BAB IV METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1. Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Sintesis, dan Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang Alat Penelitian Pembuatan Serbuk Simplisia 1. Mesin penggiling (Blender) 2. Pengayak mesh 20 dan Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g 4. Oven BINDER Proses Fraksinasi 1. Timbangan analytical balance Scout Pro 400 g 2. Timbangan analytical balance Mettler Toledo 3. Penyaring Buchner 4. Oven BINDER 5. Toples 6. Pipet tetes 7. Batang pengaduk 8. Sudip 9. Beaker glass 10. Cawan Porselen 11. Rotary evaporator vacuum Buchi R Identifikasi Senyawa dengan KLT 1. Analytical balance 2. Chamber 3. Vial 4. Lempeng KLT (Silika gel TLC 60 F254) 5. Vortex 33

2 34 6. Pipa kapiler 5µl 7. Hot plate 8. Pinset 9. Sinar UV 254 nm dan 365 nm Pengujian Difusi Cakram 1. Autoklaf 2. Inkubator 3. Laminar Air Flow 4. Hot plate 5. Vortex 6. Timbangan analitik 7. Mikropipet 8. Tabung reaksi 9. Bunsen 10. Erlenmeyer 11. Beaker glass 12. Penjepit 13. Jangka sorong 14. Cawan petri 15. Kawat ose 16. Eppendorf 17. Yellow tip 18. Blue tip 19. Blank discs 20. Cotton swab Identifikasi Jamur Candida albicans 1. Mikroskop cahaya 2. Bunsen 3. Kawat ose 4. Object glass 5. Cover glass

3 Bahan Penelitian Bahan Uji Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging buah Limonia acidissima L. yang didapatkan dari Rasanae Barat, Bima, NTB (Nusa Tenggara Barat) dan telah diidentifikasi oleh UPT. Balai Materia Medika, Dinas Kesehatan, Jawa Timur. Mikroba uji yang digunakan adalah Candida albicans yang diperoleh dari laboratorium biomedik Universitas Muhammadiyah Malang Proses Fraksinasi 1. Pelarut etanol teknis 2. Serbuk daging buah Kinca Identifikasi Senyawa dengan KLT 1. N-Heksana pro analisis 2. Etil asetat pro analisis 3. Etanol pro analisis 4. Asam sulfat 10% 5. Larutan KOH 10% 6. FeCl3 1% 7. Pereaksi Dragendorff 8. Pereaksi Anisaldehida-Asam sulfat Pengujian Difusi Cakram 1. Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L. 2. Sabouraud Dextrose Agar (SDA) 3. Aqudest steril 4. Nistatin 5. Hasil peremajaan jamur Candida albicans 6. DMSO 1% Identifikasi Jamur Candida albicans 1. Hasil peremajaan jamur Candida albicans 2. Lactophenol cotton blue (LPCB) 3. Alkohol 70%

4 Variabel Penelitian Variabel Bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah golongan senyawa yang terdapat pada fraksi etanol daging buah Limonia acidissima dengan konsentrasi fraksi sebesar 25%; 30%; dan 35% Variabel Terikat Variabel terikat dalam penelitian ini yaitu diameter zona hambat yang dihasilkan oleh senyawa uji. Senyawa uji pada penelitian ini merupakan senyawa yang terdapat dalam fraksi etanol daging buah Limonia acidissima yang dapat menghambat pertumbuhan jamur Candida albicans yang ditandai dengan adanya daerah bening disekitar senyawa uji yang ada pada media Penyiapan Sterilisasi Alat dan Bahan Semua alat yang akan digunakan untuk pengujian antijamur perlu disterilkan terlebih dahulu, yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah Sterilisasi Kering Sterilisasi kering meliputi cara sterilisasi dengan api langsung dan cara sterilisasi dengan oven pemanas. 1. Sterilisasi dengan api langsung Sterilisasi ini dilakukan terhadap peralatan seperti jarum ose dan pinset. 2. Sterilisasi dengan oven pemanas Oven pemanas digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak berskala, seperti cawan petri, tabung reaksi dan pipet. Alat-alat yang disterilkan dimasukkan ke dalam oven setelah mencapai suhu 160 C selama 1-2 jam Sterilisasi Basah Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang disterilkan dengan sterilisasi basah diantaranya gelas ukur, Erlenmeyer, pipet tetes, dan media pertumbuhan Candida albicans (Sabouraud Dextrose Agar). Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121 C selama menit.

5 Metode Penelitian Rancangan Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui aktivitas antijamur senyawa dalam fraksi etanol daging buah Limonia acidissima terhadap Candida albicans yang ditunjukkan dengan zona hambat serta mengetahui golongan senyawa yang terdapat pada fraksi etanol daging buah Limonia acidissima secara in vitro dengan metode difusi cakram. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni kelompok uji yaitu fraksi etanol dengan berbagai konsentrasi (12,5 mg/disk; 15 mg/disk; dan 17,5 mg/disk) dan kelompok kontrol yang terdiri dari kontrol positif yaitu nistatin dan kontrol negatif yaitu aquadest dan DMSO 1%. Penelitian ini melalui beberapa tahapan, yaitu: 1. Penyiapan simplisia 2. Penarikan komponen senyawa dengan metode fraksinasi bertingkat 3. Pemisahan komponen senyawa dengan metode KLT 4. Pengujian antijamur dengan metode difusi cakram Kerangka Operasional Penyiapan simplisia Sterilisasi alat dan bahan untuk pengujian antijamur Pembuatan fraksi etanol Preparasi media dan jamur Candida albicans Identifikasi senyawa dengan KLT Pengujian antijamur dengan metode difusi cakram Kelompok Uji: Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima dengan konsentrasi 25%; 30%; dan 35% Kelompok Kontrol: Kontrol positif (Nistatin) Kontrol negatif (Aquades + DMSO 1%) Analisis Data Gambar 4.1.Skema kerangka operasional

6 Prosedur Kerja Preparasi Simplisia Sampel yang diteliti adalah daging buah Limonia acidissima. Daging buah dicuci dengan air hingga bersih dan dilakukan pengeringan pada suhu 40 C. Setelah kering kemudian dihaluskan dengan mesin penggilingan, sehingga diperoleh serbuk halus. Serbuk halus tersebut kemudian diayak menggunakan Shieve Shaker dengan derajat kehalusan tertentu Proses Fraksinasi Bahan Uji Pada proses fraksinasi yang dilakukan, digunakan tiga macam pelarut yaitu, n-heksana, etil asetat, dan etanol. Fraksinasi dimulai dari pelarut non polar yaitu n- heksana, kemudian dilanjutkan dengan pelarut semi polar yaitu etil asetat, dan selanjutnya dengan pelarut polar yaitu etanol. Dalam proses pembuatan fraksi etanol, digunakan serbuk daging buah buah Limonia acidissima yang telah diekstraksi dengan n-heksana dan etil asetat sebanyak 1300 gram dan kemudian diekstraksi dengan pelarut etanol menggunakan metode maserasi (perendaman) selama 24 jam. Proses yang dilakukan adalah sebagai berikut: 1. Serbuk halus daging buah Limonia acidissima yang telah diekstraksi dengan n-heksana dan etil asetat sebanyak 1300 gram dimasukkan ke dalam sebuah bejana bermulut besar; 2. Tambahkan etanol sebanyak ml (perbandingan 1:10), rendam selama 24 jam, kemudian saring dengan corong Buchner dan didapatkan filtrat 1 dan residu 1; 3. Residu 1 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml (perbandingan 1:5), direndam selama 24 jam. Kemudian saring dan didapat filtrat 2 dan residu 2; 4. Residu 2 dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml (perbandingan 1:5), direndam selama 24 jam. Kemudian saring dan didapat filtrat 3 dan residu 3; 5. Proses maserasi ini dilakukan dengan cara yang sama dan berulang sampai filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan pelarut

7 39 etanol yang ditandai dengan tidak adanya noda pada plat KLT. Filtrat yang ditotolkan masing-masing sebanyak 5 μl untuk melihat kepekatannya; 6. Proses maserasi ini, dilakukan sebanyak lima kali, dengan proses maserasi ketiga dan kelima sama dengan proses yang dilakukan pada maserasi kedua dan ketiga; 7. Filtrat yang telah didapat tersebut dikumpulkan, lalu dipisahkan dengan pelarutnya (etanol) dan dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum dengan suhu ± 40⁰C sampai didapat larutan yang kental. 8. Pindahkan larutan kental tersebut ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya dan keringkan di oven pada suhu 40⁰C; 9. Setelah fraksi cukup kental, timbang fraksi dan cawan hingga konstan dan simpan fraksi pada lemari pendingin. Serbuk halus daging buah Limonia acidissima sebanyak 1300 g Tambahkan etanol sebanyak ml, rendam selama 24 jam, saring dengan corong Buchner, dan tampung filtrat Residu 1 Dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml, direndam selama 24 jam, saring dan tampung filtrat Filtrat 1 Residu 2 Residu 3 Dimaserasi kembali dengan etanol sebanyak 6500 ml, direndam selama 24 jam, saring dan tampung filtrat Proses ini dilakukan dengan cara yang sama dan berulang sampai filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan pelarut Filtrat 2 Filtrat 3 Dikeringkan di oven pada suhu 40⁰C Pekatkan seluruh filtrat dengan rotary evaporator vacuum sampai diperoleh larutan kental Gambar 4.2. Bagan alur proses pembuatan fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.

8 Pemisahan Senyawa dengan KLT Fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 0,5 gram dihidrolisis dengan 5 ml HCl 2N, didihkan lalu tutup dengan corong berisi kapas basah selama 50 menit. Setelah dingin, tambahkan ammonia (NH4OH) sampai basa, kemudian ekstraksi dengan 4-5 ml n-heksana sebanyak dua kali, lalu uapkan hingga tersisa 0,5 ml, totolkan pada plat KLT sebanyak 10 µl. Kemudian eluasi dengan berbagai macam fase gerak. Eluen yang memiliki kemampuan terbaik dalam memisahkan komponen senyawa, akan digunakan pada pengujian aktivitas antijamur dengan metode difusi cakram. a. Fase diam : Silika Gel TLC 60 F254 b. Optimasi fase gerak: 1. N-Heksana : Etil Asetat (7 : 3) 2. N-Heksana : Etil Asetat (5 : 5) 3. N-Heksana : Etil Asetat (2 : 8) 4. N-Heksana : Etil Asetat (3 : 7) Identifikasi Golongan Senyawa Untuk identifikasi golongan senyawa pada fraksi etanol daging buah Limonia acidissima dilakukan dengan metode KLT, dengan penampak noda: a. Alkaloid : Pereaksi Dragendorff (menghasilkan noda warna jingga); b. Terpenoid : Pereaksi anisaldehida-asam sulfat. Plat dipanaskan dengan suhu 100 C (menghasilkan noda warna ungu); c. Flavonoid : Pereaksi H2SO4 10% (menghasilkan noda warna kuning); d. Polifenol dan tanin : Pereaksi FeCl3 10% (menghasilkan noda warna hitam); e. Antrakuinon : Pereaksi KOH 10% dalam metanol (menghasilkan noda warna kuning atau kuning kecoklatan) Pembuatan Konsetrasi Larutan Uji Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji dibuat sebagai berikut: a. Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 250 mg, larutkan dalam 0,1 ml DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1 ml, sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 25% (b/v);

9 41 b. Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 300 mg, larutkan dalam 0,1 ml DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1 ml, sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 30% (b/v); c. Timbang fraksi etanol daging buah Limonia acidissima sebanyak 350 mg, larutkan dalam 0,1 ml DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1 ml, sehingga didapatkan larutan uji dengan konsentrasi 35% (b/v) Preparasi Media Dalam penelitian ini digunakan satu media yakni Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dan dalam pembuatan suspensi mikroba menggunakan aquades steril dengan meremajakan jamur sehari sebelum penggunaan. Menurut Bridson, (2006), media Sabouraud Dextrose Agar dibuat dengan formula seperti yang terdapat pada tabel IV.1. Bahan SDA sebanyak 65 g dilarutkan dalam 1 liter air suling. Didihkan campuran tersebut sampai larut. Sterilkan dengan sterilisasi basah (autoklaf) pada suhu 121 C selama 15 menit. Aduk rata dan tuangkan ke dalam cawan Petri steril. Tabel IV.1. Formula Sabouraud Dextrose Agar (Bridson, 2006). Formula Gram/liter Mycological peptone 10.0 Glucose 40.0 Agar 15.0 ph 5.6 ± 0.2 Pada penelitian kali ini, dibuat SDA sebanyak 250 ml, sehingga digunakan bahan SDA sebanyak 16,25 g (Mycological peptone sebanyak 2,5 g, glukosa sebanyak 10 g, dan agar sebanyak 3,75 g) Identifikasi Jamur Candida albicans Dari hasil peremajaan jamur Candida albicans yang dibuat untuk pengujian aktivitas antijamur, dilakukan identifikasi dengan metode makroskopis dan mikroskopis. Untuk uji makroskopis dilakukan dengan pengamatan secara visual pada media agar (Mutiawati, 2016). Untuk uji mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan dengan pewarna lactophenol cotton blue (LPCB). Pewarnaan ini dilakukan dengan meneteskan

10 42 setetes alkohol 70% pada object glass. Kemudian sterilkan jarum inokulasi diatas api bunsen, ambil biakan jamur dengan jarum inokulasi tersebut, dan letakkan diatas object glass yang telah ditetesi alkohol 70%. Lalu tambahkan satu atau dua tetes pewarna LPCB sebelum alkohol mongering, dan tutup dengan cover glass. Lakukan pengamatan dengan mikroskop (Leck, 1999) Preparasi Jamur Pada proses peremajaan, jamur Candida albicans yang berasal dari biakan murni diambil satu ose kemudian ditanamkan pada cawan petri yang berisi media Sabouraud Dextrose Agar. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 o C (WHO, 2009). Dalam pembuatan suspensi jamur Candida albicans, jamur dari hasil peremajaan diambil sebanyak 1 ose. Siapkan tabung reaksi yang berisikan ±4 ml aquadest steril. Untuk mendapatkan tingkat kekeruhan jamur CFU/mL (sesuai standar McFarland 0,5), masukkan jamur yang telah diambil sebanyak 1 ose tersebut ke dalam tabung reaksi yang berisikan 4 ml aquadest steril (Gholampour- Azizi, Samaneh, dan Fahimeh, 2015). Kemudian vortex suspensi jamur tersebut hingga homogen. Setelah itu suspensi jamur dilihat kekeruhannya dibandingkan dengan standar McFarland, dengan dilihat secara visual. Sebelumnya, dibuat terlebih dahulu standar McFarland 0,5 dengan menggunakan 0,05 ml BaCl2 1% dan 9,95 ml H2SO4 1% (Sutton, 2011). Tabel IV.2. Standar kekeruhan McFarland (Matnani, et al., 2012; Zamora & Perez- Gracia, 2012) McFarland Standard No. 1% BaCl2 (ml) 1% H2SO4 (ml) Kepadatan mikroba ( 10 8 CFU/mL) 0,5 0,05 9,95 1,5 1 0,10 9,90 3,0 2 0,20 9,80 6,0 3 0,30 9,70 9,0 Dari tabung reaksi yang berisi suspensi jamur, ambil suspensi dengan cotton swab steril, untuk menghilangkan kelebihan cairan pada cotton swab, putar beberapa kali dan tekan dengan kuat ke dinding dalam tabung, kemudian inokulum dioles keseluruh permukaan media sebanyak 3 kali dengan memutar cawan dengan sudut 60 untuk setiap pengolesan. Lalu oleskan cotton swab steril ke sekeliling

11 43 pinggiran permukaan agar. Biarkan inokulum mengering selama beberapa menit pada suhu ruang dengan cawan tertutup (WHO, 2009) Pengujian Metode Difusi Cakram Proses pengujian antijamur untuk metode difusi cakram, antara lain sebagai berikut : 1. Siapkan blank disc untuk konsentrasi uji, sebanyak 3 buah. Totolkan sebanyak 10 µl untuk setiap larutan uji 25%; 30%; dan 35%. Keringkan dalam oven dengan suhu 37 C selama 20 menit. Ulangi proses tersebut hingga larutan yang ditotolkan dalam disk sebanyak 50 µl. Konsentrasi pada disk untuk larutan uji 25% yaitu 12,5 mg/disk; pada konsentrasi 30% yaitu 15 mg/disk; dan pada konsentrasi 35% yaitu 17,5 mg/disk. Untuk sterilisasi disk dilakukan dengan pemancaran sinar UV selama 1 jam. 2. Siapkan juga 1 blank disc untuk penotolan kontrol positif (nistatin). Totolkan sebanyak 20 µl, keringkan dalam oven dengan suhu 37 C selama 20 menit. Kemudian totolkan sebanyak 10 µl, keringkan dalam oven pada suhu dan waktu yang sama. Ulangi penotolan 10 µl tersebut hingga didapatkan jumlah totolan sebanyak 60 µl/disk. Untuk sterilisasi disk dilakukan dengan pemancaran sinar UV selama 1 jam. 3. Olesi media Sabouraud Dextrose Agar dengan suspensi jamur Candida albicans dengan tingkat kekeruhan 10 8 CFU/mL, yang telah dibandingkan dengan standar McFarland 0,5. 4. Letakkan disk kontrol positif dan disk dengan sampel uji pada media SDA yang telah diberi jamur Candida albicans dengan jarak tiap cakram 3 cm dan dari tepi lempeng sebesar 2 cm. Tekan lembut disk pada permukaan agar dengan menggunakan pinset sehingga terdapat kontak yang baik antara disk dengan agar. 5. Kemudian letakkan disk untuk kontrol negatif (Aquades + DMSO 1%) diatas permukaan agar. Kontrol negatif dibuat dengan mencampurkan DMSO 1% sebanyak 100 µl dengan aquadest steril sebanyak 900 µl. 6. Selanjutnya media Sabouraud Dextrose Agar yang telah diberikan disk larutan uji, kontrol positif, dan kontrol negatif diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam.

12 44 7. Hasil dari pengujian antijamur diamati dengan melihat adanya area yang jernih disekitar disk. 8. Diameter zona hambatan yang terbentuk tersebut, diukur dengan menggunakan jangka sorong, dan ditulis dalam satuan millimeter (mm). 9. Lakukan replikasi sebanyak tiga kali. 1 (25%) 2 (30%) 3 (35%) K - (Aquadest + DMSO 1%) K + (Nistatin) 2 cm 2 3 cm 2 cm K cm K+ 2 cm Media uji ini diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam Dilakukan replikasi tiga kali untuk tiap konsentrasi uji Analisis data Gambar 4.3. Bagan prosedur pengujian antijamur dengan metode difusi cakram

13 Analisis Data Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan terhadap pengukuran diameter zona hambat dari daerah yang berwarna bening pada masing-masing perlakuan baik kelompok kontrol maupun kelompok uji fraksi etanol daging buah Limonia acidissima L.