.E Tannins Chemistry. hagermae@muohiu.edu. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Hayati, E.K Dasar-Dasar Analisis Spektroskopi. Malang: Universitas Islam Negeri (UIN) Malang Hayati, E.K, Jannah, A. dan Fasya, A.G Aktivitas Antibakteri Komponen Tanin Ekstrak Daun Blimbing Wuluh (Averrhoa Billimbi L) Sebagai Pengawet Alami. Laporan Penelitian Kompetitif Depag. Malang: UIN Malang Harborne, J.B Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: ITB Haslam, E Natural Polyphenol (Vegetable Tannins) As Drugs And Medicines: Possible Modes Of Action. Journal of natural product. hal Horvart Tannins: Definition animal science webmaster, Cornert University. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Ibrahim, M.N.M., dkk Extraction of Tannin from Oil Palm Empty Fruit Bunch. Diakses tanggal 6 Maret 2009 Khopkar, S.M Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Penerbit UI-Press Ledder, J Averrhoa bilimbi. chuckiii's colleggeresourses. Diakses tanggal 2 Maret 2009

92 Leemensand, Plant Resourees of South East Asia 3 Dye and Tanin Production Plant. Netherland : Pudoc Wagengan Lenny, S Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida dan Alkaloida. Medan: MIPA Universitas Sumatera Utara Lidyawati, dkk Karakterisasi Simplisia dan Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.). Diakses tanggal 2 Juni 2009 Luthana, Y.K Prosedur Ekstraksi Senyawa Fenol dan Antibakteri dan Tanaman Gambir yang Disertai Metode Analisisnya. Diakses tanggal 21 Mei 2009 Malik, J. dkk Sari Hasil Penelitian Mangium (Acacia Mangium Willd.). Diakses tanggal 16 Maret 2009 Markham, R.K Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: ITB. Makkar, H.P.S dan Becker, K Do Tannins In Leaves Of Trees And Shrubs From African And Himalayan Regions Differ In Level And Acactivity? Argoforestry systems. Hal Meiyanto, E., dkk Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat Proliferasi Dan Memacu Apoptosis Sel MCF-7. Majalah Farmasi Indonesia, 19 (1) hal 12-19, Diakses tanggal 2 Maret 2009 Noerdin, D Elusidasi Struktur Senyawa Organic Dengan Cara Spektroskopi Ultralembayung Dan Inframerah. Bandung: Angkasa Nuraini, F, 2002, Isolasi Dan Identifikasi Tannin Dari Daun Gamal (Gliricidia sepium (Jackquin) kunth ex walp.), skripsi Jurusan Kimia Universitas Brawijaya Malang Nurliana, D.R Perbandingan Kadar Tanin Pada Daun Tua Dan Daun Muda belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi l.) Dengan Metode Spektrofotometri Visibel. Diakses tanggal 2 Juni 2009 Olivina, P., dkk Telaah Fitokimia Dan Aktivitas Penghambatan Xantin Oksidase Ekstrak Kulit Batang Salam (Syzygium polyanthum (Weight) Walp.). Skripsi Jurusan Farmasi ITB Bandung, Diakses tanggal 2 Maret 2009

93 Pansera, M.R., dkk Extraction Of Tannin By Acacia Mearnsii With Supercritical Fluids. Journal Internasional Brazilian Archives of Biology And Technology. Hal Pudjiadi, A Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press Rahayu, L Isolasi dan Identivikasi senyawa flavonoid dari Biji Kacang Tunggak (Vigna unguiculata L. Walp). Skripsi Tidak Diterbitkan. Malang: Jurusan Kimia FMIPA Universitas Brawijaya Robinson, T Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Penerjemah: Kosasih Padmawinata. Bandung: ITB Sastrohamidjojo, H Kromatografi. Yogyakarta: Liberty Yogyakarta Sastrohamidjojo, H Spektroskopi. Yogyakarta: Liberty Yogyakarta Shihab, M.Q Tafsir Al Mishbah : Pesan, Kesan dan Keserasian Al-Qur'an. Jakarta: Lentera Hati Soebagio, B Pembuatan Gel Dengan Aqupec HV-505 dari Ekstrak Umbi Bawang Merah (Allium cepa, L.) Sebagai Antioksidan. Jurnal fakultas farmasi universitas padjajaran. Diakses tanggal 25 Januari 2010 Soekartono Isolasi Suatu Flavonol dari Fraksi Etil Asetat Daun Krinyuh (Euptoim pallescents. Pc, Asteraceaece). Skripsi jurusan farmasi ITB. Diakses tanggal 2 Maret 2009 Solomons, G.T Organic Chemistry, 4 th ed, john wiley and sons. New York. hal Subiarto, M Penyerapan Sr-90 Dengan Tannin. Hasil Penelitian P2PLR (Pusat Pengembangan Pengelolaan Limbah Radioaktif). Diakses tanggal 16 April 2009 Subyakto dan Prasetyo, B Pemanfaatan Langsung Serbuk Kayu Akasia Sebagai Perekat Papan Partikel., Jurnal Ilmu & Teknologi Kayu Tropis Vol No. 1. Diakses tanggal 16 April 2009 Sudarmadji, S Teknik Analisis Biokimia. Yogyakarta: Liberty Yogyakarta Sudarwanti, dkk pengaruh ekstrak bulbus allium sativum L. dan rimpang curcuma longa L. terhadap profil lipoprotein tikus wistar dengan resiko aterosklerosis serta uji aktivitas antiagregasi platelet dan antiperoksidasi LDL secara in Viitro. Tesis Jurusan Farmasi ITB Bandung. Diakses tanggal 2 Maret 2009

94 Suseno, J.E., dan Firdausi, K. S Rancang Bangun Spektroskopi FTIR (Fourier Transform Infrared) untuk Penentuan Kualitas Susu Sapi. Berkala Fisika Vol 11 No.1: Thomas, A.N.S Tanaman Obat Tradisional 2. Yogyakarta: Kanisius Townshend, A Encyclopedia of Analytical Science, Vol. 2. London: Academic Press Inc Tyler, C.B Organic Chemistry For Students Of Agriculture. London 2 nd Allan Ummah, M.K Ekstraksi dan Pengujian Aktivitas Antibakteri Senyawa Tanin pada Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) (Kajian Variasi Pelarut). Skripsi Jurusan Kimia Universitas Islam Negeri Mualana Malik Ibrahim Malang Wijayakusuma, H Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Darah Tinggi. Jakarta: Penebar Swadaya Yuliani, S., dkk Kadar Tannin dan Quersetin Tiga Tipe Daun Jambu Biji (Psidium guajava). Bulletin TRO vol.xiv No. 1

95 LAMPIRAN Lampiran 1. Skema Kerja L.1.1 Diagram Alir Penelitian Daun belimbing wuluh Sampel Ekstrak tanin Isolat-isolat Data/spektrum - Preparasi sampel - Ekstraksi dengan cara maserasi dengan pelarut aseton-air - Pemisahan dengan menggunakan KLT Analitik dan KLT Preparatif - Identifikasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan Spektrofotometer IR L.1.2 Preparasi sampel Daun belimbing wuluh - dicuci bersih dengan air - dipotong kecil-kecil dan dikeringkan dalam oven pada suhu C - diblender sampai halus Sampel

96 L.1.3 Ekstraksi Tanin dari daun Belimbing Wuluh dengan Metode Modifikasi Nuraini (2002) 50 g sampel Maserat Kasar - dimaserasi dengan 400 ml aseton:air (7:3) + 3 ml asam askorbat 10 mm selama 3x24 jam dan dishaker - disaring dengan corong buchner Filtrat - diuji kualitatif dengan reagen - Dipekatkan dengan vacum rotary evaporator - diekstraksi dengan kloroform (4x25 ml) Residu Lapisan kloroform (bawah) Lapisan air (atas) - diuji kualitatif dengan reagen - diekstraksi dengan etil asetat (1x25 ml) Lapisan air 2 (bawah) Lapisan etil asetat 1 (atas) - diuji kualitatif dengan reagen - dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator Ekstrak tanin

97 L.1.4 Uji Kualitatif Ekstrak Daun Belimbing Wuluh dengan Reagen L filtrat 1 Sampel - dimasukkan dalam 3 tabung reaksi masing-masing 3 ml Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 - ditambah 3 tetes larutan FeCl 3 1 % - ditambah larutan gelatin - ditambah formaldehid 3 Hasil % : asam klorida (2:1) Hasil - dipanaskan panas dengan suhu 90 C (jika terbentuk endapan merah muda merupakan tanin katekol) - disaring Filtrat Residu Hasil -ditambah dengan FeCl 3 1 % (jika terbentuk warna biru tinta atau hitam merupakan tanin galat)

98 L Lapisan Air 1 Sampel - dimasukkan dalam 3 tabung reaksi masing-masing 3 ml Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 - ditambah 3 tetes - ditambah larutan gelatin - ditambah larutan FeCl 3 1 % formaldehid 3 Hasil % : asam klorida (2:1) - dipanaskan Hasil panas dengan suhu 90 C (jika terbentuk endapan merah muda merupakan tanin katekol) - disaring Filtrat Residu Hasil -ditambah dengan FeCl 3 1 % (jika terbentuk warna biru tinta atau hitam merupakan tanin galat)

99 L Lapisan Air 2 Sampel - dimasukkan dalam 3 tabung reaksi masing-masing 3 ml Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 - ditambah 3 tetes larutan FeCl 3 1 % - ditambah larutan gelatin - ditambah formaldehid 3 Hasil % : asam klorida (2:1) Hasil - dipanaskan panas dengan suhu 90 C (jika terbentuk endapan merah muda merupakan tanin katekol) - disaring Filtrat Residu Hasil -ditambah dengan FeCl 3 1 % (jika terbentuk warna biru tinta atau hitam merupakan tanin galat)

100 L.1.5 Pemisahan Senyawa Tanin L Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analitik 1 g ekstrak pekat Noda - dilarutkan dalam 1 ml aseton-air - ditotolkan pada plat silika gel 60 F 254 berukuran 1x10 cm - dielusi dengan campuran toluen : etil asetat (3:1), etil asetat: kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2), asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat (30:10:3), n-butanol-asam asetat glasial-air (BAA) (4:1:5), metanol : etil asetat (4:1), etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) L Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif 1 g ekstrak pekat - dilarutkan dalam 1 ml aseton-air - ditotolkan pada plat silika gel 60 F 254 berukuran 10x20 cm - dielusi dengan pelarut terbaik hasil KLT analitik Noda-noda Supernatant - dikerok masing-masing noda - dilarutkan dalam aseton-air - disentrifuge untuk mengendapkan silikanya - dipekatkan dengan gas N 2 /desikator vacuum Beberapa Isolat pekat

101 L.1.6 Identifikasi Senyawa Tanin L Identifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis 5 ml isolat-isolat hasil KLTP Spektrum - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya pada bilangan gelombang nm Identifikasi dilanjutkan dengan penambahan pereaksi geser Na 2M, AlCl 3 5 %, AlCl 3 5 %/HCl, NaOAc, NaOAc/H 3 BO 3 5 ml isolat yang diduga sebagai senyawa tanin Spektrum - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya pada bilangan gelombang nm 5 ml isolat yang diduga sebagai senyawa tanin - ditambah 3 tetes Na 2 M - dikocok hingga homogen - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya - Spektrum - didiamkan 5 menit - diamati spektrumnya Spektrum

102 5 ml isolat yang diduga sebagai senyawa tanin - ditambah 6 tetes pereaksi AlCl 3 5 % dalam metanol - dikocok hingga homogen - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya Spektrum Spektrum - ditambah 3 tetes HCl - dikocok hingga homogen - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya 5 ml isolat yang diduga sebagai senyawa tanin - ditambah 250 mg serbuk natrium asetat - dikocok hingga homogen - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya Spektrum - - ditambah 150 mg asam borat - dikocok hingga homogen - dimasukkan dalam kuvet - diamati spektrumnya Spektrum

103 L Identifikasi dengan spektrofotometer IR 1 tetes Isolat cair Spektrum - diteteskan pada 0,2 g KBr yang sudah jadi - dikeringkan - dianalisis dengan spektofotometer IR pada panjang gelombang cm -1 - diamati spektrumnya

104 Lampiran 2. Perhitungan, Pembuatan Reagen dan Larutan L.2.1 Pembuatan FeCl 3 1 % 1 % = (1 gram / gram total ) x 100 % Gram total = 100 %. 1 gr / 1 % = 100 gram Gram total = gram terlarut + gram pelarut Gram pelarut = 100 gram 1 gram = 99 gram V air = gram pelarut / Bj air Volume Air yang diambil adalah 99 ml untuk membuat FeCl 3 1 % dari 1 gram FeCl 3 padatan L.2.2 Pembuatan AlCl 3 5 % dalam Metanol kira-kira 5 g AlCl 3 segar dan kering (bila dimasukkan ke dalam air harus berdesis) ditambahkan dengan hati-hati ke dalam 100 ml Me p.a, bahan yang tersisa biasanya akan larut juga setelah beberapa waktu kemudian. Simpanlah dalam botol plastik tertutup. L.2.3 Pembuatan AlCl 3 1 % 1 % = (1 gram / gram total ) x 100 % Gram total = 100 %. 1 gr / 1 % = 100 gram Gram total = gram terlarut + gram pelarut Gram pelarut = 100 gram 1 gram = 99 gram V air = gram pelarut / Bj air Volume Air yang diambil adalah 99 ml untuk membuat AlCl 3 1 % dari 1 gram AlCl 3 padatan L.2.4 Pembuatan Na 2 M g Na x 1000 Molaritas Na = Mr Na x V g Na x M = 40 x 100 ml g Na = 8 gram Cara pembuatannya adalah Na sebanyak 8 g ditimbang. Na dimasukkan ke dalam gelas ukur yang telah berisi air sedikit, dan ditambahkan air sampai volume akhir tepat 100 ml. Larutan yang diperoleh harus disimpan di dalam botol. L.2.5 Pembuatan Larutan Gelatin Serbuk gelatin 2,5 gram NaCl jenuh 50 ml Cara pembuatnnya adalah 2,5 gram serbuk gelatin dicampur dengan 50 ml larutan garam NaCl jenuh, kemudiaan dipanaskan sampai gelatin larut

105 seluruhnya. Setelah dingin ditambahkan larutan gram NaCl jenuh dalam labu ukur 100 ml sampai tanda batas dan dikocok hingga homogen. L.2.6 Pembuatan Larutan Formalin 3 % M 1 x V 1 = M 2 x V 2 40 % x V 1 = 3 % x 100 ml V 1 = 7,5 ml Cara pembuatannya adalah dipipet larutan formalin 40% sebanyak 7,5 ml dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan dengan aquades sampai tanda batas. L.2.7 Pembuatan Asam Askorbat 10 mm Mr C 6 H 8 O 6 = 176 g C6H8O6 x 1000 Molaritas C 6 H 8 O 6 = Mr C H O x V g C6H8O6 x ,01 M = 176 x 100 ml g C H = 0,176 g 6 8O6 6H8O6 g C =176 mg Cara pembuatannya adalah C 6H8O6 sebanyak 176 mg ditimbang. C 6H8O 6 dimasukkan ke dalam gelas ukur yang berisi air sedikit, dan ditambahkan air sampai volume tepat 100 ml. L.2.8 Pembuatan HCl Sejumlah 50 ml HCl pekat bertingkat mutu pereaksi ditambahkan ke dalam 100 ml air suling. L.2.9 Natrium asetat (NaOAc), digunakan serbuk NaOAc p.a anhidrat. L.2.10 Asam borat (H 3 BO 3 ), digunakan serbuk asam borat anhidrat tingkat mutu p.a. L.2.11 Perhitungan Berat Ekstrak Tanin Berat beaker glass (A) = 64,2095 g Berat beaker glass + ekstrak pekat (B) = 69,6018 g Berat ekstrak pekat = B A = 69,6018 g - 64,2095 g = 5, 39 g L.2.12 Perhitungan Rendemen Berat ekstrak Rendemen = x 100 % Berat sampel 5,38 = x 100% = 10,78 % 50,02

106 L.2.13 Perhitungan harga Rf Eluen n-butanol : Asam asetat : Air (BAA) (4:1:5) Harga R f = 4,4 Harga R f 1 = 8,4 Jarak yang ditempuh senyawa Jarak yang ditempuh pelarut = 0,535 5,1 Harga R f 2 = 8,4 = 0,61 5,7 Harga R f 3 = 8,4 = 0,68 5,2 Harga R f mimosa = 8,4 = 0,62 Eluen Etil asetat : Kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2) Harga R f = 2,5 Harga R f 1 = 8,2 Jarak yang ditempuh senyawa Jarak yang ditempuh pelarut = 0,0,31 4,2 Harga R f 2 = 8,2 = 0,51 Eluen asam asetat glasial : H 2 O : HCl pekat (Forestal) (30:10:3) Harga R f = 5,5 Harga R f 1 = 7,7 Jarak yang ditempuh senyawa Jarak yang ditempuh pelarut = 0,71

107 Lampiran 3. Dokumentasi Penelitian L.3.1 Gambar daun belimbing wuluh dan daun belimbing wuluh yang sudah dihaluskan (sampel). L.3.2 Gambar maserasi daun belimbing wuluh menggunakan pelarut aseton-air (7:3) L.3.3 Gambar maserasi yang dibantu dengan shaker

108 L.3.4 Gambar filtrat hasil maserasi daun belimbing wuluh dengan pelarut asetonair (7:3) L.3.5 Gambar filtrat hasil maserasi daun belimbing wuluh dengan pelarut asetonair (7:3) sesudah divacum rotary evaporator L.3.6 Gambar ekstraksi cair-cair filtrat sesudah divacum rotary evaporator dan kloroform Lapisan air Lapisan kloroform

109 L.3.7 Gambar ekstraksi cair-cair lapisan air (hasil ekstraksi dengan kloroform) dan etil asetat dan hasil ekstraksi cair-cair. Lapisan etil asetat Lapisan air Lapisan air L.3.8 Gambar ekstrak pekat hasil ekstraksi cair-cair

110 L.3.9 Gambar hasil uji kualitatif dengan reagen Ekstrak dengan FeCl 3 1% Ekstrak dengan larutan Gelatin Ekstrak ditambahkan dengan Formalin + HCl Endapan Merah hasil penyaringan dari ekstrak yang ditambah formalin+hcl

111 L.3.10 Gambar hasil KLTA menggunakan eluen campuran yang disinari dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm Etil asetat : kloroform : asam asetat 10 % (15:5:2) Asam asetat glasial : air : asam klorida pekat (30:10:3) Toluena : etil asetat (3:1) Etil asetat : metanol : asam asetat (6:14:1) n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) Metanol : etil asetat (4:1)