BAB III. METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III. METODE PENELITIAN 3.1. Jenis & Rancangan Penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan pretest-posttest with control group design Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium PAU (Pusat Antar Universitas) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta pada bulan September 2014 sampai dengan Januari Populasi dan Subyek Penelitian Tikus Putih Subyek penelitian ini adalah tikus Wistar jantan yang didapat dari Laboratorium PAU UGM dengan kriteria sebagai berikut: 1. Sehat (aktif, memberontak bila dipegang, tidak ada benjolan patologis, kulit tidak kusut dan tidak bau) 2. Usia minggu 3. Berat badan gram 4. Jenis kelamin jantan Subyek dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan secara acak. Jumlah subyek dihitung berdasarkan rumus Federer (David, 2008) yaitu: Keterangan: n= jumlah subyek per kelompok t= jumlah kelompok (n-1)(t-1) 15 1

2 2 sehingga didapatkan jumlah sampel: (n-1)(6-1) 15 (n-1)x5 15 (n-1) 15/5 n 3+1 n 4 Berdasarkan hasil perhitungan dengan rumus Federer didapatkan bahwa tiap kelompok memiliki jumlah subyek sebanyak 4 ekor. Dengan demikian jumlah subyek secara keseluruhan adalah 24 ekor. a. Kelompok 1 adalah tikus sehat yangdiberi plasebo berupa larutan Na- CMC. b. Kelompok 2 adalah tikus DM tipe 2 yang diberi plasebo berupa larutan Na-CMC. c. Kelompok 3 adalah tikus DM tipe 2 yang diberi glibenklamid 5 mg/kgbb perhari peroral (Putri, 2013). d. Kelompok 4 adalah tikus DM tipe 2 yang diberi kuersetin 20 mg/kg berat perhari peroral (Anjaneyulu & Chopra, 2004). e. Kelompok 5 adalah tikus DM tipe 2 yang omega mg/kgbb/hari peroral (Putri, 2013). f. Kelompok 6 adalah tikus DM tipe 2 yang diberi kuersetin 20 mg/kgbb/hari peroral dan omega mg/kgbb/hari peroral Variabel Penelitian a. Variabel bebas pada penelitian ini adalah dosis kuersetin dan omega-3. b. Variabel terikat pada penelitian ini adalah kadar LDL serum darah pada tikus wistar sebelum dan sesudah perlakuan. c. Variabel terkendali dari penelitian ini adalah usia tikus, berat badan tikus, jenis kelamin tikus, dan pakan tikus.

3 3 3.5.Definisi Operasional 1. Tikus DM adalah tikus dengan kadar gula darah puasa lebih dari 126 mg/dl 1 minggu setelah diinduksi dengan Streptozotocin dan Nicotinamide (Barik et al., 2008). 2. Kadar LDL adalah kadar LDL yang diukur pada sampel serum darah tikus yang diambil dari sinus orbitalis menggunakan metode spektrofotometri. 3. Kuersetin adalah bubuk kuersetin yang dibuat dalam bentuk suspensi menggunakan 0,5% sodium carboxy methylcellulose (CMC) (Anjaneyulu & Chopra, 2004). 4. Omega-3 adalah konsentrasi omega-3 yang terkandung dalam Barlean s Lignan Flax Oil (Black et al., 1989) Bahan penelitian 3.6. Instrumen Penelitian 1. Streptozotocin (STZ) dosis 60 mg/kgbb yang dilarutkan dengan citrate buffer ph 4,5 sekali pemberian secara intra (Szkudelski, 2012). peritoneal 2. Nicotinamide dosis 120 mg/kgbb yang dilarutkan,9% NaCl sekali pemberian secara intra peritoneal (Szkudelski, 2012). 3. Pakan tikus AIN93M sekitar 26 kg dibuat dalam bentuk pellet (Reeves et al., 1993) yang terdiri dari: a. Kasein b. Tepung maizena c. Tepung gula d. Serat (CMC) e. Minyak kedelai f. Mineral mix (AIN-93M-Mx) g. Vitamin mix (AIN-93 Vx) h. L-Cystine i. Choline bitartrate 159 gram/kg 615 gram/kg 96 gram/kg 48 gram/kg 46 gram/kg 48 gram/kg 27 gram/kg 2,7 gram/kg 7,7 gram/kg 5. Bubuk kuersetin sebanyak 10 gram yang disuspensikan dengan sodium Carboxymethylcellulose (CMC) 0,5% (Anjaneyulu & Chopra, 2004).

4 4 6. Ketamin untuk anestesi tikus secara intramuskular. 7. Alkohol untuk desinfeksi. 8. Eter untuk anestesi sedasi pada akhir penelitian. 9. Reagen glukosa kit untuk pemeriksaan kadar glukosa darah menggunakan metode spektrofotometri. 10. LDL kit. 11. Akuades dan akuabidest Alat penelitian 1. Kandang tikus yang terbuat dari kawat dengan ukuran 18 cm x 24 cm x 25 cm, beserta tempat pakan dan botol air untuk tiap tikus. 2. Tabung mikrohematokrit. 3. Timbangan digital. 4. Sonde/kanul untuk memberikan suspensi kuersetin dan omega-3 pada tikus. 5. Microtube 1,5 cc untuk pengambilan darah tikus. 6. Alat spektrofotometri, kuvet. 7. Freezer 8. Mikropipet, yellow tip, blue tip, sarung tangan lateks, kapas gulung dan tisu.

5 3.7. Tahap Penelitian a. Persiapan. b. Penimbangan berat badan tikus. c. Tikus diadaptasi selama 1 minggu pada suhu kamar, kelembaban, dan pencahayaan yang cukup. d. Pemeriksaan kadar gula darah sebelum induksi setelah sebelumnya dipuasakan selama 12 jam dan dianestesi menggunakan ketamin sebelum pengambilan darah. e. Tikus kelompok DM diinjeksi Streptozotocin (STZ) secara intraperitoneal dengan dosis 60 mg/kg berat badan sekali pemberian yang dilarutkan pada 100 mm buffer sitrat ph 4,5 dingin. f. Setelah 15 menit pemberian STZ, tikus diinjeksi Nicotinamide dengan dosis 120 mg/kg berat badan sekali pemberian secara intraperitoneal. g. Subjek diperiksa kadar gula darah puasa 1 minggu setelah diinduksi. Sebelum pemeriksaan darah pre-test, hewan uji dipuasakan selama 12 jam dan dianestesi menggunakan ketamin. h. Pemeriksaan kadar LDL pre-test 3 hari setelah tikus dinyatakan DM. i. Tikus mulai diberi perlakuan sesuai dengan kelompoknya. j. Penimbangan berat badan dilakukan tiap 1 minggu. k. Pengambilan darah kembali untuk pemeriksaan kadar gula darah dan LDL post-test setelah 4 minggu perlakuan dengan prosedur yang sama. l. Euthanasia. 5

6 6 Bagan Tahap Penelitian Minggu 1 24 ekor tikus dibagi menjadi 6 ekor Adaptasi selama 1 minggu Pemeriksan kadar gula darah K1 K2 K3 K4 K5 K6 Minggu 2 INDUKSI DM (STZ dan NA secara intraperitoneal) Minggu 3 PRETES PEMERIKSAAN KADAR GULA DARAH DAN KADAR LDL (1 mingu setelah induksi DM) Tikus dengan kadar gula darah >126 mg/dl dinyatakan sebagai tikus DM K1= diberi plasebo K2= diberi glibenklamid 5 mg/kgbb/hari K3= diberi kuersetin 20 mg/kgbb/hari K4= diberi omega mg/kgbb/hari K5= diberi kuersetin 20 mg/kgbb/hari + omega mg/kgbb/hari PEMERIKSAAN KADAR LDL & GLUKOSA DARAH PUASA Minggu 6 Euthanasia Gambar 4. Bagan Tahap Penelitian

7 7 Pemeriksaan kolesterol LDL Metode :Precipitation Reagent For in Vitro Determination of LDL- Colesterol With The CHOD-PAP Method by photometric systems Bahan : LDL kit Diasys Prosedur : 1) Presipitasi Seratus mikroliter sampel pada masing-masing tabung dicampur dengan reagen presipitan LDL sebanyak 1000µl dan dicampur menggunakan Fortex. Seluruh tabung kemudian diinkubasi selama 10 menit dalam suhu ruangan yaitu 20-25º C. Lakukan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Akan terjadi endapan atau presipitasi di dasar tabung dan bagian cair yang disebut dengan supernatant. 2) Determinasi kolesterol Pembuatan sampel dilakukan dengan mencampur 100 µl supernatant dari tiap-tiap tabung sampel sebelumnya dengan reagen kit total LDL sebanyak 1000 µl dan dicampur menggunakan fortex. Seluruh tabung kemudian diinkubasi selama 10 menit dalam suhu ruangan yaitu 20-25º C. Pembuatan standard dengan mencampur 100 µl dan 1000 µl reagen kit total LDL dilakukan dengan cara yang sama dengan pembuatan sampel. Seluruh sampel beserta standar kemudian dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm. Perhitungan :

8 Metode Analisis Data Semua hasil digambarkan dengan nilai rata-rata dan standar deviasi. Distribusi normal data diuji dengan Saphiro-Wilk. Perbedaan variabel antar kelompok diuji dengan One Way ANOVA. Analisis perbandingan data pre dan post test menggunakan t-test berpasangan Etika Penelitian 1. Penelitian telah lolos kaji etik dari Komite Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia dengan nomor 29/Ka.Kom.Et/70/KE/III/ Hewan coba diperlakukan sesuai dengan prosedur etik dan tidak menyakiti hewan coba dalam setiap perlakuan. 3. Hewan coba akan dieuthanasia dengan cara anestesi-sedasi inhalasi eter hingga tikus benar-benar mati. 4. Pasca kematian hewan akan diambil organnya untuk penelitian lain yang sudah memiliki judul definitif. 5. Setelah selesai digunakan, hewan coba dimusnahkan menggunakan insenerator.