METODE KERJA PEMBUATAN MEDIA

Transkripsi

1 21 METODE KERJA PEMBUATAN MEDIA Media PDA dibuat dengan cara melarutkan 39 g PDA (Difco) ke dalam 1 L akuades lalu disterisasi, kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum (Fassatiova, 1986). Media Hans dibuat dengan cara melarutkan : 0,5 gram K 2 HPO 4, 0,5 gram KH 2 PO 4, 1 gram (NH 4 ) 2 SO 4, 0,1 gram Ca Cl 2, 6 gram Na Cl, 0,1 gram yeast ekstrak, 10 gram selulosa dan 20 gram agar ke dalam 1 L akuades lalu disterilisasi, kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum (Rao, 1982). Media YEDP dibuat dengan cara melarutkan 10 gram yeast ekstrak, 20 gram pepton, 20 gram glukosa, 18 gram agar ke dalam 1 L akuades lalu disterilisasi, kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum (Granot et al. 2003) Media PDB dibuat dengan cara sebagai berikut. Kentang dikupas, dibersihkan, dicacah dan ditimbang sebanyak 200 g, dicampur dengan 1 L air direbus hingga mendidih. Setelah mendidih air rebusan kentang disaring dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1 liter dicampur dengan 20 g sukrosa teknis dan diaduk hingga larut, kemudian dibagi ke dalam erlenmeyer 250 ml, lalu disteril, kemudian didinginkan. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam (Fassatiova, 1986) Media Hans Cair dibuat dengan cara melarutkan komposisi bahan kimia media Hans padat tanpa agar, lalu disterilisasi, kemudian didinginkan. Media cair yang sudah dingin siap untuk ditanam (Rao, 1982). Media YEDP Cair Dibuat dengan cara melarutkan komposisi bahan kimia media YEDP padat tetapi tanpa agar, lalu disterilisasi, kemudian didinginkan. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam (Granot et al. 2003).

2 22 Media Fermentasi untuk hidrolisis Enzimatis dibuat dengan cara melarutkan Media nutrient steril sebanyak 50 ml yang terdiri dari (NH 4 ) 2 HPO 4 1 g/l, MgSO 4.7H 2 O 0,05 g/l dan yeast ekstrak 2 g/l dengan ph Media 5, (Ito, et al. 2003). PEMELIHARAAN STOK KULTUR JPP Isolat A-1 (Omphalina) dinokulasikan dengan menggunakan jarum inkubasi ke dalam cawan petri yang berisi media PDA steril, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama satu minggu hingga dihasilkan miselium berwarna putih (Fassatiova, 1986). Pemeliharaan stok kultur untuk Trichoderma sp yaitu dengan cara menginokulasikan sebanyak satu ujung jarum spora jamur ke dalam media PDA steril dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu sebagai stok kultur. Fungi tumbuh dalam waktu tiga hari dengan ditandai adanya warna hijau pada PDA (Fassatiova, 1982). Untuk bakteri selulolitik diinokulasikan sebanyak 1 ose isolat bakteri selulolitik ke dalam media Hans padat steril dan diinkubasi pada suhu kamar 1 2 hari sebagai stok kultur (Rao, 1989). Sedang pada S. cerevisiae diinokulasikan sebanyak 1 ose isolat S. cerevisiae ke dalam media YEDP dan di inkubasi pada suhu kamar 1 sampai 2 hari sebagai stok kultur (Granot et al. 2003). PEMELIHARAAN KULTUR KERJA Kultur JPP Omphalina sp dari cawan petri (stok kultur) dipindahkan ke dalam botol jam yang berisi media PDB steril dan diinkubasikan dalam suhu kamar selama 3 hari sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses delignifikasi (Fassatiova, 1986). Untuk Trichoderma sp, isolat Trichoderma dari cawan petri (stok kultur) sebanyak satu ujung jarum dipindahkan ke dalam botol jam yang berisi media PDB steril dan diinkubasikan dalam suhu ruang selama 3 hari sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses hidrolisis secara enzimatis (Fassatiova, 1986).

3 23 Sedang kultur bakteri selulolitik dari cawan petri (stok kultur) sebanyak 1 ose dipindahkan ke dalam erlenmeyer 100 ml yang berisi media Hans cair dan di inkubasi pada suhu kamar selama 3 hari, sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses hidrolisis secara enzimatis (Rao, 1982). Sedang pada isolat Saccharomyces cerevisiae, sebanyak 2 ose isolat per 75 ml media YEDP cair steril diinokulasi ke dalam botol jar di inkubasi pada suhu kamar selama 3 hari, sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses fermentasi (Granot et al. 2003). PROSES DELIGNIFIKASI Proses Delignifikasi oleh Jamur Pelapuk Putih Omphalina sp (Akhtar et al, 1997) TKKS yang telah dicacah direndam air satu malam, lalu ditiriskan, kemudian dimasukkan ke dalam plastik tahan panas masing-masing sebanyak 240 gram per bungkus dan disterilisasi (tiga kali ulangan). Setelah dingin sebanyak 100 ml inokulum JPP Omphalina sp dari medium PDB (stok kerja) diinokulasikan ke dalam TKKS tersebut dan diinkubasikan selama 20 hari dalam suhu ruang (27 O C) sampai miselium JPP Isolat A-1 omphalina menyelimutinya, setelah itu dikeringkan dalam oven suhu 60 O C atau dijemur di bawah sinar matahari, setelah kering digiling dengan alat pen mill, dengan kehalusan 40 mesh (Lampiran 2). Sebelum dan sesudah delignifikasi dianalisis kadar air, lignin dan selulosa. HIDROLISIS KIMIAWI DAN FERMETASI ETANOL Hidrolisis secara kimiawi menggunakan asam sulfat atau asam khlorida. Parameter yang dioptimasi adalah jenis asam (HCl/H 2 SO 4 ) waktu hidrolisis, konsentrasi asam, dan TKKS yang terdelignifikasi atau tanpa delignifikasi. Pada hidrolisis dengan asam khlorida sebanyak 1 gram serbuk TKKS dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup ulir, ditambahkan masing-masing 10 ml HCL 0,1 N; HCL 0,5 N; HCL 1N; dan HCL 2N, dihidrolisis menggunakan autoklaf suhu 121 O C dengan waktu hidrolisis masing-masing 20 menit, 40 menit, 1 jam, 2 jam dan 4 jam (Lampiran 3). Analisis gula pereduksi. Hidrolisis dengan asam sulfat prosesnya sama seperti tersebut diatas. Asam khlorida diganti dengan asam sulfat (Cowling, 1975). Analisis kadar gula pereduksi yang terbentuk ( % terhadap

4 24 TKKS) dilakukan dengan Metode Dinitro Salisilic acid (DNS) (AOAC, 2005). Hidrolisis dioptimalkan dengan menaikkan suhu 200 C menggunakan H 2 SO 4 2N dengan waktu hidrolisis 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 menit. Analisis kadar gula pereduksi. Berdasarkan hasil analisis gula pereduksi ( % terhadap TKKS ), hidrolisis optimum percobaan dilanjutkan dengan perbesaran skala 50 kali. Filtrat yang dihasilkan digunakan sebagai substrat untuk proses fermentasi selanjutnya (Xiang, 2003). Fermentasi Etanol Hasil Hidrolisis Kimia Pada Kondisi Optimum Sebelum proses fermentasi, filtrat hasil dari hidrolisis dibuat dalam kondisi overliming terlebih dahulu yaitu dengan menambahkan Ca(OH) 2 hingga ph 12, dipanaskan dalam oven suhu 60 o selama 20 jam, disaring, ph diturunkan kembali menjadi 5,0, lalu disterilisasi (Millati et al. 2002). Proses fermentasi dilakukan sebagai berikut 1000 ml filtrat ditambah 10% (v/v) inokulum cair Saccharomyces cerevisiae dengan waktu inkubasi 120 jam. Tiap 24 jam contoh disampling, kemudian dianalisis kadar gula pereduksi (metode DNS), ph (ph meter), etanol (metode hidrometer) dan volume CO 2. HIDROLISIS ENZIMATIS DAN FERMENTASI ETANOL Hidrolisis secara enzimatis dan fermentasi etanol dilakukan dengan metode simultan dan terpisah. Metode Simultan: Hidrolsis dan fermentasi dilakukan dengan cara menambahkan 100 gr TKKS terdelignifikasi yang telah steril ke dalam media fermentasi (1000 ml). Setelah itu ditambahkan 5% isolat Trichoderma sp atau bakteri selulolitik asal rayap dan 10% inokulum cair Saccharomyces cerevisiae (v/v). Waktu inkubasi 5 hari (120 jam)(lampiran 4). Tiap 24 jam disampling kemudian dianalisis kadar gula pereduksi, ph, etanol dan CO 2 ( Ito et al ). Metode Terpisah: sebanyak 100 gr TKKS terdelignifikasi yang telah steril dimasukkan ke dalam 1000 ml media fermentasi, ditambahkan 5% isolat

5 25 Trichoderma sp atau bakteri selulolitik, kemudian diinkubasi selama 48 jam. Sampel diambil setiap 24 jam kemudian dianalisis kadar gula pereduksi, ph dan CO 2. Setelah 48 jam ditambahkan 10% inokulum cair Saccharomyces cerevisiae(v/v), inkubasi dilanjutkan hingga 120 jam (Lampiran 5). Setiap 24 jam disampling dan dianalisis gula pereduksi (metode DNS), etanol (metode hidrometer), ph (ph meter) dan volume CO 2 (Spangler dan Emert, 1986 ). ANALISIS Analisis Bahan Baku dan Produk Analisis Selulosa (TAPPI Method T203, Anom 1983) Sebanyak 0,5 g serbuk TKKS dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, ditambahkan 6 ml NaOCl, 1 ml asam asetat 10% dan 30 ml akuades, kemudian direfluks selama + 4 jam pada suhu 75 O C, dan setiap 2 jam ditambah 6 ml NaOCl, 1 ml asam asetat dan 25 ml akuades. Setelah 4 jam diangkat, disaring, divakum dan dicuci dengan akuades dingin dibilas dengan aseton dan eter dikeringkan dalam oven selama 3 jam, didinginkan dan ditimbang hingga bobot tetap. Bobot awal Bobot akhir % Kadar selulosa = x 100% Bobot awal Holoselulosa (ASTM D-1102 s.d 1110). Sebanyak 0,70 g (+ 0,05 g) serbuk bebas ekstraktif dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml. Kemudian ditambahkan 10 ml larutan A (60 ml HCI + 20 g NaOH, ditambah akuades hingga 1000 ml) dan secara hati-hati dimasukan pula 1 ml larutan B (200 g NaCIO 2 dalam 1000 ml akuades). Erlenmeyer dimasukan kedalam penangas air dengan suhu C dan digoyang setiap 30 menit. Pada menit ke 45, 90, dan 150, ditambahkan 1 ml larutan B dan erlenmeyer digoyanggoyang setiap penambahan larutan B. Sesudah 4 jam erlenmeyer dimasukan ke dalam penangas air es dan ditambahkan 15 ml akuades es. Seluruh isi erlenmeyer disaring menggunakan cawan saring yang sudah diketahui berat kosongnya. Untuk membersihkan seluruh isi erlenmeyer, dilakukan pencucian dengan 100 ml larutan asam asetat 1%. Cawan saring dihisap dan dicuci dengan 2-5 ml aseton yang dibiarkan menetes keluar karena beratnya, kemudian dihisap lagi selama 3

6 26 menit. Selanjutnya cawan saring beserta isinya dikeringkan dalam tanur pada suhu C dan ditimbang sampai beratnya konstan. % kadar holoselulosa = berat holoselulosa berat serbuk bebas ekstraktif x 100 Ekstraktif (ASTM D-1102 s.d 1110). Sebanyak 2 g sampel serbuk kayu dimasukkan dalam cawan saring. Selanjutnya cawan saring seisinya dimasukan dalam soxhlett sedemikian sehingga ujung cawan saring lebih tinggi dari ujung sifon dan sampel didalamnya lebih rendah dari titik ini. Cawan saring lalu ditutup dengan sepotong saringan dari logam agar tidak ada serbuk yang hilang. Ekstraksi dilakukan dengan 200 ml alkohol benzen (alkohol : benzen = 1 : 2) selama 4-6 jam. Sesudah selesai, cawan saring itu dikeluarkan dari soxhlett dan dihisap dengan pompa vakum hingga isinya kering. Kemudian dicuci dengan alkohol untuk menghilangkan benzen dan dihisap lagi dengan pompa vakum. Selanjutnya cawan saring dan isinya dikeringkan dalam tanur pada suhu C dan ditimbang sampai beratnya konstan. % kadar ekstraktif = berat awal berat ker ing tan ur x 100% berat ker ing tan ur Analisis Lignin (Goering dan Van Soest, 1970) Sebanyak 1 g serbuk TKKS dimasukkan kedalam kertas saring yang telah digulung dan diberi kapas. Lalu dilipat dan diikat dengan tali, ditimbang. Kemudian direfluks ditambah etanol-benzene (1 : 2) selama + 8 jam, diangkat, dicuci dengan etanol dan air panas, dikeringkan dioven sampai kering, dimasukkan kedalam desikator, ditimbang hingga bobot tetap. Kemudian sebanyak 0,5 g diambil, dimasukkan kedalam piala gelas 100 ml, ditambah 15 ml H 2 SO 4 72% dengan perlahan-lahan (didalam bak yang berisi air dan es, suhu (20 O C) didiamkan 2 jam, sambil sesekali diaduk. Diangkat, dimasukkan kedalam erlenmeyer ditambah 300 ml akuades, diaduk sampai dengan konsentrasi H 2 SO 4 3%, kemudian direfluks + 4 jam diatas penangas air pada suhu C. Hasil

7 27 refluks, divakum, dicuci dengan akuades panas sampai bebas asam, endapan dikeringkan dalam oven selama 3 jam, kemudian ditimbang hingga bobot tetap. Bobot refluks 4jam x Bobot refluks 8 jam % Kadar lignin = x 100% Bobot sebelum diekstrak x bobot hasil ekstrak Analisis Kadar air (AOAC, 1984) Kadar air ditentukan dengan cara menimbang 5 gram sampel lalu dikeringkan dalam oven 105 O C selama 2-3 jam, sampel yang telah kering kemudian didinginkan dalam desikator selama satu jam dan ditimbang. Perlakuan ini dilakukan secara berulang sehingga mendapatkan bobot tetap. Bobot awal - Bobot akhir % kadar air = x 100% Bobot awal Analisis kadar gula pereduksi Kadar gula pereduksi dianalisis berdasarkan metode DNS ( Dinitro salicylic acid ). Contoh yang telah jernih dimasukkan sebanyak 1 ml kedalam tabung reaksi, ditambah 3 ml pereaksi DNS dan ime akuades, dikocok hingga homogen menggunakan alat vortex, dan ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit, lalu didinginkan sampai suhu ruang. Bila diperlukan contoh diencerkan agar dapat terukur pada panjang gelombang 570 nm. Untuk pengukuran blanko di gunakan air. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan glukosa standar dengan kisaran 0,2-5 mg/l. Analisis Kadar Etanol Menggunakan Metode Hydrometer. Analisis kadar etanol menggunakan Metode Hydrometer (SNI , Brendi) atau AOAC Prinsip : Membandingkan volume sulingan dengan nilai air pada suhu 20 O C, maka Bj sulingan dari contoh dapat diketahui. Dari daftar BJ akan mendapatkan kadar alkohol yang terkandung dalam contoh. Sebanyak 100 ml contoh dimasukkan kedalam labu destilasi tambahkan 50 ml air suling, destilasi campuran tersebut. Kemudian destilasi ditampung dengan piknometer sampai tanda garis, lalu piknometer didinginkan pada suhu 20 O C

8 28 selama 15 menit. Setelah dingin piknometer ditimbang. Timbang berat piknometer kosong dan berat air pada suhu 20 O C (sebagai pembanding) BJ etil alkohol 20/ 20 O C = Berat etil alkohol (sulingan pada 20 O C) Berat air pada 20 O C kemudian dari lampiran dapat diketahui kadar alkoholnya. (Lampiran 16) Analisis gas karbondioksida (Hamzah, 2007) Gas CO 2 yang dihasilkan dari bagian atas fermentor dialirkan melalui suatu pipa kecil menuju tabung volume ukur yang berisi penuh air Gas CO 2 tersebut akan menekan air ke bawah hingga volume air pada tabung tersebut menjadi kosong. Banyaknya volume air yang dikeluarkan sebanding dengan volume gas CO 2 yang dihasilkan pada keadaan suhu dan tekanan standar. Analisis CO 2 CO 2 menekan air Tempat Fermentasi Berlangsung Saluran Sampling Fermentor Gambar 9. Rancangan fermentor Batch Fermentor Penampungan air Gambar 7 Rancangan Fermentor Batch