UJI EFEK SITOTOKSIK HASIL FRAKSINASI EKSTRAK ETANOL AKAR ASAM KANDIS (Garcinia cowa Roxb.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D DENGAN METODA MTT

Transkripsi

1 UJI EFEK SITOTOKSIK HASIL FRAKSINASI EKSTRAK ETANOL AKAR ASAM KANDIS (Garcinia cowa Roxb.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D DENGAN METODA MTT Fajar Yonny Ilhami, Fatma Sri Wahyuni, Elidahanum Husni Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang. ABSTRAK Uji efek sitotoksik hasil fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) telah dilakukan terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro. Potensi hasil fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis ini diuji dengan metode MTT. Prinsip kerja metoda MTT adalah dengan mengukur aktivitas dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup yang memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi formazan. Pengujian ekstrak fraksinasi dilakukan dari konsentrasi 0.1, 1, 10, dan 100 µg/ml. Dari pengujian yang dilakukan diperoleh nilai IC 50 ekstrak fraksi etil asetat akar asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D sebesar 0,52 ± 3,55 µg/ml dan fraksi air sebesar 81,44 ± 7,99 µg/ml. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa fraksi etil asetat akar asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) mampu menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D secara signifikan pada konsentrasi 100 µg/ml (p=0,004). Kata kunci: Kanker payudara, Akar Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.), MTT. PENDAHULUAN Kanker pada dasarnya adalah suatu penyakit yang ditandai dengan suatu pergeseran pada mekanisme kontrol sel yang mengatur proliferasi dan diferensiasi sehingga mengakibatkan pertumbuhan sel menjadi abnormal (Katzung, 1997). Kanker merupakan masalah kesehatan dari banyak negara di dunia dan termasuk penyakit yang menjadi perhatian serius pada bidang kedokteran. Hal ini disebabkan oleh jumlah pasien yang terus meningkat dari tahun ke tahun dan belum ditemukan cara yang efektif untuk pengobatannya (Sajuthi, 2001). Di Indonesia, kanker payudara menempati urutan kedua setelah kanker leher rahim (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002). Kanker payudara menempati urutan pertama penyakit keganasan pada pasien rawat inap wanita di rumah sakit (DKRI, 2009). Pengobatan kanker payudara dengan cara kemoterapi merupakan terapi pilihan, akan tetapi pengobatan kanker menggunakan agen kemoterapi cenderung menimbulkan resistensi sel kanker yang mengakibatkan sebagian besar kegagalan pengobatan kanker (Staerk et al., 2002). Disamping itu, obat antikanker yang ideal seharusnya dapat membunuh sel kanker tanpa membahayakan jaringan sehat. Namun sampai sekarang belum ditemukan obat yang memenuhi kriteria demikian. Obat antikanker yang telah digunakan umumnya bersifat tidak selektif, karena selain memiliki khasiat sebagai antikanker obat tersebut juga bersifat merusak sel-sel yang normal (Anonim, 2003). Obat antikanker yang ideal seharusnya dapat mematikan sel kanker tanpa membahayakan jaringan sehat. Namun, sampai sekarang belum ditemukan obat yang memenuhi kriteria demikian. Karenanya, usaha penelitian terus dilakukan untuk menemukan obat kanker yang ideal. Salah satu sumber obat-obatan kemoterapi yang potensial yaitu tumbuh-tumbuhan sehingga sampai saat ini pencarian obatobatan kemoterapi dari tumbuh-tumbuhan terus dilakukan (Sukardiman, Ekasari, Hapsari, 2006). Tumbuhan dari genus Guttiferae (Garcinia) akhir-akhir ini banyak diteliti 71

2 kandungan dan aktivitasnya. Genus ini dilaporkan mengandung santon, benzofenon, triterpen, biflavonoid, benzoquinon, senyawa α-mangostin, cowanin, cowanol, cowasanton, rubrasanton, β-mangostin, tetrapreniltolouquinon, dan santon terprenilasi (Rukachaisirikul et.al., 2008; Wahyuni et.al., 2004; Kenji et.al., 2003; Peres et.al., 2000; Sadaquat et.al., 2000). Senyawa santon terutama dikenal dengan potensinya sebagai antikanker (Jabit et.al., 2009). Salah satu tanaman di genus ini yang mulai banyak diteliti yaitu Garcinia cowa Roxb. yang dikenal dengan nama daerah asam kandis atau kandis. Penelitian kali ini menggunakan fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis. Hasil penelitian terdahulu oleh Lenggo (2009) tentang uji efek sitotoksik dari ekstrak etanol akar asam kandis telah mendapatkan nilai IC 50 sebesar 6.06 µg/ml. Pengujian aktivitas sitotoksik fraksi dari ekstrak etanol akar asam kandis ini, dilakukan secara invitro dengan metoda Microtetrazolium (MTT) terhadap sel kanker payudara T47D yang didasari pada perubahan larutan reagen MTT (3-(4,5- dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) yang berwarna kuning menjadi kristal formazan yang bewarna ungu (Mosmann, 1983). Hasil yang diamati pada uji ini adalah perubahan warna yang dihasilkan akibat terbentuknya kristal formazan. Penelitian ini diharapkan memberikan hasil yang dapat membuktikan dan melihat dari aktivitas sitotoksin masingmasing fraksi dan hal ini dapat menunjukkan akar asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) mampudijadikan sebagai antikanker. METODA PENELITIAN Alat Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi adalah erlenmeyer berbagai ukuran, gelas ukur, corong, spatel, botol coklat, vial, kertas saring, rotary evaporator, dan alat destilasi. Alat-alat yang digunakan untuk uji aktivitas sitotoksik berupa sarung tangan karet, botol semprot, labu Erlenmeyer, gelas piala, flask T-25 (Iwaki ), botol Duran, tabung Appendorf (Iwaki ), pipet mikro (Ecopipette ), hemasitometer, timbangan analitik, autoklaf (Hirayama ), lemari es (Nasional ), inkubator 37 0 C/5% CO 2 (Thermo Scientific ), microbiological safety cabinet air flow kelas II (Thermo Scientific ), vortex (Etech ), penangas air (Memert ), sentrifus (Thermo Scientific ), tabung sentrifugal, mikroskop inverted (Zeiss ), plat 96 sumuran, dan spektrofotometer microplate (xmark TM ). Bahan Bahan yang digunakan untuk fraksinasi berupa ekstrak etanol akar asam kandis, heksan, etil asetat, dan aquadest. Sel kanker payudara manusia T47D, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol 70%, air ultrapurifikasi, medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin- Streptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate buffer Saline (PBS), dan reagen 3-(4,5- dimetilthiazol- 2- il)-2,5- difeniltetrazolium bromida (reagen MTT). Fraksinasi Ekstrak Etanol Akar Asam Kandis. Ekstrak etanol akar asam kandis difraksinasi dengan heksan dan air dalam corong pisah, dikocok secukupnya. Setelah itu dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan heksan dan lapisan air. Perlakuan ini dilakukan beberapa kali pengulangan sampai lapisan heksan terlihat jernih sehingga diperoleh fraksi heksan. Hasil fraksi heksan diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental dari fraksi tersebut. Lapisan air kemudian difraksinasi dengan etil asetat dilakukan beberapa kali pengulangan seperti perlakuan diatas sehingga diperoleh fraksi air dan fraksi etil asetat. Hasil fraksi etil asetat diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental. Kemudian fraksi 72

3 air di uapkan dengan rotary evaporator sehingga di dapatkan ekstrak kental. Kultur Sel a. Persiapan Alat Alat-alat yang digunakan untuk pengujian harus dalam keadaan bersih dan steril. Wadah plastik dipersiapkan hanya untuk satu kali pemakaian, dan sterilitasnya terjamin selama kemasan tidak rusak. Untuk alat-alat berbahan gelas, wadah dicuci bersih dan dikeringkan. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu C tekanan 15 lbs selama 15 menit. Sedangkan microbiological safety cabinet air flow kelas II disterilkan dengan cara disemprot dengan etanol 70% dan disinari lampu UV. b. Penyiapan Sel Sel kanker payudara yang digunakan yaitu sel T47D yang dikoleksi dari Universitas Gajah Mada (UGM). Sel kanker dikeluarkan dari freezer (-80 0 C), dihangatkan dalam penangas air pada suhu 37 0 C selama 2-3 menit. Setelah mencair, sel dipindahkan ke dalam flask yang telah berisi 10 ml media, diinkubasi selama 3-4 jam pada suhu 37 0 C/5% C0 2, kemudian diamati dibawah mikroskop untuk melihat apakah sel melekat di dasar flask. Medium pertumbuhan diganti sekali dalam dua hari dan bila jumlah sel di dalam flask mencapai 70-85%, lakukan subkultur sel. c. Penghitungan Sel kanker Medium dibuang kemudian ditambahkan 2 ml trypsin-edta ke dalam flask yang berisi kultur sel, kemudian inkubasi 10 menit. Setelah sel memisah, ditambahkan 3 ml medium RPMI. Ambil 10 µl suspensi sel, letakkan pada masingmasing kotak penghitungan sel hemasitometer. Lakukan penghitungan di bawah mikroskop. Tentukan rata-rata jumlah sel aktif yang ada untuk dapat membuat suspensi 2000 sel dalam setiap sumur pada plat 96 sumuran. d. Penambahan Sel Dibuat suspensi sel dalam medium (jumlah dan volume terukur), campur sempurna. Masukkan sebanyak 180 µl suspensi ke dalam masing-masing sumur kecuali sumur pada kolom pertama dan terakhir. Kolom pertama dan terakhir merupakan blanko yang hanya diisi medium, sedangkan kolom kedua merupakan kontrol yang diisi suspensi sel dalam medium. Inkubasi pada suhu 37 0 C, 5% CO 2 selama 24 jam. Pembuatan Larutan Uji a. Larutan Stok Ditimbang ekstrak sebanyak 100 mg. Larutkan ekstrak dalam 1 ml pelarut yang sesuai untuk mendapatkan konsentrasi larutan 100 mg/ml. Ekstrak harus dapat larut sempurna dalam pelarut yang digunakan. b. Pengenceran Larutan Uji Ke dalam 5 buah tabung appendorf dipipet 90 µl medium. Kemudian dibuat larutan induk dengan konsentrasi 10 mg/ml dengan cara memipet 10 µl larutan larutan stok kemudian dipindahkan ke dalam tabung pertama, aduk sempurna. Lakukan pengenceran bertingkat dengan cara memindahkan 10 µl larutan uji dari tabung pertama ke tabung kedua. Lakukan hal yang sama untuk tabung selanjutnya sehingga akan diperoleh larutan dengan konsentrasi 100, 10, 1 dan 0,1 µg/ml pada masingmasing sumur pada plat 96 sumuran. Uji Sitotoksik masing-masing fraksi (Uji MTT) a. Peletakan Larutan Uji Plat uji yang berisi sel dan telah diinkubasi selama 24 jam. Setiap bagian dirancang untuk empat kali replikasi. Peletakan larutan uji dimulai dari konsentrasi paling rendah. Pindahkan 20 µl larutan uji ke dalam masing-masing sumur uji. Ke dalam sumur kontrol masukkan 20 µl media, dan blanko hanya diisi dengan 200 µl media. Plat kembali diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator 37 0 C/ 5% CO 2. Amati perubahan yang terjadi pada sel selama masa inkubasi. 73

4 b. Peletakan Larutan MTT Larutan MTT 5 mg/ml dipipet 50 µl ke dalam masing-masing sumur. Kemudian inkubasi selama 3-4 jam pada 37 0 C, 5% CO 2. Setelah 3-4 jam, akan terlihat adanya endapan ungu kristal formazan. Medium yang mengandung reagen MTT dibuang dengan cara dihisap dari setiap sumur, sehingga yang tertinggal hanya endapan ungu kristal formazan. Larutkan endapan pada setiap sumur dengan 100 µl DMSO. Ukur serapannya dengan spektrofotometer micrroplate pada λ 550 nm. Analisis Data Dengan menggunakan data absorban yang diperoleh dari pengukuran, dapat ditentukan persentase sel yang terhambat dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Hubungan antara log konsentrasi larutan uji dengan viabilitas sel dapat ditampilkan dalam bentuk grafik. Dari grafik tersebut dapat ditentukan harga IC 50 dengan persamaan regresi linier dengan syarat r lebih besar dari r tabel, kemudian masukan y = 50% pada persamaan regresi linier (Y= AX+B) dan cari x nya kemudian dihitung, antilog dari konsentrasi tersebut sehingga diperoleh IC 50 (konsentrasi yang dapat menghambat 50% pertumbuhan sel) larutan uji (CCRC, 2009). Selanjutnya, data hubungan antara konsentrasi sediaan uji dengan absorban dianalisis secara statistik menggunakan analisa varian (ANOVA) satu arah yang dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan s Multiple Range Test). HASIL DAN DISKUSI Hasil Dari 40,5 g sampel ekstrak kental etanol akar asam kandis, kemudian difraksinasi berdasarkan tingkat kepolarannya sehingga didapatkan 2 fraksi yang seharusnya 3 fraksi didapatkan dengan jumlahnya yaitu fraksi heksan 0 gram, fraksi etil asetat 0,98 gram dan fraksi air 4,14 gram. Hasil perhitungan terhadap nilai % viabilitas pada fraksi etil asetat dan fraksi air : Tabel 1. Persen Viabilitas Sel yang Diuji dengan Fraksi Etil Asetat Konsentrasi % Viabilitas Sel Pengulangan 1 Pengulangan 2 Pengulangan ,09 4,36 23, ,93 53,60 46, ,42 67,18 84,56 0,1 57,35 78,76 52,79 Tabel 2. Persen Viabilitas Sel yang Diuji dengan Fraksi Air Konsentrasi % Viabilitas Sel Pengulangan 1 Pengulangan 2 Pengulangan ,13 84,21 90, ,70 99,64 115, ,61 56,97 57,75 0,1 76,78 46,69 76,14 74

5 IC 50 (Inhibitory Concentrasion) rata-rata dari 3 pengulangan pada fraksi etil asetat adalah: 0,52 µg/ml dan pada fraksi air adalah : 81,14 µg/ml. Grafik hubungan Konsentrasi fraksi etil asetat dengan %viabilitas sel kanker payudara T47D % viabilitas konsentrasi µg/ml rata-rata pengulang an Gambar 1. Grafik hubungan antara konsentrasi dengan % viabilitas fraksi etil asetat akar asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D. Konsentrasi hambat (IC 50 ) didapat dari grafik dengan persamaan regresi log konsentrasi vs % viabilitas sel. Data ditampilkan dalam rata-rata ± SD (n=3). 120 Grafik hubungan Konsentrasi fraksi air dengan %viabilitas sel kanker payudara T47D % Viabilitas konsentrasi µg/ml rata-rata pengulangan Gambar 2. Grafik hubungan antara konsentrasi dengan % viabilitas fraksi air akar asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D. Konsentrasi hambat (IC50) didapat dari grafik dengan persamaan regresi log konsentrasi vs % viabilitas sel. Data ditampilkan dalam rata-rata ± SD (n=3). 75

6 Pembahasan Pada penelitian ini, sampel yang digunakan yaitu ekstrak etanol akar asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) yang telah tersedia di Laboratorium Sentral Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang dengan jumlah sebanyak 40,5 gram. Sebelumnya telah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksik dari ekstrak etanol akar asam kandis dengan nilai IC 50 6,06 µg/ml (Lenggo, 2013). Dari pemeriksaan metabolit yang telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya, diketahui bahwa akar asam kandis mengandung senyawa fenolik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dari hasil fraksinasi ekstrak etanol akar asam kandis secara in-vitro. Keuntungan dari pengujian secara in-vitro ini adalah senyawa yang digunakan untuk pengujian ini relatif sedikit, kemudian waktu yang diperlukan lebih singkat dan dapat memberikan informasi mengenai efeknya secara langsung terhadap sel manusia yang telah di kultur. Uji in-vitro ini dilakukan terhadap sel kanker payudara manusia dan sel kanker payudara yang digunakan pada penelitian ini yaitu sel T47D. Dari hasil uji MTT diketahui bahwa fraksi etil asetat akar asam kandis memiliki nilai IC 50 0,52 µg/ml sedangkan fraksi air akar asam kandis juga memiliki nilai IC 50 81,14 µg/ml. Nilai IC 50 (konsentrasi yang dapat menghambat 50% pertumbuhan sel) didapatkan dengan menghitung persamaan regresi linear (Y=A+Bx) dari grafik antara log konsentrasi vs % viabilitas sel dimana syarat r lebih besar dari r tabel dan nilai r 2 dikatakan linear jika mendekati 1, kemudian masukan y = 50% pada persamaan regresi linier dan cari x nya kemudian dihitung, antilog dari konsentrasi tersebut sehingga diperoleh IC 50 (CCRC, 2009). Menurut The American National Cancer Institute, suatu ekstrak dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik apabila nilai IC 50 < 20 µg/ml (Lee & Houghton, 2005). Dengan demikian fraksi etil asetat akar asam kandis dinyatakan memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker T47D. Nilai 0,52 merupakan angka hasil rata-rata dari tiga kali pengulangan pengerjaan pada masing-masing uji sitotoksik dengan menggunakan fraksi etil asetat akar asam kandis. Sedangkan pada fraksi air didapatkan nilai IC 50 sebesar 81,14. KESIMPULAN Kesimpulan Dari hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa fraksi etil asetat memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC µg/ml, sedangkan fraksi air tidak memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC µg/ml. Berdasarkan data hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa fraksi etil asetat akar asam kandis berpotensi untuk dikembangkan sebagai sumber baru dalam mengembangkan obat kanker. Saran Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar dapat melakukan isolasi terhadap fraksi etil asetat akar asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) untuk menyelidiki senyawa aktif antikanker yang murni pada fraksi tersebut yang bersifat sitotoksik dan juga untuk melakukan perubahan dalam variasi waktu inkubasi. 76

7 DAFTAR PUSTAKA 1. CCRC. (2009). Prosedur Tetap Uji Sitotoksik Metode MTT. Yogyakarta: Fakultas Farmasi, UGM. 2. Departemen Kesehatan. (2009). Profil Kesehatan Indonesia Jakarta: Departemen Kesehatan RI. 3. Jabit, Md. Lip, Wahyuni, F.S, Rozida, K., Ahmad, I.D., Khozirah, S., Lajis Nordin H, & Johnson, S. (2009). Cytotoxic and nitric oxide inhibitory activities of methanol extracts of Garcinia species. Pharmaceutical Biology. 47(11): Lee, C.C & Houghton, P. (2005). Cytotoxicity of plants from Malaysia and Thailand used traditionally to treat cancer. J Ethnopharmacol, 2005; 100: Lenggo, S.(2013). Uji Efek Sitotoksik Fraksinasi Ektrak Etanol Akar Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D Dengan Metoda MTT. (Skripsi). Padang. F.Farmasi,UNAND. 6. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Method, 16;65(1-2), Tjindarbumi, D dan Mangunkusumo, R. (2002). Cancer in Indonesia: Present and Future. Jpn. J. Clin. Oncol. 32, S17-S Wahyuni, F.S., Byrne, L.T., Dachriyanus, Dianita, R., Jubahar, J., Lajis, N.H., & Sargent, M.V., (2004). A New Ring- Reduced Tetraprenyltoluquinone and a prenylated xanthone from Garcinia cowa. Aust. J. Chem. 57: