Laboratorium Keteknikan Pengolahan Pangan, Laboratorium Kimia Pangan dan

Transkripsi

1 IV. METODOLOGI PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitan ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Keteknikan Pengolahan Pangan, Laboratorium Kimia Pangan dan Laboratorium Teknologi Pengolahan Pangan Jurusan Teknologi Industri Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran. Waktu penelitian dilaksanakan pada bulan Januari - Mei Bahan dan Alat Percobaan Bahan Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah daun kemangi (O. sanctum L.) yang diperoleh dari Kampung Tugu Desa Cihanjuang Kecamatan Parongpong, Kabupaten Bandung Barat dan bahan pembuatan mi basah yakni terigu, garam, minyak, dan air. Media pertumbuhan mikroba menggunakan NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PCA ( Plate Count Agar), LBSS (Lactose Broth Single Strenght), LBDS (Lactose Broth Double Strenght), EMB (Eosin Methylene Blue), dan NaCl fis 0,85%. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah formalin 0,05%, etanol 70%, alkohol 95%, metylene blue, lugol, netral red, dan safranin. Kultur mikroba uji, yaitu E. coli dan A. niger. Bahan-bahan lain yang digunakan yaitu akuades, alumunium foil, clingwrap, kertas saring, kertas cakram, object glass, cover glass, kapas, kasa, dan spirtus. 26

2 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain beaker glass, gelas ukur, pipet ukur, bulb, labu erlenmeyer, cawan petri, spatula, panci, saringan, pasta maker, tabung durham, tabung reaksi, inkubator, pisau, vacuum filter, serangkaian alat rotary evaporator, spektrofotometer, autoklaf, neraca analitik, jarum ose, cawan alumunium, oven, mikropipet, desikator, mikroskop, bunsen, fin tip, botol semprot, refrigerator, Laminar Air Flow, kuvet, dan botol kaca gelap. 4.3 Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental yang dianalisis secara deskriptif dengan ulangan sebanyak 2 kali. Tahap pertama adalah melakukan determinasi bahan uji yaitu daun kemangi, pembuatan ekstrak daun kemangi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70%, serta pemeriksaan parameter non spesifik dan spesifik ekstrak uji. Kemudian dilakukan pengujian aktivitas antimikroba terhadap E. coli dan A. niger menggunakan metode difusi agar dengan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan 100%. Konsentrasi terbaik kemudian diaplikasikan pada mi basah dengan pembanding formalin 0,05% sebagai kontrol positif. 4.4 Pelaksanaan Penelitian Pelaksanaan percobaan terdiri dari dua tahap yakni uji aktivitas antimikroba dengan pembuatan ekstrak daun kemangi, pemeriksaan parameter ekstrak uji, serta pengujian aktivitas antimikroba pada bakteri E. coli dan jamur A. niger. Tahap

3 28 kedua adalah uji aplikasi pada mi basah menggunakan konsentrasi terbaik ekstrak etanol daun kemangi hasil uji aktivitas antimikroba Pembuatan Simplisia Daun Kemangi Daun kemangi (O. sanctum L) yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari Kp. Tugu Desa Cihanjuang Kecamatan Parongpong Kabupaten Bandung Barat. Bahan uji daun kemangi dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran. Hasil determinasi dapat dilihat di Lampiran 2. Daun kemangi segar disortasi dan dicuci dengan air mengalir yang bertujuan untuk menghilangkan kotoran yang mungkin menempel pada daun kemangi. Pengeringan daun kemangi dilakukan dengan cara di angin-anginkan dan terlindung dari matahari langsung untuk mempertahankan kandungan volatil dalam daun kemangi (Soemari, 2017). Selanjutnya dilakukan sortasi kering yang bertujuan untuk memisahkan benda asing seperti benang, rambut, dan pengotor lain yang mungkin menempel selama proses pengeringan. Daun kemangi yang telah kering kemudian dilakukan pengecilan ukuran untuk memperbesar luas permukaan sehingga kontak dengan pelarut menjadi lebih optimal. Pengecilan ukuran dilakukan menggunakan grinder atau blender dengan waktu yang sangat singkat agar simplisia daun kemangi tidak sampai halus, sehingga saat dilakukan proses penyaringan bubuk daun kemangi dapat tersaring secara optimum dan meminimalisir kemungkinan adanya bubuk daun kemangi yang terbawa saat evaporasi (Depkes RI, 2000). Selanjutnya penyimpanan

4 29 simplisia daun kemangi dalam wadah yang tertutup rapat dan terlindung dari matahari langsung pada suhu kamar (Soemari, 2017). Diagram proses pembuatan simplisia daun kemangi dapat dilihat pada Gambar 6. Daun Kemangi Determinasi Tanaman Sortasi dan Pencucian Pengeringan T : 6-7 hari l Sortasi Kering Pengecilan Ukuran Simplisia Daun Kemangi Gambar 6. Diagram Proses Pembuatan Simplisia Daun Kemangi (Modifikasi Soemari, 2017) Pembuatan Ekstrak Daun Kemangi Simplisia kering daun kemangi yang telah jadi kemudian dimaserasi menggunakan etanol 70% sampai semua serbuk kemangi terendam dengan perbandingan berat sampel dan etanol 70% adalah 1:5 (b/v). Perendaman dilakukan selama 2-3 hari dengan pengadukan setiap hari atau sesering mungkin. Setelah dimaserasi, disaring menggunakan vacuum filter, sehingga diperoleh filtrat dan ampas.. Filtrat kemudian dikentalkan menggunakan rotary evaporator dengan

5 30 suhu heating bath sebesar 40 0 C dan suhu chiller C, selama + 1,5 jam atau tergantung banyaknya larutan sehingga diperoleh ekstrak kental (Yulianingtyas dan Bambang, 2016). Diagram proses pembuatan ekstrak daun kemangi dapat dilihat pada Gambar 7. Simplisia daun kemangi Maserasi dengan etanol 70% T : 2-3 hari Penyaringan filtrat Ampas Evaporasi T : 40 0 C ; t : + 1,5 jam Ekstrak kental daun kemangi Gambar 7. Diagram Proses Ekstrak Daun Kemangi (Modifikasi Atikah, 2013) Parameter Ekstrak Uji Ekstrak daun kemangi kemudian diuji berdasarkan parameter spesifik berupa uji kadar air dan parameter non spesifik berupa uji organoleptik sebagai berikut: 1) Uji Kadar Air (AOAC, 2006)

6 31 a. Disiapkan cawan kosong dan dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 o C. b. Cawan didinginkan dalam desikator selama 15 menit lalu ditimbang hingga berat yang dihasilkan konstan. c. Sampel ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam cawan. d. Cawan berisi sampel dimasukkan ke dalam oven selama + 3 jam pada suhu 105 o C + 2 o C. e. Cawan yang berisi sampel dikeluarkan dari oven lalu dimasukkan ke dalam desikator selama + 15 menit dan ditimbang. f. Pengeringan dilakukan sampai didapatkan berat yang konstan dengan selisih 0,2% dari berat sampel kering sebelumnya. g. Perhitungan kadar air dilakukan menggunakan rumus berikut: Keterangan: Kadar air (%bb) = a b a x 100% - a = berat awal sampel (g) - b = berat sampel setelah dikeringkan (g) 2) Uji organoleptik yang dilakukan menggunakan panca indera meliputi bentuk, warna, dan bau (Depkes RI, 2000) Pengujian Aktivitas Antimikroba Ekstrak Daun Kemangi Persiapan Kultur Mikroba Uji Persiapan kultur mikroba uji dilakukan untuk menumbuhkan bakteri maupun jamur uji agar dapat berkembang saat dicampurkan dengan media padat dalam uji aktivitas antimikroba.

7 32 1) Pembuatan Suspensi E.coli Bakteri disuspensikan dalam 9 ml larutan NaCl fis 0,85% lalu dibandingkan dengan McFarland 0,5. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi suspensi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm sampai diperoleh absorbansi 0,08-0,13 (setara dengan 1,5x10 8 CFU/mL). Diagram proses pembuatan suspensi E. coli dapat dilihat pada Gambar 8. 9 ml NaCl fis 0,85% Sterilisasi dalam autoklaf T = C, t = 15 menit Kultur murni E. coli Pencampuran sampai kekeruhan menyerupai McFarland 0,5 Uji absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm Suspensi E. coli Gambar 8. Diagram Proses Pembuatan Suspensi E. coli (Biologicals, 2014) 2) Pembuatan Suspensi A. niger Jamur yang telah diinkubasi selama 3-5 hari kemudian diluruhkan menggunakan NaCl fis 0,85% lalu dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 530 nm dan distandarisasi

8 33 menggunakan larutan McFarland untuk memperoleh inokulum sebanyak 1 x 10 8 CFU/mL menggunakan spektrofotometer dengan larutan NaCl fis 0,85% sebagai blanko. Diagram proses pembuatan suspensi A. niger dapat dilihat pada Gambar 9. Kultur murni A. niger NaCl fis 0,85% Peluruhan Uji absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm Standarisasi McFarland 0,5 Suspensi A. niger Gambar 9. Diagram Proses Pembuatan Suspensi A. niger (Modifikasi Cappuccino dan Sherman, 2001) Penentuan Aktivitas Antimikroba Aktivitas antibakteri dan antijamur dapat ditentukan dengan metode difusi agar. Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri dan jamur uji dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium NA steril untuk bakteri dan PDA untuk jamur. Kemudian letakkan cakram kertas dan tetesi larutan uji konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75% dan 100% sebanyak 40 µl pada permukaan agar. Pengenceran dilakukan menggunakan aquades karena konsentrasi terbaik akan diaplikasikan pada mi basah, sehingga larutan pengencer harus aman untuk dikonsumsi. Diinkubasi selama 1 2 hari pada suhu 37 o C untuk bakteri dan 3 5 hari pada suhu 25 o C

9 34 28 o C untuk jamur. Aktivitas antibakteri diamati berdasarkan zona bening yang terbentuk disekeliling kertas cakram. Diagram proses dapat dilihat pada Gambar 10. Medium Nutrient Agar (NA) dan Potato Dextrose Agar (PDA) Penuangan ke cawan petri dan dibiarkan membeku 0.1 ml suspensi bakteri yang telah diukur absorbansinya, diinokulasi pada medium NA 0.1 ml suspensi jamur yang telah diukur absorbansinya, diinokulasi pada media PDA Peletakkan dan penetesan cakram kertas dengan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan 100% pada permukaan medium NA Peletakkan dan penetesan cakram kertas dengan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan 100% pada permukaan medium PDA Inkubasi selama 1-2 hari, suhu 37 0 C (bakteri) Inkubasi selama 3-5 hari, suhu C (jamur) Pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk Data diameter zona hambat / mm Gambar 10. Diagram Proses Uji Aktivitas Antimikroba (Modifikasi Atikah, 2013)

10 Penentuan Aktivitas Antimikroba pada Mi Basah Pembuatan mi basah matang dilakukan berdasarkan Pahrudin (2006), dengan melakukan penimbangan tepung terigu (100%), garam (1%), Na2CO3 (0,6%), dan air (34%) untuk 1 adonan. Kemudian dilakukan pengadukan bahanbahan kering selama + 1 menit lalu ditambahkan air sedikit demi sedikit dan ditambahkan berbagai perlakuan yakni ekstrak daun kemangi konsentrasi terbaik, formalin 0,05% (Pransiska & Taty, 2016) sebagai kontrol positif, dan tanpa pemberian apapun sebagai kontrol negatif. Masing-masing adonan diaduk kembali selama menit lalu digiling hingga membentuk lembaran dan dilakukan pemotongan menggunakan pasta maker hingga didapatkan bentuk mi yang diinginkan. Selanjutnya dilakukan perebusan menggunakan air sebanyak 4 kali lipat dari jumlah mi yang telah diberi minyak kelapa (10% dari air rebusan) (Sihombing, 2007). Mi basah dengan berbagai perlakuan kemudian ditutup dengan cling wrap dan disimpan pada suhu kamar (+ 25 o C). Kemudian dilakukan pengamatan dengan uji mikrobiologi, uji mutu kimia, dan uji organoleptik mi basah dengan waktu interval adalah setiap hari selama 4 hari. Diagram alir aplikasi ekstrak daun kemangi dapat dilihat pada Gambar 11.

11 36 Bahan baku mi basah Pengadukan bahan-bahan kering (t : 1 menit) Pencampuran air sedikit demi sedikit Tanpa perlakuan (kontrol -) Penambahan ekstrak daun kemangi konsentrasi terbaik Penambahan formalin 0,05% (kontrol +) Pengadukan adonan (t : 4-5 menit) Pembentukan lembaran Pemotongan mi menggunakan pasta maker Perebusan (t : + 2 menit) Mi basah matang Gambar 11. Diagram Proses Aplikasi Ekstrak Daun Kemangi (Modifikasi Sihombing, 2007)

12 Kriteria Pengamatan Kriteria pengamatan yang dilakukan terbagi menjadi dua pengamatan yakni pengamatan terhadap uji aktivitas antimikroba dan uji kualitas mi basah sebagai berikut: 1) Uji Aktivitas Antimikroba (Modifikasi Atikah, 2013) a. Perhitungan diameter zona hambat antimikroba 2) Uji Kualitas Mi Basah a. Uji mikrobiologi meliputi uji Total Mikroba (Badan Standarisasi Nasional, 2014), total coliform (Badan Standarisasi Nasional, 2008), dan total kapang (Badan Standarisasi Nasional, 2015). b. Mutu kimia mi basah yang meliputi uji kadar air (AOAC, 2006). c. Uji organoleptik mi basah berdasarkan panca indera yang meliputi warna, aroma, dan tekstur yang dilakukan setiap hari selama 4 hari (Depkes RI,2000). Metode yang akan digunakan adalah uji mutu hedonik dengan panelis semi terlatih sebanyak 15 orang (Soekarto, 1985).