Identifikasi Biohidrogen Secara Fermentatif Dengan Kultur Campuran Menggunakan Glukosa Sebagai Substrat Disusun Oleh : Rizkhi Agrinda Setya 1407 100 020 Pembimbing : Prof. Dr. Surya Rosa Putra, M.S Herdayanto Sulistyo Putro, M.Si
HIDROGEN BIOLOGI FISIKA KIMIA BIOHIDROGEN (Das dan Nejat, 2008) Lebih ramah lingkungan dan efisien karena menghasilkan uap air sbg emisi (Gupta, 2009). Memiliki kalor pembakaran 2,75 kali lebih besar dibanding dg bahan bakar hidrokarbon (Dong-Hon Kim et al., 2006) Produksi tanpa Cahaya BIOFOTOLISIS Cyanobacteria FERMENTASI GELAP Substrat Bervariasi FOTODEKOMPOSISI Purple Non-Sulfuric Bacteria HYBRID SYSTEM Microbial Fuel Cell Hemat Energi
FERMENTASI GELAP Genus Clostridium, Obligatif Anaerob - Adanya O 2 akan menghambat kinerja Enzim Hidrogenase (Madigan, 2006). Genus Enterobacter, Fakultatif Anaerob - Termasuk Bakteri Coliform, Kemungkinan Bersifat Enteropatogenik atau Toksigenik (Ferdiaz, 1993). Selain Strain Tunggal, Kultur Campuran dapat juga menghasilkanh 2 (Maintingueret al., 2008; Patel et al., 2010; Singh et al., 2010)
Apakah kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkan biohidrogen secara fermentatif dengan menggunakan glukosa sebagai substrat Penelitian ini bertujuan untuk mengatasi kelemahan bakteri penghasil hidrogen seperti Clostridium dan Enterobacter dengan menggunakan kultur campuran dan mengetahui jumlah biohidrogen yang dihasilkan secara fermentatif dengan menggunakan substrat glukosa
Pembuatan Media Padat dan Cair Prosedur Kerja Regenerasi Kultur Campuran Pewarnaan Gram dan Uji Morfologi Penentuan Kurva Pertumbuhan Produksi Biohidrogen Secara Fermentatif dengan Kultur Campuran Analisis Gas Hasil Fermentasi Analisis Gula Pereduksi dan Jumlah Sel Alat Botol, Tabung Reaksi, Pipet ukur, Magnetic stirrer, Hotplate strirrer, microtube, Thermoshaker, Mikroskop, Sentrifuge Hermle, Vortex, Spektrofotometer, Neraca analitik, Autoclave, Hydrogen bag, Hydrogen sensor, Kromatografi Gas Bahan Nutrient Agar (Oxoid), Glukosa p.a (Merck), Ekstrak Ragi (Oxoid), FeSO 4 7H 2 O p.a (Merck), NaOH, Metilen Blue, Asam 3,5-Dinitrosalisilat (Sigma Aldrich), Na-K tartat (Merck), Na-Metabisulfit (Merck), Gas Nitrogen, Aquades Steril dan Alkohol Teknis 70%.
1 Pembuatan Media Padat dan Cair Nutrien Agar 2 g Aquades 100 ml Yeast Extract 0,5 % (w/v) Glukosa 2 % (w/v) Diautoclave pada 121 C selama15 menit Media padat steril dan diinkubasi 1 hari dg posisi miring Media Cair Steril didinginkan kemudian dicampur secara aseptis dlm Laminary Flow
2 Regenerasi Kultur Campuran Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik Diambil 1 ose dan di goreskan secara zigzag pada media padat steril Strain Kultur Campuran Diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam Hasil regenerasi disimpan dalam lemari es
3 Pewarnaan Gram Sederhana dan Uji Morfologi Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik Dibilas dengan Aquades steril Diambil 1 ose dan digoreskan pada kaca preparat Kaca preparat Steril Digoyang hingga merata dan kering Ditetesi Metilen Blue pada goresan Difiksasi diatas api Dibilas sedikit dgn alkoholo 96%
4 Penentuan Kurva Pertumbuhan Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik 30 ml media cair atau (10% v/v) FeSO 4 7H 2 O 0,03 % (w/v) Diambil 1 ose dan diinokulasi ke dalam media Di shaker selama 14 jam dengan suhu 40 C kec. 125 rpm Hasil inkubasi diinokulasikan lagi Diukur absorbansinya padaλ = 600 nm Di shaker pada suhu 40 C kec. 125 rpm dan diambil sampel tiap jam Media 270 ml atau 90% (v/v) + FeSO 4 7H 2 O 0,03 % (w/v)
5 Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakan Kultur campuran Tahap pembuatan inokulum Proses ini dilakukan dalam Laminary flow dengan teknik aseptik Media Cair Steril 500 ml 5 ml FeSO 4 7H 2 O 0,03 % (w/v) dan magnetic stirrer steril Dialiri gas nitrogen selama 1 menit 45 ml Diinokulasi kedalam media 45 ml yang sblmnya dipreparasi seperti diatas Kemudian diinkubasi Diinkubasi dan di stirer selama 14 jam, suhu 40 C dg kec.125 rpm Diambil 1 ose dan diinokulasi ke dalam media
5 Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakan Kultur campuran Tahap fermentasi FeSO 4 7H 2 O 0,03 % (w/v) dan magnetic stirrer steril Dialiri gas nitrogen selama 1 menit media 450 ml 50 ml media inokulum Diambil sampel media tiap 6 jam Hasil dianalisis ph dimonitor dan diatur 6-5 dengan NaOH, Suhu 40 C, kec. 125 rpm Rangkaian Alat
Rangkaian Alat Fermentasi Sistem Batch dengan Pengadukan Termometer Selang Poliuretan Sumbat Karet Hydrogen Bag Indikator Gas berisi Aquades steril Hotplate stirrer Magnetic stirrer
6 Metode Analisis A. Analisis Gas Gas yang dihasilkan Volume Uji Kualitatif Uji Kuantitatif 1 2 3 Hidrogen bag Botol berisi air vol. 1L dimodifikasi dengan infus 4 GC - TCD Gelas ukur Hydrogen sensor
6 Metode Analisis B. Analisis Jumlah sel Sampel Fermentasi - diambil sampel tiap 6 jam sebanyak 1,5 ml - dimasukkan dalam microtube - disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm - dipisahkan secara dekantasi dan dimasukkan kedalam tabung Biomassa Supernatan biomassa dalam microtube ditambahkan aquades steril hingga 1,5 ml disuspensikan dengan vortex dituang ke dalam tabung berisi 3 ml aquades steril disuspensikan dengan vortex diukur absorbansi dengan panjang gelombang 600 nm Hasil
6 Metode Analisis C. Analisis Gula Pereduksi Kurva Standar Glukosa Laruta Glukosa Stok 0,2 M -Diambil sebanyak 1; 2; 3; 4; dan 5 ml -Diencerkan dengan aquades sampai 10 ml Laruta Glukosa Konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 M Hasil -Diambil masing-masing 0,2 ml dan ditambah 1,8 ml aquades -Ditambahkan 3 ml reagen DNS -Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit -Didinginkan pada air dingin selama 10 menit -Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm -Dibuat kurva standar glukosa (C glukosa vs A)
6 Metode Analisis C. Analisis Gula Pereduksi Supernatan -Diambil masing-masing 0,2 ml dan ditambah 1,8 ml aquades -Ditambahkan 3 ml reagen DNS -Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit -Didinginkan pada air dingin selama 10 menit -Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Hasil
Gambar 1. Hasil Regenerasi Kultur Campuran pada Media Padat Menunjukkan Koloni kultur campuran berwarna putih, permukaan rata.
Gambar 2. Bentuk Morfologi Kultur Campuran Dari hasil Foto mikroskopik dengan perbesaran 1000x, menunjukkan bahwa bakteri tersebut berbentuk batang atau bacil dengan ukuran yang berbeda, panjang dan pendek. Hal ini menunjukkan bahwa terbukti kultur campuran.
Lab. Mikrobiologi ITS Lab. Mikrobiologi Unair Bacillus cereus : Gram Positif, Fakultatif Anaerob Actinobacillus sp. : Gram Negatif, Fakultatif Anaerob Bacillus subtilis: Gram Positif, Fakultatif Anaerob Pseudomonas fluorescence : Gram Negatif, Aerob Hasil tersebut sesuai dengan (Holt et al., 1994) Hasil tersebut belum dapat ditentukan kebenarannya, sehingga harus diteliti secara biomolekular dengan Metode 16S RNA Berdasarkan data tersebut, yang memungkinkan berpotensi penghasil hidrogen adalah golongan Bacillus sp. yaitu Bacillus cereus (Patel et al., 2010, Kotay dan Das, 206)
0.4 0.35 0.3 Densitas Optik (nm) 0.25 0.2 0.15 0.1 Fase log Fase stasioner Fase kematian 0.05 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Waktu (jam) Gambar 4. Kurva Pertumbuhan selama Fermentasi Adanya pertumbuhan sel selama fermentasi menunjukkan substrat yang digunakan tidak dikonversikan menjadi H 2 secara maksimal
Metabolisme Pemecahan Glukosa Berdasarkan data identifikasi strain, Golongan Bacillus sp. Seperti Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Actinobacillus sp. melakukan pemecahan glukosa melalui jalur EMP (Embden- Mayerhoff). Sedangkan dan Pseudomonas fluorescence melakukan pemecahan glukosa melalui jalur ED (Entner- Doudoroff) (Kim dan Gad, 2008). Bakteri penghasil H 2 biasanya bersifat fakultatif anaerob, sehingga data identifikasi dari ITS yang digunakan dalam penelitian ini. Reaksi produksi H 2 : Piruvat + CoA + 2Fd(oks) Asetil-CoA + 2Fd(red) + CO 2 2H + + 2Fd(red) + enzim hidrogenase H 2 + Fd(oks) Produk akhir : C 6 H 12 O 6 + 2 H 2 O 2 CH 3 COOH + 2 CO 2 + 4 H 2 C 6 H 12 O 6 CH 3 CH 2 CH 2 COOH + 2 CO 2 + 2 H 2
Produksi Gas Gambar 5. Kondisi media dan indikator saat terbentuknya gas Produksi gas dimulai pada jam ke- 13 dan optimum pada jam ke-20 dengan jumlah gelembung pada indikator mencapai 11x/menit ph akhir sebesar 4. Hal ini disebabkan terbentuknya asam-asam organik Volume gas yang dihasilkan sebanyak 970 ml Uji kualitatif dengan Hydrogen sensor terbukti bahwa terbentuk gas H 2
Hasil Analisis H 2 Gambar 6. Kromatogram hasil analisis H 2 Hidrogen muncul pada waktu retensi 1,08 menit dengan luas peak 2,22x10-4. Kadar H 2 yang dihasilkan yaitu sebesar 13,3 % sehingga H 2 kumulatif sebanyak 148,41 ml.
Kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkan biohidrogen. Uji kuantitatif dengan GC-TCD, kadar H 2 yang dihasilkan yaitu sebesar 13,3 % sehingga H 2 kumulatif sebanyak 148,41 ml. Strain yang berpengaruh dalam produksi H 2 adalah Bacillus cereus.
TERIMA KASIH