Program Studi S2/S3 Bioteknologi Sekolah Pascasarjana UGM. Prosiding. Bioteknologi untuk mendukung kualitas hidup bangsa

Transkripsi

1 Prosiding S E M I N A R N A S I O N A L B I O T E K N O L O G I U N I V E R S I TA S G A D J A H M A D A Bioteknologi untuk mendukung kualitas hidup bangsa Auditorium, 18 Oktober 2014

2 Program Studi S2/S3 Bioteknologi PROSIDING Seminar Nasional Bioteknologi Universitas Gadjah Mada BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA Sekolah Pasca Sarjana UGM, 18 Oktober 2014 KEYNOTE SPEAKERS Prof. Hajime Watanabe (Osaka University, Japan) Prof. Sofia Mubarika (Universitas Gadjah Mada, Indonesia) Sastia Prama Putri (Osaka University, Japan) REVIEWERS Prof. drh. Widya Asmara, SU, Ph.D Ir. Donny Widianto, Ph.D Dr. Rarastoeti Pratiwi, M.Sc Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada Jl. Teknika Utara, Pogung, Yogyakarta, 55281, Telp : , , sps@ugm.ac.id YOGYAKARTA 18 OKTOBER 2014 i

3 PROSIDING Tema Bioteknologi Untuk Mendukung Kualitas Hidup Bangsa SEKOLAH PASCA SARJANA UGM, 18 OKTOBER 2014 Keynote Speaker : - Prof. Hajime Watanabe (Department of Biotechnology, Osaka University, Japan) - Prof. Sofia Mubarika (Staff of Faculty of Medicine Universitas Gadjah Mada) - Sastia Prama Putri (Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University) Reviewer : - Prof. drh. Widya Asmara, SU, Ph.D - Ir. Donny Widianto, Ph.D - Dr. Rarastoeti Pratiwi, M.Sc - Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si Editor : Dinar Mindrati Fardhani, SP. M.Biotech Cover Design : Lintang Pustaka Utama dan Lay Out Publisher : Alamat : Jl. Teknika Utara, Pogung, Sleman, Yogyakarta sps@ugm.ac.id Website : ISBN: All right reserved No part of this publication may be reproducted without written permission of the publisher ii BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

4 DAFTAR ISI KATA PENGANTAR... DAFTAR ISI... KEPANITIAAN... SUSUNAN ACARA... iii iv vii viii Uji Aktivitas Madu terhadap Eschericia coli dan Aspergilus fumigatus... 1 Ambarwati, Ria Utami, Ratna Puspita Meisyaroh dan Ayu Khoirotul Umaroh The Used of AntiSMASH for Secondary Metabolites Analysis of Anticancer-Producing Streptomyces sp. GMY Camelia Herdini, Sofia Mubarika, Bambang Hariwiyanto, Nastiti Wijayanti, Akira Hosoyama, Atsushi Yamazoe, Hideaki Nojiri, dan Jaka Widada Studi Polimorfisme Sitokrom P450 2A6 pada Etnis Jawa di Indonesia: Identifikasi Sitokrom P450 2A6 alel 1 dan 4 23 Christine Patramurti, Sugiyanto, Arief Nurrochmad, dan Sudibyo Martono Genetic Evaluation of Five Rice Landraces of South Kalimantan s Tidal Swamp Area Based on Chromosomal Character Dindin H. Mursyidin, Yudhi A. Nazari, Budi S. Daryono Isolasi Bakteri Pelarut Fosfat dari Rizosfer Tanaman Pisang (Musa parasidiaca) di Patallasang Gowa Eka Sukmawaty, Hafsan iv BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

5 Efektivitas Penggunaan Penanda RAPD, SSR, dan cpssr untuk Analisis Keragaman Genetik Lima Klon Kakao Unggul Elea Nur Aziza, Taryono, dan Panjisakti Basunanda Regulasi Genetik Inisiasi Pembungaan pada tanaman Anggrek Phalaenopsis amabilis (L.) Blume pada kultur in vitro Endang Semiarti dan Aziz Purwantoro Ragam Metode dan Sumber Eksplan Sebagai Penentu Keberhasilan Insersi Gen Beta Glu dan Gen Chn Istiyono Kirnoprasetyo dan Muhidin Pengaruh Abu Vulkanik Gunung Kelud terhadap Pertumbuhan Tanaman Padi Merah var Lokal melalui Pemupukan Organik GamaNPK Nendyo Adhi W, Aries Bagus S, Arfian W, dan Cahyono Agus DK Transformasi Genetik Lili (Lilium Longiflorum) dengan Gen MS35 Menggunakan Particle Bombardment Prita Sari Dewi, Zoe Wilson dan Bryan Power Ekspresi Protein Eukariot Dbl5ε dalam Bentuk Fusi dengan 6x-Histidin Tag pada Sel Inang Prokariot Escherichia coli Sapto Nugroho Hadi, Andreas Kusuma, Leily Trianty, Rintis Noviyanti, dan Mustofa Analisis Kekerabatan Salmonella typhi Asal Jateng dan Yogyakarta Berdasarkan Sekuens Gen Flagellin flic Sri Darmawati dan Muhammad Evy Prastiyanto YOGYAKARTA 18 OKTOBER 2014 v

6 KEPANITIAAN Penasihat : Prof. Ir. Suryo Purwono, MA.Sc., Ph.D Prof. drh. Widya Asmara, SU., Ph.D Prof. Irfan D. Prijambada, M.Eng., Ph.D Ir. Donny Widianto, Ph.D Dra. Rarastoeti Pratiwi, M.Sc., Ph.D Widodo Hadisaputro, SP., M.Sc., Ph.D Ketua Pelaksana : Ardiansyah, S.Si., M.Si Sekretaris : Dinar Mindrati Fardhani, SP., M.Biotech Nosa Anindita Septiana, S.Pt., M.Biotech Bendahara : Joko Budisantoso, S.Psi Dra. Emmi Triastuti Seksi Ilmiah : Dr. Yekti Asih Purwestri, S.Si., M.Si Dr. Tri Rini Nuringtyas, S.Si., M.Si Lisa Novita Anggraeni, S.Si Eggie Febrianto Ginanjar, S.Si Sekksi Acara : Agus Purnomohadi, S.Si., M.Biotech Firman Fajar Perdana, S.Si Ajeng Dara Pramita, SP Irianti Kurniasari, SP., M.Biotech Seksi Publikasi dan Dokumentasi : Dwi Purno Widekdo, S.Si., M.Biotech Aldilla Grandis, S.Si Septianto Wikan Nurhidayat, S.Pt Seksi Konsumsi : Arsiyah Tri Purwanti Seksi Perlengkapan : Kaselan Tukijo Tony Ruwaedi Sujono Suharyanto Istarto YOGYAKARTA 18 OKTOBER 2014 vii

7 Regulasi Genetik Inisiasi Pembungaan pada tanaman Anggrek Phalaenopsis amabilis (L.) Blume pada kultur in vitro Endang Semiarti 1,2, Aziz Purwantoro 3, Ixora S. Mercuriani 2, A. B. Sasongko 1, Agus Slamet 1, Bekti S.Utami 1 1 Fakultas Biologi UGM, 2 Pusat Studi Bioteknologi UGM, 3 Fakultas Pertanian UGM, endsemi@ugm.ac.id Abstrak Inisiasi pembungaan pada tanaman ditentukan oleh regulasi antar kelompok gen vegetatif dan generatif yang akan mengubah fungsi meristem apikal batang menjadi meristem bunga. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui mekanisme regulasi genetik fase transisi dari vegetatif ke generatif. Metode penelitian dilakukan dengan 2 metode: 1) Metode 2 lapis: menanam biji anggrek Phalaenopsis amabilis pada medium New Phalaenopsis (NP), setelah umur 8 minggu disubkultur ke medium NP cair, digoyang 120 rpm, ditransfer pada medium padat ditambah medium cair ½ NP +kombinasi zat pengatur tumbuh benzyl adenin (BA) (1, 3, 9) ppm dan Gibberellin (GA3) (5, 10, 15) ppm); 2) Metode Stres: seedling yang sudah keluar akarnya ditransfer pada medium ½ NP +benzyl adenin (BA) 5 ppm+ KH 2 PO 4 3 mm dengan dan tanpa pemotongan akar. Diukur panjang daun, panjang akar, jumlah daun dan waktu kemunculan tangkai bunga. Analisis ekspresi gen vegetatif dan reproduktif dilakukan dengan ReverseTranscriptase (RT)- PCR menggunakan primer POH1F1R1 dan gen penentu waktu pembungaan PaFT (P. amabilis Flowering Locus T) menggunakan primer spesifik dan PaFTF1R1, diikuti dengan analisis profil protein dengan SDS-PAGE 10%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi pembungaan dengan metode stres BA+ sukrose +KH 2 PO 4 + pemotongan akar di fase awal dapat memunculkan tangkai bunga dalam kultur in vitro pada tanaman umur 18 bulan. Ukuran daun dan akar pada tanaman hasil perlakuan berukuran lebih kecil dibandingkan tanaman tanpa perlakuan. POH1 mrna terakumulasi pada tanaman umur 4, 8, 12, 24 bulan, tetapi menghilang pada umur 48 bulan setelah tanam (bst). Sebaliknya, akumulasi mrna PaFT baru dapat 70 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

8 terdeteksi pada umur 24 dan 48 bulan setelah penanaman, menunjukkan stimulasi gen vegetatif POH1 diperlukan sampai tanaman umur 24 bulan untuk pertumbuhan fase vegetatif. Profil protein menunjukkan terbentuknya protein berukuran 51, 8 kda sesua BM POH1 protein dan 25,9 kda sesuai BM protein PaFT. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa perlakuan pemotongan akar diikuti dengan penambahan BA + dan KH 2 PO4 dapat menginisiasi pembungaan melalui aktivasi gen PaFT dengan menekan aktivitas gen vegetatif POH1, tetapi dalam aktivitas terbatas POH1 tetap dapat aktif menginduksi regenerasi daun. Kata kunci: Transisi, vegetatif, generatif, regulasi genetik, POH1, PaFT Pendahuluan Secara umum, pertumbuhan dan perkembangan tanaman melalui 3 tahapan, yaitu fase embrio, fase vegetatif dan fase generatif/reproduktif. Pengaturan semua proses pertumbuhan dan perkembangan di setiap fase tersebut diatur oleh sekelompok gen secara poligenik (Howell, 1998). Pada tanaman model Arabidopsis thaliana, pembentukan organ pada fase vegetatif diatur oleh kelompok gen homeobox, antara lain gen KNAT1, sedangkan untuk pembungaan diatur oleh kelompok gen homeotic dan gen MADS-box. Transisi dari fase vegetatif ke fase generatif diatur oleh faktor lingkungan dan fotoperiodesitas yang mengaktifkan gen Flowering Locus T (FT). Aktifnya gen FT akan mengubah meristem tunas menjadi meristem bunga, sehingga terjadi inisiasi pembungaan. Secara biokimiawi, perilaku sel tersebut ditentukan oleh pola ekspresi gen di dalam sel yang diatur pada level transkripsi gen. Dalam banyak kasus, nasib suatu sel tergantung pada produksi atau aktivitas faktor transkripsi. Selanjutnya, faktor transkripsi secara individual akan mengontrol beberapa atau banyak gen yang menentukan perilaku sel tertentu dan oleh karena itu, berperan baik sebagai individu maupun dalam kombinasi sebagai regulator utama penentu nasib sel. Studi perkembangan tanaman telah difokuskan pada mekanisme pengendalian aktivitas regulator utama ini. Ada sejumlah pendekatan eksperimental yang dapat digunakan YOGYAKARTA 18 OKTOBER

9 untuk menyelidiki kontrol regulator dan efeknya pada nasib suatu sel, untuk studi perkembangan tumbuhan (Leyser and Day, 2003). Proses transisi dari fase vegetatif ke fase reproduktif juga ditentukan oleh banyak faktor, antara lain faktor cahaya (fotoperiodism), suhu dingin (vernalisasi), fitohormon dan faktor otonomi (Kostenyuk et al., 1999). Fase transisi dari vegetatif ke pembungaan pada tanaman Arabidopsis dimulai dari aktivasi gen CONSTAN menginduksi pembentukan protein FT dari gen FT yang akan bergabung dengan protein Flowering Locus D (FD) untuk mengaktifkan gen-gen flowering identity, seperti: LEAFY (LFY) dan APETALA (AP1). Aktivasi AP1 akan mengubah nasib sel meristem sehingga terjadi transisi dari tunas ke inflorescen bunga (Howell, 1998). Gen PaFT (Phalaenopsis amabilis FT1/PaFT1) adalah gen FT-like yang diisolasi dari tanaman anggrek P. amabilis Taiwan oleh Dr. Seonghoe Jang (Academia Sinica-Biotechnology Center in Southern Taiwan, 2010, komunikasi pribadi). BA dan GA 3 merupakan ZPT yang paling sering digunakan untuk induksi pembungaan anggrek secara in vitro. Kedua fitohormon tersebut terbukti dapat menginduksi pembungaan anggrek Dendrobium candidum, Dendrobium nobile, Cymbidium niveo-marginatum, Dendrobium hibrida, Phalaenopsis hibrida, dan Miltoniopsis hibrida (Guangyuan et al., 1997; Oh and Kostenyuk, 2001; Wang et al, 2009; Kostenyuk et al., 1999; Hee et al., 2009; Sim et al., 2007; Duan and Yazawa, 1995; Matsumoto, 2006). Dalam penelitian ini, untuk mengetahui mekanisme dan waktu transisi antara fase vegetatif ke fase reproduktif digunakan gen utama penentu waktu pemungaan PaFT dan gen utama penentu pembentukan tunas adalah gen Phalaenopsis Orchid Homeobox1 (POH1) yang diisolasi oleh Semiarti et al. (2008). Koordinasi kerja kedua gen kunci pertumbuhan ini dapat memberikan informasi yang penting kapan waktu transisi tersebut terjadi pada tanaman anggrek P. amabilis. Anggrek bulan putih P. amabilis adalah tanaman hias asli Indonesia yang sangat potensial untuk dikembangkan baik sebagai tanaman pot maupun untuk diambil bunganya, sehingga usaha pemendekan fase vegetatif untuk mempercepat pembungaan sangat diharapkan. Fase vegetatif pada tanaman anggrek 72 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

10 umumnya sangat panjang. Yu et al. (2000) telah melaporkan adanya gen kunci pembentukan tunas pada anggrek hibrida Dendrobium Madame Thong in, yaitu gen Dendrobium Orchid Homeobox1(DOH1). Den DOH1 adalah ortholog dari gen KNAT1 pada Arabidopsis thaliana maupun KN1 pada tanaman Zea mays. Yu and Xu (2007) menunjukkan bahwa pada anggrek Dendrobium, selama siklus hidupnya, koordinasi yang baik dan terus menerus berlangsung antara gen vegetatif DOH1 dan gen reproduktif kelompok keluarga gen DOMADS diperlukan, oleh karena itu pada fase reproduktif tanaman anggrek tetap aktif membentuk tunas (batang dan daun) dan akar. Pada paper ini dilaporkan bahwa pada tanaman anggrek yang ditumbuhkan secara in vitro, pembungaan dapat diinduksi dengan perlakuan zat pengatur tumbuh sitokinin, penambahan gula pada media tumbuh dan pemberian stres fisik dengan pemotongan akar. Tanpa perlakuan stres, tanaman belum berbunga pada umur yang sama meskipun koordinasi ekspresi gen POH1 dan PaFT sudah terdeteksi di level mrna dan protein pada tanaman yang telah diberi perlakuan zpt sitokinin dan gibberelin. Metoda Bahan Tanaman Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji anggrek bulan P. amabilis. Biji berasal dari buah berumur 4 bulan setelah selfing. Biji ditanam pada medium New Phalaenopsis (NP) + 15% air kelapa. Tanaman atau protokorm yang dihasilkan kemudian digunakan dalam perlakuan induksi pembungaan menggunakan hormon. Induksi Pembungaan menggunakan zpt BA dan GA3 Induksi pembungaan dilakukan melalui 2 teknik, yaitu: 1) Metode 2 Lapis (Sim et al., 2007): Protokorm anggrek umur 8 minggu setelah tanam (mst) disubkultur pada medium NP cair dengan kombinasi BA (0, 1, 3 dan 9) ppm dan GA 3 (0, 5, 10 dan 15) ppm. Protokom diinkubasi dengan digoyang pada shaker dengan YOGYAKARTA 18 OKTOBER

11 kecepatan 120 rpm dan suhu 25 0 C. Subkultur dilakukan setiap 3 minggu sekali selama 9 minggu pada medium dengan komposisi yang sama. Kultur kemudian dipindahkan pada medium NP 2 lapis, padat:cair (50ml : 20ml), dengan Lapisan bawah adalah medium padat (50 ml) sedangkan lapisan atas adalah medium cair (20 ml) dengan kombinasi BA dan GA 3 ; 2) Metode stres dengan pemotongan akar (Oh and Kostenyuk, 2001): Tanaman anggrek umur 6 bulan setelah tanam (bst) disubkultur pada medium induksi pembungaan ½ NP dengan sukrosa 40 g.l % air kelapa dengan kombinasi perlakuan pemotongan akar dan tanpa pemotongan akar, masing-masing dengan penambahan fosfat 1,5 dan 3 gram/l dan zat pengatur tumbuh BA 5 ppm. Analisis Akumulasi mrna gen vegetatif POH1 dan gen pembungaan PaFT Analisis akumulasi mrna gen POH, PaFT, dan Actin (gen kontrol) diawali dengan Isolasi RNA total dari tanaman anggrek P. amabilis, baik yang tidak maupun yang diberi perlakuan induksi pembungaan. Isolasi RNA dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan RNeasy Kit (Qiagen). Hasil isolasi tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam sintesis cdna menggunakan iscript cdna synthesis Kit (Bio-Rad). cdna yang dihasilkan selanjutnya digunakan sebagai cetakan dalam analisis akumulasi mrna gen PaFT, POH1 dan Actin dalam suatu reaksi amplifikasi DNA (PCR) menggunakan primer spesifik terhadap gen-gen tersebut. Hasil amplifikasi kemudian divisualisasikan dengan elektroforesis. Analisis Protein Analisis protein diawali dengan isolasi protein. Sebanyak 0.2 g daun anggrek dihaluskan pada mortar yang telah diisi dengan Nitrogen cair, kemudian dilarutkan dalam buffer (20 mm Tris-Cl ph 7.5 dan 150 mm NaCl). Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 20 menit pada suhu 4 o C. Supernatan kemudian ditampung dalam tabung dan disimpan pada suhu -40 o C. 74 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

12 Analisis protein dilanjutkan dengan elektroforesis (SDS- PAGE). Gel poliakrilamid yang digunakan terdiri dari stacking gel 5% dan running gel 10%. Pewarnaan protein dilakukan dengan merendam gel dalam coomasie blue 0.1% buffer selama semalam. Setelah pencucian gel, protein tampak berupa pita berwarna biru pada SDS-PAGE. Hasil dan Pembahasan Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada biji anggrek yang ditanam pada medium NP tumbuh dan berkembang melalui 4 fase: 1) Fase 1, biji mengembang dengan embrio yang mengembung karena proses imbibisi air yang melepaskan selaput biji (testa), umur 1 MST (Gambar 1B), kemudian embrio berubah warna menjadi kuning kehijauan, dan ukuran bertambah besar pada 2 MST (Gambar 1C); 2) Fase 2, embrio semakin berwarna hijau dengan bentuk bulat pada bagian basal dan mengerucut pada bagian ujungnya (Gambar 1D). 3) Fase 3, terjadi perkembangan lebih lanjut muncul absorbing hair (ah) yang berbentuk seperti rambut halus berwarna putih di sekitar protokorm (Gambar 1E). Daun pertama kemudian terbentuk pada bagian sisi dorsal protokorm (Gambar 1F) dan ; 4) Fase 4, muncul daun kedua, ah sudah tidak tampak, tetapi belum membentuk akar (Gambar 1G); 5) Fase 5, terjadi pembentukan akar pertama pada protokorm yang muncul pada bagian basal (Gambar 1H), sehingga akhirnya protokorm berkembang sempurna menjadi plantlet. Perkembangan embrio anggrek sampai plantlet secara in vitro ini sesuai dengan pola pertumbuhan embrio P. amabilis yang ditemukan sebelumnya (Semiarti et al., 2007 dan 2010) Pada umur 8 minggu (fase 3), protokorm ditransfer ke medium NP ditambah zpt BA (1, 3, 9 ppm) + GA 3 (5, 10, 15) ditumbuhkan sampai umur 12 MST. Pertumbuhan diikuti setiap minggu, dan pada minggu ke-4 terlihat bahwa perlakuan NP+BA 3 ppm + GA 3 10 menghasilkan pertumbuhan tercepat berdasarkan pertambahan ukuran panjang daun ke-1 (Tabel 1). YOGYAKARTA 18 OKTOBER

13 0 MST 1 MST 2 MST 4 MST te em A B C D 8 MST 10 MST 12 MST 24 MST ah E F G H Gambar 1. Fase pertumbuhan protokorm P. amabilis secara in vitro. A Biji anggrek hari ke-0 pada medium budidaya (Fase 0); B embrio umur 1 MST, terjadi pembengkakan, tidak memiliki testa, bentuk embrio bipolar dan berwarna putih (Fase 1); C embrio umur 2 MST berwarna kuning kehijauan, ukuran bertambah besar; D embrio umur 4 MST berwarna hijau (Fase 2); E embrio umur 8 MST muncul absorbsing hair yang berwarna putih pada bagian basal protokorm (Fase 3). F protokorm umur 10 MST dengan daun yang berkembang (Fase 4). G protokorm umur 12 MST mempunyai satu daun dan ah sudah tidak tampak. H protokorm umur 24 MST mempunyai dua daun dan akar mulai terbentuk. em = embrio; te = testa; ah = absorbing hair; MST = minggu setelah tanam. Bar: 100 μm pada A; 0.5 cm pada B H. 76 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA ah

14 Tabel 1. Perkembangan protokom anggrek pada medium NP ditambah zpt BA dan GA3. Perlakuan BA,GA3 (ppm) Jumlah Tanaman yang diamati Panjang daun ke-1 (cm) 12 MST 16 MST 24 MST Kontrol 16 0,10 ± 0,04 0,3± 0,07 0,73 ± 0,10 BA1,GA ,23± 0,09 0,61 ± 0,10 0,89 ± 0,06 BA 3, GA ,45± 0,04 0,75 ± 0,12 1,06 ± 0,11 BA 9, GA ,64 ± 0,07 0,83 ± 0,19 1,25 ± 0,24 Perlakuan BA,GA3 (ppm) Jumlah Tanaman yang diamati Jumlah Daun 12 MST 16 MST 24 MST Kontrol 16 1,0± 0,00 1,5± 0,57 2,5 ± 0,57 BA1,GA ,5± 0,57 2,25 ± 0,50 3,25 ± 0,50 BA 3, GA ,75± 0,50 2,5 ± 0, 57 3,75 ± 0,95 BA 9, GA ,25± 0,50 3,00 ± 0,00 4,75 ± 0,95 Perlakuan BA,GA3 (ppm) Jumlah Tanaman yang diamati Panjang akar 12 MST 16 MST 24 MST Kontrol 16 0,00 ± 0,00 0,51 ± 0,08 1,80 ± 0,38 BA1,GA ,00 ± 0,00 0,10 ± 0,01 1,55 ± 0,31 BA 3, GA ,00 ± 0,00 0,04 ± 0,01 1,02 ± 0,17 BA 9, GA ,00 ± 0,00 0,01 ± 0,01 0,62 ± 0,22 Perlakuan BA,GA3 (ppm) Jumlah Tanaman yang diamati Jumlah Akar 12 MST 16 MST 24 MST Kontrol 16 0,00 ± 0,00 1,67± 0,57 4,50 ± 0,70 BA1,GA ,00 ± 0,00 1,33 ± 0,57 3,50 ± 0,57 BA 3, GA ,00 ± 0,00 1,00 ± 0,00 3,00 ± 0,00 BA 9, GA ,00 ± 0,00 0,50 ± 1,00 2,50 ± 0,07 Setelah berumur 14 minggu tanaman ditanam pada medium dua lapis yang ditambah dengan zpt BA dan GA3 dengan variasi konsentrasi yang sama menunjukkan terjadinya peningkatan kecepatan pertumbuhan daun dan akar. Pada 24 MST, pertumbuhan plantlet terbaik pada protocorm yang ditanam pada medium 2 lapis NP +BA 9 ppm+ga3 15 pertumbuhan YOGYAKARTA 18 OKTOBER

15 normal dengan daun berwarna hijau dan rasio panjang-lebar daun yang normal (Tabel 2). Pertumbuhan dan perkembangan terbaik dicapai pada tanaman yang ditumbuhkan pada medium NP ditambah dengan BA 3 ppm dan GA10 ppm dengan panjang daun pertama (1-1,5) cm. Tabel 2. Pertumbuhan tanaman anggrek P. amabilis pada medium 2 lapis pada berbagai variasi konsentrasi BA dan GA 3 Parameter Panjang Daun (cm) Jumlah Daun (lembar) Panjang Akar (cm) Jumlah Akar Umur Perlakuan (minggu) A0 A1 A3 A9* 18 2,53 ± 0.1 2,83 ± 0.2 3,36 ± 0.2 4,16 ± ,16 ± 0.1 3,63 ± 0.2 3,9 ± 0.1 4,73 ± ,43 ± 0.3 4,23 ± 0.2 4,36 ± 0.1 5,23 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ,33 ± 0.2 1,33 ± 0.2 1,10 ± 0.1 1,10 ± ,16 ± 0.2 2,16 ± 0.2 2,46 ± 0.1 1,76 ± ,23 ± 0.1 3,86 ± 0.2 3,23 ± 0.1 3,33 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0.6 Keterangan: Standar deviasi dihitung dari 3 sampel, *Perlakuan terbaik. Setelah umur 18 MST pertumbuhan tunas relatif cepat dan sampai 30 MST, ukuran daun dan akar, jumlah daun dan jumlah akar terbaik dicapai pada plantlet yang ditumbuhkan pada media NP ditambah BA 9 ppm + GA 3 15 ppm. Akan tetapi belum ada tanda-tanda kemunculan tangkai bunga. Hasil analisis akumulasi mrna gen POH1 (fase vegetatif) dan gen PaFT (fase transisi ke pembungaan) menunjukkan bahwa gen POH1 terekspresi dari umur 4-16 MST, menghilang pada umur 24 MST, kemudian muncul lagi pad umur 48 dan 96 MST. Sedangkan gen PaFT baru muncul setelah tanaman umur 24 MST sampai 96 MST. Hal ini menunjukkan adanya koordinasi antar gen 78 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

16 kunci pertumbuhan, untuk pengaturan (regulasi) transkripsi gen vegetatif dan gen reproduktif yaitu gen POH1 dan gen PaFT. Tanaman Kontrol (tanpa perlakuan) dengan umur yang berbeda (4, 8, 16, 24, 48 dan 96 MST). Tanaman muda (4 16 MST) dianalisis untuk mengetahui gen-gen juvenile, sedangkan tanaman dewasa (48 96 MST) digunakan untuk mengetahui gengen inisiasi pembentukan bunga. Hasil RT-PCR dengan primer spesifik gen POH1 dan gen PaFT yang diteliti menunjukkan bahwa gen POH1 teraktivasi pada tahap awal (umur 4 8 MST), kemudian menurun pada umur 16 MSP dan akhirnya tidak terdeteksi pada umur 24 MSP, sebaliknya keberadaan gen PaFT tidak terdeteksi pada tanaman juvenil sampai umur 24 MSP dan baru terdeteksi pada umur 48 MST. Pada tanaman umur 24 MST hasil induksi pembungaan dengan kombinasi BA dan GA 3 menunjukkan adanya aktivasi gen PaFT, sementara keberadaan gen POH1 dengan intensitas rendah masih terus terdeteksi (Gambar 2). Aktivasi gen POH1 pada tanaman anggrek P. amabilis baik pada kelompok perlakuan kombinasi BA dan GA 3 maupun pada kontrol (UT) menunjukkan adanya akumulasi mrna yang tinggi pada fase juvenil (umur 4 8 MST) dengan teramplifikasinya cdna berukuran 800 bp dengan sangat jelas kemudian terjadi penurunan secara bertahap pada umur 16 minggu dan tidak terdeteksi pada umur 24 MST. Sebaliknya keberadaan gen PaFT tidak terdeteksi pada tanaman UT umur 24 MSTsedangkan pada tanaman yang diperlakukan dengan zpt (BA dan GA 3 ) memperlihatkan adanya aktivasi gen PaFT pada umur 24 MST dengan teramplifikasinya cdna ukuran 700 bp. YOGYAKARTA 18 OKTOBER

17 POH1 PaFT Actin BA - - GA 3 BA + + GA 3 UT1 UT2 UT3 UT5 A1 A MST Gambar 2. Akumulasi mrna gen POH1 dan gen PaFT pada daun tanaman anggrek P. amabilis dengan dan tanpa perlakuan fitohormon BA dan GA 3. Gen POH1 teramplifikasi pada posisi 800 bp dan gen PaFT (700 bp). UT: untreated (tanpa perlakuan/kontrol). MSP = Minggu Setelah Tanam. UT1 umur 4 MST, UT2 umur 8 MST, UT3 umur 16 MST, UT4 umur 24 MST, UT5 umur 48 MST, UT6 umur 96 MST. A1-A9: perlakuan BA + GA 3, umur 24 MST. A1 (BA 1 ppm + GA 3 5 ppm), A3 (BA 3 ppm + GA 3 10 ppm), A9 (BA 9 ppm + GA 3 15 ppm). Aktivasi gen POH1 pada tanaman anggrek P. amabilis baik pada kelompok perlakuan kombinasi BA dan GA 3 maupun pada kontrol (UT) menunjukkan adanya akumulasi mrna yang tinggi pada fase juvenil (umur 4 8 MST) dengan teramplifikasinya cdna berukuran 800 bp dengan sangat jelas kemudian terjadi penurunan secara bertahap pada umur 16 minggu dan tidak terdeteksi pada umur 24 MSP. Sebaliknya keberadaan gen PaFT tidak terdeteksi pada tanaman UT umur 24 MSP sedangkan pada tanaman yang diperlakukan dengan zpt (BA dan GA 3 ) memperlihatkan adanya aktivasi gen PaFT pada umur 24 MST dengan teramplifikasinya cdna ukuran 700 bp. Aktivasi gen POH1 pada tanaman anggrek P. amabilis baik pada kelompok perlakuan kombinasi BA dan GA 3 maupun pada kontrol (UT) menunjukkan adanya akumulasi mrna yang tinggi pada fase juvenil (umur 4 8 MST) dengan teramplifikasinya cdna berukuran 800 bp dengan sangat jelas kemudian terjadi penurunan secara bertahap pada umur 16 minggu dan tidak terdeteksi pada umur 24 MSP. Sebaliknya keberadaan gen PaFT tidak terdeteksi pada tanaman UT umur 24 MSP sedangkan pada tanaman yang diperlakukan dengan zpt (BA dan GA 3 ) BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

18 memperlihatkan adanya aktivasi gen PaFT pada umur 24 MST dengan teramplifikasinya cdna ukuran 700 bp. Pada tanaman yang telah mendapat perlakuan BA dan GA 3 dengan berbagai konsentrasi menunjukkan data yang sama, baik gen POH1 maupun gen PaFT teraktivasi pada tanaman umur 24 MST. Adanya konsentrasi seimbang antara gen POH1 dan gen PaFT kemungkinan menjadi salah satu penyebab bahwa tanaman anggrek P. amabilis tidak dapat diinduksi pembungaannya secara in vitro. Hew and Yong (2004) menyatakan bahwa suhu yang diperlukan untuk induksi pembungaan pada tanaman anggrek P. amabilis sangat fluktuatif, terutama diperlukan perlakuan stress suhu, perbedaan siang dan malam yang sangat drastis, malam o C dan siang hari o C. Hal ini berbeda dengan tanaman anggrek Dendrobium yang umumnya lebih stabil ritme pembungaannya, sehingga dapat diinduksi pembungaan secara in vito dengan zpt BA (22.2 μm) dan suhu (26 ± 2 o C) (Sim et al., 2007) Pembungaan dengan Medium ½ NP + Fosfat tinggi+sukrosa tinggi dan Pemotongan Akar Hasil induksi pembungaan dengan kombinasi antara perlakuan fisiologi dengan zpt BA 5 mg/l, perlakuan biokimiawi dengan stress nutrisi yaitu ½ konsentrasi makronutrien pada medium dasar untuk pertumbuhan in vitro ditambah sukrose konsentrasi 2 kali lipat (40 gram/l) dan fosfat konsentrasi tinggi (3 mm) ditambah dengan pemotongan pada bagian akarnya dapat menginduksi kemunculan inflorescen bunga pada tanaman in vitro umur 18 bulan (Gambar 3). YOGYAKARTA 18 OKTOBER

19 A B Gambar 3. Pembungaan In vitro tanaman P. amabilis. A. Tananaman Kontrol; B. Tanaman yang ditanam pada medium ½ NP ditambah zpt BA 5 ppm + Fosfat 3mM + sukrose 40 gr/l dan pemotongan akar, berhasil memunculkan tangkai bunga (anak panah). Menurut Taylor dan Marnie (2007) pembungaan secara in vitro sangat tergantung pada beberapa faktor yaitu sifat dan umur eksplan, komposisi dari media (ketersediaan nutrisi, sumber karbohidrat dan zat pengatur tumbuh) serta kondisi lingkungan yang mendukung (suhu, penyinaran dan fotoperiodesitas). Analisis Protein POH1 dan PaFT pada tanaman P. amabilis setelah perlakuan BA+GA 3 Profil protein pada tanaman umur 24 MST digunakan untuk mengetahui regulasi gen POH1 dan gen PaFT yang telah terdeteksi melalui akumulasi mrna hasil RT-PCR, maka dilakukan analisis protein dengan SDS-PAGE. Ukuran protein PaFT ditentukan dengan mengkonversi jumlah nukleotida cdna PaFT menggunakan software convertor bp to kda dari website Hasil konversi menunjukkan bahwa gen PaFT sepanjang 700 bp menyandi protein seberat 25,9 kda, gen POH1 yang panjang cdnanya 1,400 bp setara dengan 51,8 kda. Analisis profil protein juga menunjukkan adanya pita protein dengan ukuran 51, 8 kda dan 25,9 kda pada SDS-PAGE sesuai dengan berat molekul PaFT dan ukuran protein POH1 dan PaFT (Gambar 4). 82 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

20 ,8 kda 25,9 kda) Gambar 4. Profil protein tanaman anggrek umur 24 bulan setelah tanam. Yang diduga POH1 dan PaFT. Lajur 1-12 protein hasil isolasi pada berbagai perlakuan. Lajur 1:Kontrol, lajur 1-3 K Terdeteksinya protein PaFT dan POH1 pada tanaman umur 48 MST, membuktikan bahwa pada fase yang sama, di dalam sel telah terjadi produksi protein gen kunci vegetatif maupun generatif pada tanaman umur 48 MST. Sementara hasil RT-PCR menunjukkan bahwa transkrip POH1 terdeteksi pada tanaman umur 4 s.d 16 MST, kemudian hilang/tidak terlihat pada umur 24 MST, tetapi kemudian terdeteksi lagi pada tanaman umur 48 MST. Sedangkan PaFT transkrip baru mulai terdeteksi pada tanaman umur 24 MST, kemudian semakin jelas dengan bertambahnya umur tanaman. Sehingga pada tanaman umur 48 MST terjadi pembentukan protein dari kedua gen tersebut. Hal ini menunjukkan adanya mekanisme koordinasi antara gen vegetatif dan generatif, mengingat bahwa pada anggrek pada fase generatif pembentukan organ-organ vegetatif, transisi ke fase pembungaan perlu faktor-faktor lain seperti cahaya, temperatur, dan lain-lain yang dapat Hou and Yang (2012) melaporkan bahwa adanya ekspresi gen Oncidium FT (OnFT) yang tinggi pada tunas aksilar selama fase vegetatif awal tidak cukup untuk menginduksi transisi dari fase vegetatif menuju fase generatif tanaman Oncidium Gower Ramsey. Terbentuknya pseudobulb, yang merupakan tempat penyimpanan nutrisi, menjadi faktor yang sangat penting dalam pembungaan Oncidium. Pembungaan tidak dapat terjadi sebelum pseudobulb terbentuk meskipun dengan ekspresi OnFT yang YOGYAKARTA 18 OKTOBER

21 tinggi. Fenomena yang sama juga terlihat pada P. amabilis dalam penelitian ini, yaitu meskipun pada tanaman umur 24 bulan. Hew and Yong (2004) menyatakan bahwa pembungaan pada P. amabilis sangat memerlukan kondisi khusus dan sifatnya sangat fluktuatif, sehingga belum pernah dapat dibungakan secara in vitro, sedangkan hibridanya ada yang pernah berbunga in vitro. Oleh karena itu adanya tanaman P. amabilis yang dapat berbunga secara in vitro pada medium1/2 konsentrasi medium dasar + P tinggi + BA tinggi dan pemotongan akar menunjukkan bahwa untuk induksi pembungaan dapat dilakukan dengan pemberian stress nutrisi/kimiawi/fisiologis dan fisik yang dapat memaksa berfungsinya gen pembungaan dan memunculkan bunga. Kesimpulan 1. Perlakuan zpt dapat memicu ekspresi gen PaFT untuk inisiasi pembungaan/ induksi fase transisi dari vegetatif ke generatif pada tanaman anggrek P. amabilis 2. Protein PaFT terdeteksi pada profil protein P. amabilis umur 24 bulan 3. Perlakuan zpt BA9 ppm + GA3 15 ppm menginduksi pembentukan daun dan akar tanaman anggrek P. amabilis, tetapi belum mampu menginduksi pembungaan 4. Penanaman P.amabilis pada medium ½ NP + KH 2 PO 4 3 ppm + sukrosa 40 gr/l dapat menginduksi pembungaan in vitro Ucapan Terima Kasih Penulis berterima kasih kepada Kemen-terian Pendidikan Nasional Republik Indonesia yang telah mendanai penelitian ini melalui Hibah Penelitian STRANAS (Nota kesepakatan No: 001/SP2H/PL/ Dit.litabmas/ III/2012 dan 089/SP2H/PL/ DIT.LITABMAS / V/2013, serta Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah STRANAS, Nomor: LPPM-UGM/1045/ LIT/2014). Ucapan terima kasih juga ditujukan kepada Dr. Seonghoe Jang (Academia Sinica, Biotechnology Center in Southern Taiwan) 84 BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

22 Daftar Pustaka Duan, J.X. & Yazawa, S Floral induction and development in Phalaenopsis in vitro. Plant Cell, tissue and Organ Culture 43: 71-74, 71 Guangyuan, W., Zhihong, X.U., Tet-Fatt, C., & Nam-Hai, C In vitro flowering of Dendrobium candid. Sci. China 4 (1): Hee, K.H., Yeoh, H.H., & Loh, C.S In vitro flowering and in vitro pollination: methods that will benefit the orchid industry. Proc.NIOC. Nagoya, 2009: Hew, C.S. and Yong, J.W.H The Physiology of Tropical Orchids in Relation to the Industry; 2 nd ed., World Scientific Publ., Singapore, 370 p. Hou, C. and Yang, C Functional analysis of FT and TFL1 orthologs from orchid (Oncidium Gower Ramsey) that regulate the vegetative to reproductive transition. Plant Cell Physiol. 50(8): Howell, S.H Molecular Genetics of Plant Development. Cambridge University Press. UK Kostenyuk, I., Oh, B.J., & So, I.S Induction of early flowering in Cymbidium niveo-marginatum Mak in vitro. Plant Cell Rep. 19 : 1 5 Leyser, O. and Day, S Mechanisms in Plant Development, Blackwell Publishing USA, 241 p. Matsumoto, T.K Gibberellic Acid and Benzyladenine Promote Early Flowering and Vegetative Growth of Miltoniopsis Orchid Hybrids. Hort.Sci. 41 (1): Oh, B.J. & Kostenyuk, I Method for Producing Orchids Flowering InVitro. United State Patent. Patent No.: US 6,168,952 B1. Semiarti E, Indrianto, A., Purwantoro, A., Isminingsih, S., Suseno, N., Ishikawa, T., Yoshioka, Y., Machida, Y., Machida,C Agrobacterium-mediated transfor-mation of the wild orchid species Phalaenopsis amabilis. Plant Biotechnol-Nar. 24: YOGYAKARTA 18 OKTOBER

23 Semiarti, E., T. Ishikawa, Y. Yoshioka, M. Ikezakki, Y. Machida, and C. Machida Isolation and charaterization of phalaenopsis orchid homeobox1(poh1) cdnas, knotted1-like homeobox family of genes in phalaenopsis amabilis orchid.the 2nd International Conference on Mathematics and Natural Sciences (ICMNS) Proceeding, ITB, Bandung, Indonesia, November 2008 Semiarti, E., Indrianto, A., Purwantoro, A., Martiwi, I.N.A., Feroniasanti, Y.M.L, Nadifah, F., Mercuriani, I.S, Dwiyani, R., Iwakawa, H., Yoshioka, Y., Machida, Y., and Machida, C High-frequency genetic transformation of Phalaenopsis amabilis orchid using tomato extract-enriched medium for the pre-culture of protocorms. J. Hortic. Sci. Biotech. 85 (3) Sim, G.E., Loh C.S., & Goh C.J High frequency early in vitro flowering of Dendrobium Madame Thong-In (Orchidaceae). Plant Cell Rep 26: Taylor, N. and Marnie, E.L Monosaccharides Promote Flowering in Kniphofi a leucochepala in Vitro. Plant Growth Regulator 52: Wang, Z.H., Wang, L., & Ye, Q.S High frequency early flowering from in vitro seedlings of Dendrobium nobile. Sci. Hort.122: Yu H., Yang S.H, Goh C.J DOH1, a class 1 knoxgene, is required to maintenance of the basic plant architecture and floral transition in orchid. Plant C Blazquez M., Koorneef M., Putteril, J Flowering on time: genes that regulate the floral transition. EMBO reports vol.2(2): Yu, H. and Y. Xu Orchids. In. E.C. Pua and M.R. Davey (Eds.) Transgenic Crops VI. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 61. Springer: BIOTEKNOLOGI UNTUK MENDUKUNG KUALITAS HIDUP BANGSA

24 Auditorium Yogyakarta Jl. Teknika Utara, Pogung, Sleman, Yogyakarta, 55281

25 = o l.o) - o 6= ivn s-3.9.q 3 = str*: -v E L qj q ;: ul : A-!.:l v 'r.,r@ -:i:- 3B:' J.a (_, osr e. z 0 E' i S; -Y F r-, q :!s9:e -! 3: S= g g E <,i2 9 x E;z=,i E=gE; e 3s P. <s,^.! c,"r; o <-t -b zs'o =:5 u --: o *.! xv!a oe $<9 = o ) a! o n : z 9s :"r:* t o.. z