BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB) mulai Oktober 200 sampai Agustus 20. Bahan Tumbuhan Sumber Ekstrak Bahan tumbuhan yang digunakan sebagai sumber ekstrak adalah daun Tephrosia vogelii berbunga ungu yang berasal dari Kawasan Agropolitan, Kecamatan Pacet, Kabupaten Cianjur, Jawa Barat dan buah Piper aduncum yang diperoleh dari lingkungan sekitar kampus IPB Darmaga, Bogor. Daun T. vogelii langsung dipotong kecil-kecil lalu dikeringudarakan selama minggu, sedangkan buah P. aduncum dikeringudarakan dalam keadaan utuh juga selama minggu. Penyiapan Tanaman Pakan Daun brokoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck) digunakan sebagai pakan serangga uji dan sebagai media perlakuan pada uji hayati di laboratorium. Benih brokoli cv. Green Magic disemai dalam nampan semai yang diisi media semai campuran tanah, kompos Super Metan dan diberi pupuk majemuk (NPK 8-9-0+TE) empat butir per lubang tanam. Bibit berumur 4 minggu atau memiliki empat helai daun dipindahkan ke polybag kapasitas 5 L yang diisi campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 3: (v/v). Pada setiap polybag ditanam satu bibit tanaman. Setelah berumur 4 minggu tanaman dipupuk NPK dengan dosis ± g per polybag. Pupuk ditabur melingkar mengelilingi tanaman lalu ditutup tanah dan disiram. Pemeliharaan tanaman brokoli yang dilakukan meliputi penyiraman, penyulaman, penyiangan gulma, dan pengendalian hama secara mekanis. Daun tanaman brokoli yang telah berumur sekurang-kurangnya 2 bulan digunakan sebagai pakan larva C. pavonana.
Pemeliharaan Serangga Uji Serangga C. pavonana yang digunakan dalam penelitian ini merupakan koloni yang diperbanyak di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Pembiakan serangga dilakukan mengikuti prosedur yang digunakan oleh Prijono dan Hassan (992). Imago C. pavonana dipelihara dalam kurungan plastik kasa berbingkai kayu (50 cm x 50 cm x 50 cm) dan diberi pakan larutan madu 0% yang diserapkan pada segumpal kapas yang digantungkan di dalam kurungan. Daun brokoli yang tangkainya dicelupkan dalam tabung film berisi air diletakkan di dalam kurungan sebagai tempat peletakan telur. Kelompok telur pada daun brokoli dikumpulkan setiap hari. Setelah telur menetas, larva dipindahkan ke dalam wadah plastik (35 cm x 26 cm x 6 cm) berjendela kasa yang dialasi kertas stensil, dan diletakkan daun brokoli bebas pestisida sebagai pakannya. Larva instar II digunakan untuk pengujian. Bila tidak digunakan untuk pengujian, sebagian larva dipelihara lebih lanjut dalam wadah plastik berisi daun brokoli. Menjelang berpupa, larva dipindahkan ke dalam wadah plastik lain yang berisi serbuk gergaji steril sebagai medium untuk berpupa. Pupa beserta kokonnya dipindahkan ke dalam kurungan plastik-kasa seperti di atas sampai muncul imago untuk pemeliharaan selanjutnya. Penentuan Kadar Air Tumbuhan Sumber Ekstrak Botol timbang dikeringkan pada suhu 05 o C dalam oven selama 30 menit, kemudian didinginkan dan ditimbang. Sebanyak 2 g sampel (serbuk daun T. vogelii dan buah P. aduncum) dimasukkan ke dalam botol timbang dan dipanaskan dalam oven pada suhu 05 o C selama 2 jam, kemudian cawan diangkat dan didinginkan. Botol timbang dengan sampel ditimbang hingga diperoleh bobot konstan (AOAC 2006). Persentase kadar air dihitung dengan persamaan: Bobot awal bobot akhir Kadar air (%) = x 00% Bobot awal
2 Ekstraksi T. vogelii dan P. aduncum Potongan daun T. vogelii bunga ungu dan buah P. aduncum kering udara digiling menggunakan blender hingga menjadi serbuk, kemudian diayak menggunakan pengayak kawat kasa berjalinan 0.5 mm. Serbuk daun T. vogelii dan serbuk buah P. aduncum masing-masing 25 g direndam dalam 200 ml etil asetat. Perendaman dibedakan menjadi lima macam perlakuan berdasarkan jumlah perendaman yaitu 2x, 3x, 4x, 5x, dan 6x perendaman. Setiap perlakuan perendaman diulang tiga kali. Untuk setiap perendaman, bahan tumbuhan direndam selama 3 jam, masing-masing dikocok setiap 30 menit. Cairan hasil rendaman disaring menggunakan corong kaca yang dialasi kertas saring Whatman No. 4 diameter 85 mm. Hasil saringan diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 ºC dan tekanan 240 mbar sehingga diperoleh ekstrak kasar. Ekstrak daun T. vogelii yang diperoleh berbentuk bahan pekat berwarna hijau gelap dan ekstrak buah P. aduncum berupa bahan semipadat berwarna cokelat. Setiap ekstrak yang diperoleh disimpan dalam lemari es (± 4 ºC) hingga saat digunakan. Data persentase hasil ekstrak ditransformasi ke arcsin kemudian diolah dengan sidik ragam berdasarkan rancangan acak lengkap yang dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%. Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9. (SAS Institute 2002-2003). Uji Toksisitas Ekstrak Tunggal Pengujian dilakukan melalui dua tahap, yaitu uji pendahuluan dan uji lanjutan. Pada uji pendahuluan, kelima ekstrak daun T. vogelii berbunga ungu diuji pada konsentrasi 0,4% (w/v) dan kelima ekstrak buah P. aduncum diuji pada konsentrasi 0,% (w/v). Setiap perlakuan terdiri atas enam ulangan. Semua pengujian dilakukan dengan menggunakan metode celup daun. Ekstrak daun T. vogelii dan ekstrak buah P. aduncum masing-masing dicampur dengan pelarut metanol dan Solvesso R-00 serta pengemulsi Tween 80 (9::5) (konsentrasi akhir 0,96% v/v) kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume yang sesuai. Akuades yang hanya mengandung pelarut metanol dan Solvesso R-00 serta pengemulsi Tween 80 digunakan sebagai larutan kontrol. Semua suspensi
3 ekstrak dikocok dengan menggunakan pengocok ultrasonik agar ekstrak dapat tersuspensikan secara merata di dalam air. Potongan daun brokoli segar dan bebas pestisida (4 cm x 4 cm) dicelup satu per satu dalam suspensi ekstrak dengan konsentrasi tertentu sampai basah merata lalu dikeringudarakan. Daun kontrol dicelup dalam larutan kontrol yang sesuai. Setiap potong daun perlakuan dan daun kontrol diletakkan secara terpisah di dalam cawan petri (diameter 9 cm) yang dialasi tisu yang ukurannya melebihi diameter cawan. Cawan petri diletakkan pada posisi terbalik. Alas tisu diletakkan pada bagian tutup cawan, sedangkan bagian dasar cawan ditutupkan di atas tisu. Dengan demikian, bagian tutup dan dasar cawan tersekat tisu sehingga larva uji tidak dapat keluar dari dalam cawan. Sebanyak 5 ekor larva instar II C. pavonana yang baru ganti kulit dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian diberikan daun kontrol atau daun perlakuan yang sesuai. Larva tersebut dibiarkan makan selama 24 jam. Setelah 24 jam ditambahkan daun perlakuan atau daun kontrol secukupnya. Dua puluh empat jam berikutnya, daun perlakuan diganti dengan daun tanpa perlakuan. Jumlah larva yang mati diamati dan dicatat setiap hari sampai hari ke-4 (96 jam sejak perlakuan [JSP]). Data mortalitas larva C. pavonana akibat perlakuan dengan ekstrak T. vogelii 0,4% dan P. aduncum 0,0% pada 48, 72, dan 96 JSP ditransformasi ke arcsin kemudian diolah dengan sidik ragam berdasarkan rancangan acak lengkap yang dilanjutkan dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%. Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program SAS versi 9. (SAS Institute 2002-2003). Ekstrak yang berasal dari perlakuan perendaman yang memberikan hasil ekstraksi dan aktivitas insektisida terbaik digunakan dalam uji lanjutan. Ekstrak T. vogelii dan P. aduncum masing-masing diuji pada enam taraf konsentrasi yang diharapkan dapat mengakibatkan kematian serangga uji antara 5% dan 95%. Taraf konsentrasi uji ekstrak T. vogelii ialah 0,025%, 0,06%, 0,095%, 0,3%, 0,65%, dan 0,2% (w/v), dan ekstrak P. aduncum 0,075%, 0,%, 0,45%, 0,8%, 0,25%, dan 0,25% (w/v). Cara perlakuan dan pengamatan pada uji lanjutan sama seperti pada uji pendahuluan. Data mortalitas kumulatif pada 48,
4 72, dan 96 JSP diolah dengan analisis probit menggunakan program POLO-PC (LeOra Software 987). Uji Toksisitas Ekstrak Campuran Ekstrak T. vogelii dan P. aduncum diuji dalam bentuk campuran pada enam taraf konsentrasi yang diharapkan dapat mengakibatkan kematian serangga uji antara 5% dan 95%. Ekstrak campuran diuji pada tiga macam perbandingan konsentrasi, yaitu :, 5:, dan :5 (w/w). Konsentrasi uji ekstrak T. vogelii dan P. aduncum dalam campuran : masing-masing 0,00625%, 0,025%, 0,025%, 0,0375%, 0,05%, dan 0,0625%. Untuk campuran 5: konsentrasi ekstrak T. vogelii berturut-turut 0,02%, 0,045%, 0,07%, 0,095%, 0,2%, dan 0,45% dan konsentrasi ekstrak P. aduncum berturut-turut 0,004%, 0,009%, 0,04%, 0,09%, 0,024%, dan 0,029%. Untuk campuran :5 konsentrasi ekstrak T. vogelii berturutturut 0,003%, 0,009%, 0,05%, 0,02%, 0,027%, dan 0,033% dan konsentrasi ekstrak P. aduncum berturut-turut 0,05%, 0,045%, 0,075%, 0,05%, 0,35%, dan 0,65%. Cara perlakuan dan pengamatan pada uji ekstrak campuran sama seperti pada uji ekstrak tunggal. Data mortalitas kumulatif pada 48, 72, dan 96 JSP diolah dengan analisis probit seperti pada uji ekstrak tunggal. Sifat aktivitas campuran ekstrak daun T. vogelii dan buah P. aduncum dianalisis berdasarkan model kerja bersama berbeda dengan menghitung indeks kombinasi pada taraf LC 50 dan LC 95. Indeks kombinasi (IK) pada taraf tersebut dihitung dengan rumus berikut (Chou & Talalay 984): (cm) 2 (cm) 2 (cm) IK = + + x 2 (cm) 2 LC x dan LC 2 x masing-masing merupakan ekstrak daun T. vogelii dan ekstrak (cm) 2(cm) buah P. aduncum pada pengujian terpisah; dan masing-masing ekstrak T. vogelii dan P. aduncum dalam campuran yang mengakibatkan mortalitas x (misal 50% dan 95%). Nilai tersebut diperoleh dengan cara mengalikan campuran dengan proporsi konsentrasi ekstrak T. vogelii dan P. aduncum dalam campuran.
5 Kategori sifat interaksi campuran adalah sebagai berikut (diadaptasi dari Gisi 996; Kosman & Cohen 996): () bila IK < 0.5, komponen campuran bersifat sinergistik kuat; (2) bila 0.5 IK 0.77, komponen campuran bersifat sinergistik lemah; (3) bila 0.77 < IK.43, komponen campuran bersifat aditif; (4) bila IK >.43, komponen campuran bersifat antagonistik.