BAB 4 METODE PENELITIAN. Penelitian ini merupakan penelitian true experimental dengan menggunakan. metode post test only control group design.

Transkripsi

1 BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian true experimental dengan menggunakan metode post test only control group design. 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada bulan Desember 2017 hingga Januari 2018 selama kurang lebih 36 hari. 4.3 Populasi dan Sampel Populasi Populasi penelitian adalah tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar dewasa Sampel Sampel diambil secara random dari populasi tikus putih (Rattus novergicus) strain wistar jantan sebagai hewan coba. Sampel terdiri atas 4 kelompok Besar Sampel Estimasi besar replikasi yang digunakan pada penelitian ini adalah dengan rumus berikut: (r 1)(p 1) 15 (r 1)(4 1) 15 22

2 23 4r 3 15 r 4,5 (Supranto, 2007) Keterangan: p r = perlakuan = jumlah replikasi perlakuan Dalam penelitian ini dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 5 ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang digunakan adalah 20 ekor. Masing masing kelompok diberikan 2 ekor tikus cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati saat proses adaptasi atau penelitian sehingga di dalam penelitian ini total tikus yang digunakan adalah 28 ekor tikus Teknik Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan teknik pengambilan sampel simple random sampling Karakteristik Sampel Penelitian a. Kriteria Inklusi Tikus Putih 1) Umur 2-3 bulan 2) Berat badan gram 3) Jantan, strain wistar 4) Sehat, ditandai dengan gerakan yang aktif (normal) dan bulu yang tebal berwarna putih serta matanya jernih.

3 24 b. Kriteria Eksklusi Tikus yang tidak mau makan, kondisinya menurun atau mati selama adaptasi c. Kriteria Drop Out Tikus yang tidak mau makan, kondisinya menurun atau mati selama perlakuan. 4.4 Variabel dan Definisi Operasional Variabel Bebas Ekstrak Kulit Jeruk Lemon Variabel Tergantung Kadar trigliserida pada tikus putih jantan (Rattus novergicus strain wistar). 4.5 Definisi Operasional No. Variabel 1. Ekstrak kulit jeruk lemon (Citrus limon) Definisi Operasional Ekstrak kulit jeruk lemon adalah ekstrak kulit jeruk lemon kering yang dimaserasi menggunakan sistem pelarut etanol 96% dan aseton dengan dosis 125 mg/kgbb, 250 Alat Ukur Hasil Skala Ukur Ukur Timbangan mg/kgbb Kategorik

4 25 mg/kgbb dan 500 mg/kgbb 2. Kadar Kadar trigliserida Menggunakan mg/dl Numerik Trigliserida tikus putih rumus (Rattus novergicus strain wistar) 4.6 Bahan dan Instrumen Penelitian Bahan a. Ekstrak Kulit Jeruk Lemon (Citrus limon) b. Induksi minyak goreng deep frying 1 ml/100gram BB atau sama dengan 0,3 0,4 ml peroral (Sutejo dan Dewi, 2012) c. Reagen untuk pemeriksaan kadar trigliserida d. Diet pakan tikus BR-1 e. Kloroform Instrumen a. Alat Pemeliharaan Tikus 1) Kandang tikus 2) Penutup kandang dari anyaman kawat 3) Botol air 4) Timbangan 5) Tempat makan tikus b. Alat Pembedahan Tikus 1) Gunting 2) Pinset

5 26 3) Botol sediaan 4) Handscoon 5) Pengait jaringan 6) Pisau bedah c. Alat lain 1) Sonde 2) Kamera digital 3) Spuit injeksi 3 ml 4) Label 4.7 Prosedur Penelitian Pembagian Kelompok Tikus Tikus yang digunakan dibagi menjadi 4 kelompok dengan menggunakan 5 ekor tikus di setiap kelompok sehingga jumlah total tikus minimal yang digunakan adalah 20 ekor. Masing masing kelompok diberikan 2 ekor tikus cadangan untuk mengantisipasi adanya tikus yang sakit atau mati saat proses adaptasi atau penelitian, sehingga dalam penelitian ini total tikus yang digunakan adalah 28 ekor tikus. a. Kontrol positif: diberikan induksi minyak goreng deep frying selama 14 hari tanpa pemberian ekstrak kulit jeruk lemon, kemudian diberi pakan standar pada 15 hari berikutnya. b. Kelompok 1: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1 ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak 25 mg/ekor/hari selama 15 hari

6 27 c. Kelompok 2: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1 ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak 50 mg/ekor/hari selama 15 hari d. Kelompok 3: diberikan induksi minyak goreng deep frying 1ml/100gr BB tikus selama 14 hari dengan pemberian ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak 100 mg/ekor/hari selama 15 hari Adaptasi Proses adaptasi hewan coba dalam kandang dilakukan selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Jeruk Lemon Dosis yang dipakai menurut Muhtadi dalam National Journal of Physiology, Pharmacy and Pharmacology (2015) adalah 125 mg/kgbb, 250 mg/kgbb dan 500 mg/kgbb. Berat tikus adalah sekitar gr sehingga ekstrak kulit jeruk lemon yang diberikan yaitu: Dosis I Dosis II Dosis III = 125 mg/kgbb x (0,15-0,2) = 18, mg/ekor/hari = 250 mg/kgbb x (0,15-0,2) = 37,5-50 mg/ekor/hari = 500 mg/kgbb x (0,15-0,2) = mg/ekor/hari Pemberian Minyak Goreng Deep Frying Pembuatan minyak goreng deep frying menggunakan minyak curah yang dipanaskan berulang sebanyak lima kali untuk menggoreng gorengan selama 10 menit. Minyak goreng deep frying didapatkan dari membeli minyak goreng di pasar Mergan dan diberikan kepada penjual gorengan di sebelah Kampus 2 Universitas Muhammadiyah Malang untuk

7 28 digunakan sebanyak lima kali penggorengan. Minyak yang digunakan adalah minyak yang sama (tidak diganti dan tidak dilakukan penambahan volume minyak segar). (Budinastiti et al., 2016). Pemberian minyak goreng deep frying pada tikus diberikan 1 kali dalam sehari 1ml/100gr BB tikus atau setara dengan 0,3 0,4 ml peroral. Dalam penelitian sebelumnya menunjukkan pemberian minyak goreng deep frying dapat meningkatkan kadar trigliserida pada tikus selama 15 hari ( g) (Sutejo dan Dewi, 2012) Pembuatan Ekstrak Kulit Lemon (Citrus limon) a. Pembuatan serbuk kulit lemon Jeruk Lemon didapatkan dari UPT Materia Medica Batu. Kulit jeruk lemon yang dikumpulkan, dibersihkan dan dipotong potong kecil, dikeringkan, dan diblender menjadi bubuk. Bubuk kering ditimbang dan siap untuk diekstrak. b. Proses ekstraksi Ekstrak kulit jeruk lemon disiapkan dengan maserasi atau perendaman menggunakan sistem pelarut etanol 96% dan aseton dengan rasio 4:1 yang dijauhkan dari sinar matahari dan diaduk selama 3 hari. Maserasi lalu difilter dengan corong Buchner. Ampas yang tersisa dimaserasi kembali dua kali lagi. Filtrasi dari ekstrak digabungkan dan dipekatkan menggunakan evaporator untuk mendapatkan ekstrak kering. Ekstrak kulit jeruk lemon yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

8 29 Dosis 1 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 18,75-25 x 7 x 15 = 1968, mg Dosis 2 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : 37,5-50 x 7 x 15 = 3937, mg Dosis 3 (untuk 7 tikus selama 15 hari) : x 7 x 15 = mg Jadi, total kebutuhan ekstrak kulit jeruk lemon sebanyak ,25 mg mg Proses Pengambilan Darah, Anastesi dan Pembedahan Hewan Coba a. Proses Anastesi Proses anastesi dilakukan satu persatu terhadap hewan coba yaitu dengan cara memasukkan hewan coba ke dalam toples kaca yang berisi kapas yang sudah dicampur dengan kloroform karena bahan ini mudah didapat. Anastesi dilakukan secara inhalasi pada hewan coba dengan dosis kloroform 10 ml per 10 hewan coba, anastesi dilakukan sampai tikus pingsan, kemudian dihitung selama 20 detik, kemudian langsung diangkat dari toples pembiusan untuk dilakukan pembedahan b. Proses Pembedahan Setelah hewan coba teranastesi dengan baik (keadaan pingsan), hewan coba diletakkan pada meja lilin dan keempat kaki hewan coba difiksasi terhadap meja lilin dengan menggunakan jarum pentul. Dengan menggunakan gunting bedah, dilakukan pembedahan pada

9 30 abdomen hingga setinggi leher. Dengan menggunakan spuit 3 ml, darah hewan coba diambil dari ventrikel kiri sebanyak ± 3 ml Penguburan Tikus Percobaan Setelah hewan coba dibedah, harus dipastikan bahwa hewan coba tidak mengalami recovery. Sebelum dilakukan penguburan hewan coba, dipastikan bahwa denyut nadi sudah berhenti. Jika hewan coba mengalami recovery maka harus dilakukan prosedur euthanasia, salah satunya dengan prosedur Cervical Dislocation, yaitu dengan cara memisahkan tengkorak dan vertebrae (Alexandru, 2011). Setelah dibedah, hewan coba akan dikuburkan dengan cara (SEPA,2009) : 1. Tikus dibungkus dengan polibag 2. Tikus dimasukkan ke dalam lubang pada tanah yang kering dengan kedalaman 1 meter dan jarak minimal 250 meter dari sumber air 3. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus Pemeriksaan Kadar Trigliserida Pemeriksaan kadar trigliserida dilakukan dengan metode glycerol-3- phosphate oxidase phenol aminophenazone (GPO PAP). Sebanyak 10 µl serum direaksikan dengan reagen trigliserida sebanyak 1000 µl lalu diinkubasi pada suhu 25 o C selama 20 menit atau pada suhu 37 o C selama 10 menit. Serapan larutan dibaca pada panjang gelombang 500 nm dengan menggunakan alat spektrofotometer. Pengukuran dilakukan terhadap reagen yang digunakan sebagai blanko (Baron, 2007). Trigliserida (mg/dl) = Absorban Sampel x konsentrasi standar trigliserida Absorbansi Standar

10 Alur Penelitian Adaptasi hewan coba selama 7 hari Kontrol positif Kelompok 1 Kelompok 2 Kelompok 3 Minyak goreng deep frying 1ml/100gram BB tikus selama 14 hari tanpa dilanjutkan pemberian ekstrak kulit lemon Minyak goreng deep frying 1ml/100gramB B tikus selama 14 hari dilanjutkan pemberian ekstrak kulit lemon 125 mg/kgbb/hari selama 15 hari Minyak goreng deep frying 1ml/100gramB B tikus selama 14 hari dilanjutkan pemberian ekstrak kulit lemon 250 mg/kgbb/hari selama 15 hari Minyak goreng deep frying 1ml/100gramB B tikus selama 14 hari dilanjutkan pemberian ekstrak kulit lemon 500 mg/kgbb/hari selama 15 hari Pembedahan dan pengambilan darah pada jantung tikus menggunakan spuit 3 cc Pemeriksaan kadar trigliserida Tikus yang telah dipastikan mati dikubur Analisa data 4.9 Analisis Data Data-data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji Bonferroni, uji regresi linier yang

11 32 diolah menggunakan program SPSS 23 (Statistical Product and Service Solution versi 23). a. Uji normalitas dengan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang digunakan 50. Data dianggap normal jika hasil p > 0,05. Jika hasil p < 0,05 maka data dapat ditransformasi. b. Uji homogenitas dengan uji Levene digunakan untuk menentukan varian data sama atau tidak. Apabila distribusi data normal dan homogen dilanjutkan dengan uji one way ANOVA. c. Uji one way ANOVA membuktikan adanya perbedaan yang bermakna antara kontrol dengan perlakuan dengan perubahan kadar trigliserida. Hasil uji ANOVA dikatakan ada perbedaan yang bermakna jika signifikansi (sig) < 0.05 d. Uji Bonferroni digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna antara masing-masing kelompok perlakuan dalam penelitian. e. Uji regresi linier untuk mengetahui seberapa besar pengaruh antara dosis ekstrak kulit jeruk lemon terhadap kadar trigliserida Jadwal Penelitian Tabel 4.1 Jadwal Penelitian No Jenis Kegiatan Bulan Pengurusan Izin x 2 Persiapan buah lemon dan hewan coba x 3 Proses adaptasi x hewan coba 4 Pembuatan x x ekstrak buah lemon 5 Pemberian induksi minyak x x

12 33 goreng deep frying 6 Pemberian ekstrak buah lemon x x 7 Dilakukan pemeriksaan kadar trigliserida x 8 Analisa data x x 9 Konsultasi dan revisi akhir x x x x

13