PENENTUAN JUMLAH FLAVONOID TOTAL EKSTRAK ETANOL DAUN BUAH MERAH (PANDANUS CONOIDEUS LAMK.) SECARA KOLORIMETRI KOMPLEMENTER Yesi Desmiaty, Julia Ratnawati, Peni Andini Jurusan Farmasi Universitas Jend. Achmad Yani Cimahi Jawa Barat email: desmiaty@gmail.com ABSTRAK Secara empiris daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) sangat berpotensi untuk dijadikan sediaan obat tradisional. Untuk itu perlu dikembangkan metode standardisasi sediaan obat tradisional, salah satunya adalah dengan penetapan kadar salah satu kandungan senyawa marker. Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) memiliki kandungan senyawa flavonoid sehingga dapat dilakukan penentuan jumlah flavonoid total ekstrak etanol daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) secara kolorimetri komplementer. Penentuan jumlah flavonoid total dilakukan dengan menjumlahkan kadar flavonoid yang ditentukan menggunakan dua metode yaitu metode alumunium klorida untuk menentukan golongan flavon dan flavonol dan metode 2,4dinitrofenilhidrazin untuk menentukan golongan flavanon dan flavanonol. Dari hasil penelitian didapatkan jumlah flavanon dan flavanonol lebih tinggi daripada flavonol dan flavon dengan jumlah flavonoid total 0,99±0,01 % b/b. Keyword : daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.), flavonoid total, alumunium klorida, 2,4dinitrofenilhidrazin. Pendahuluan Tumbuhan obat yang belakangan ini menjadi sangat populer yaitu buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) mengandung beberapa senyawa aktif yang dapat berfungsi sebagai antioksidan yaitu karoten, betakaroten dan tokoferol. Buah merah dipercaya dapat mengobati beberapa penyakit diantaranya asam urat, kolesterol, diabetes, hipertensi, hepatitis, jantung koroner, osteoporosis, hingga penyakit yang paling berbahaya saat ini yaitu HIV (dalam penelitian). Untuk itu perlu dikembangkan metode standardisasi simplisia, salah Page 1
satunya adalah dengan penetapan kadar salah satu kandungan senyawa Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) memiliki kandungan senyawa flavonoid sehingga dapat dijadikan sebagai senyawa marker. Penentuan jumlah flavonoid total ekstrak etanol daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) adalah secara kolorimetri komplementer atau menggunakan dua metode yaitu metode alumunium klorida untuk menentukan golongan flavon dan flavonol dan metode 2,4dinitrofenilhidrazin untuk menentukan golongan flavanon dan flavanonol. Alat dan bahan Alat : Alat-alat gelas yang biasa dipergunakan di laboratorium, cawan penguap, krus silikat, penangas air, timbangan analitik (Sartorius BL 210 S), botol semprot, termometer, cawan penguap, krus silikat, desikator, tanur (Nabertherm-Germany), oven (Memmert), stopwatch, spektrofotometer (Shimadzu.UV-Visible Spektrophotometer 1601). Bahan : Daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.), air suling, etanol redestilasi, metanol redestilasi, asam sulfat, alumunium (III) klorida LP, kertas saring, kalium hidroksida, asam klorida, kertas saring, kalium asetat, toluen, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, serbuk magnesium, amil alkohol, besi (III) klorida, gelatin, pereaksi Lieberman Bourchard, vanilin asam sulfat, naringenin murni, kuersetin murni, reagen 2,4-dinitrofenilhidrazin. Metodologi Penelitian Daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) diperoleh dari daerah Wamena Papua dideterminasi di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor. Bahan disiapkan hingga menjadi simplisia dan dilakukan penetapan karakteristiknya meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air simplisia, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu larut air, penentuan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar sari larut air dan penetapan kadar sari larut etanol. Penapisan fitokimia meliputi pemeriksaan alkaloid, flavonoid, tanin, polifenolat, saponin, kuinon, monoterpenoid/seskuiterpenoid dan steroid/triterpenoid. Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara ekstraksi dingin yaitu secara maserasi dengan alat pengaduk dalam pelarut etanol 95% kemudian diaduk pada kecepatan 200 rpm selama delapan jam selama tiga hari. Penentuan jumlah flavonoid total ditentukan secara kolorimetri komplementer terhadap ekstrak etanol daun buah merah dengan dua metode kolorimetri, yaitu: metode Page 2
alumunium klorida dan metode 2,4dinitrofenilhidrazin. Setelah diperoleh jumlah flavonoid dari masing-masing metode tersebut kemudian ditentukan jumlah flavonoid totalnya dengan menjumlahkan kandungan flavonoid dari kedua metode tersebut. Penentuan jumlah flavonoid metode alumunium klorida: 1. Pembuatan larutan uji ekstrak etanol yaitu 1,0 g serbuk simplisia dalam 25 ml etanol 95%. Kemudian diaduk selama delapan jam dengan menggunakan alat pengaduk pada kecepatan 200 rpm selama tiga hari, kemudian disaring, filtrat yang diperoleh di ad etanol 95% sampai 25,0 ml. 2. Pembuatan kurva kalibrasi dengan kuersetin sebagai pembanding. Dibuat serangkaian larutan kuersetin dalam etanol dengan konsentrasi 40, 60, 80, 100, dan 120 µg/ml. Sejumlah 0,5 ml dari masing-masing larutan, dicampur dengan 1,5 ml etanol 95%; 0,1 ml alumunium klorida 10%, 0,1 ml kalium asetat 1M dan 2,8 ml aquadest. Diinkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit. Diukur serapannya dengan spektrofotometer uv-vis pada panjang gelombang maksimum yaitu 438 nm. Kurva kalibrasi yang diperoleh adalah sbb Gambar V.14. 3. Penentuan jumlah flavonoid dari larutan uji ekstrak etanol daun buah merah. Sejumlah 0,5 ml ekstrak etanol sampel diperlakukan sama seperti pada pembuatan kurva kalibrasi. Kemudian dihitung kadar flavonoidnya. 4. Perhitungan untuk menentukan jumlah flavonoid dengan metode kolorimetri alumunium korida dihitung dengan menggunakan persamaan : F1 = CxVxFx10-6 x100% m Keterangan : F 1 = Jumlah flavonoid dengan metode alumunium klorida, C = Kesetaraan kuersetin (.g/ml), V = Volume total ekstrak etanol (ml), F = Faktor pengenceran (2), m = Berat sampel (g) Penentuan Flavonoid Metode kolorimetri 2,4-dinitrofenilhidrazin 1. Pembuatan reagen 2,4-dinitrofenilhidrazin: Ditimbang seksama 1,0 gram 2,4-dinitrofenilhidrazin dilarutkan dalam 2 ml asam sulfat 96% dan diencerkan sampai 100 ml dalam labu ukur dengan metanol. 2. Pembuatan kurva kalibrasi dengan naringenin sebagai pembanding. Dibuat serangkaian larutan naringenin dalam metanol dengan konsentrasi 400, 800, 1000 dan 1200 µg/ml. Sejumlah 1,0 ml dari masing-masing larutan yang telah dilarutkan, ditambahkan 2 Page 3
ml reagen 2,4dinitrofenilhidrazin 1%. Diinkubasikan pada suhu 50 0 C selama 50 menit. Setelah dingin pada suhu kamar, ditambahkan KOH 10% dalam metanol sampai 10 ml dalam labu ukur. Dipipet 1,0 ml dari campuran tersebut diatas, ditambah metanol sampai 10,0 ml. Diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum yaitu 494 nm. Blanko 1,0 ml larutan pembanding diganti dengan methanol 1,0 ml dan prosedur seterusnya diperlakukan sama seperti diatas. Kemudian dibuat kurva kalibrasi. 3. Penentuan jumlah flavonoid dari ekstrak etanol daun buah merah. Diambil 1,0 ml ekstrak etanol kemudian diperlakukan sama seperti pada pembuatan kurva kalibrasi. Kemudian dihitung kadar flavonoidnya. Perhitungan untuk menentukan jumlah flavonoid dengan metoda kolorimetri 2,4- dinitrofenilhidrazin dihitung dengan menggunakan persamaan : F2 = CxVxFx10-6 x100% m Keterangan : F 2 = Jumlah flavonoid dengan metode 2,4 -dinitrofenilhidrazin, C = Kesetaraan naringenin (.g/ml), V = Volume total ekstrak etanol (ml), F = Faktor pengenceran (1), m = Berat sampel (g) Perhitungan Jumlah Flavonoid Total Jumlah flavonoid total daun buah merah dihitung dengan menggunakan persamaan : FT = F1 + F2. Keterangan : F 1 = Jumlah flavonoid dengan metode alumunium klorida, F 2 = Jumlah flavonoid dengan metode 2,4 dinitrofenilhidrazin, FT = Jumlah flavonoid total Hasil Penelitian Page 4
Gb. 1. Tanaman buah merah Tabel 1. Karakteristik simplisia daun buah merah Page 5
Serapan Absorban Kurva kalibrasi larutan pembanding kuersetin 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 50 100 150-0.2 Konsentrasi y = 0.0069x - 0.0026 R 2 = 0.9999 Kurva kalibrasi larutan pembanding naringenin 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 500 1000 1500-0.2 Konsentrasi y = 0.0008x - 0.006 R 2 = 0.9985 Gb 2. Kurva kalibrasi larutan pembanding Tabel 2. Hasil Perhitungan Jumlah Flavonoid Pembahasan Page 6
Penentuan jumlah flavonoid dari ekstak etanol daun buah merah dilakukan dengan kolorimetri komplementer yang mempunyai prinsip pengukuran berdasarkan pembentukan warna. Prinsip penetapan flavonoid dengan metode kolorimetri AlCl3 adalah pembentukan kompleks antara AlCl3 dengan gugus keto pada atom C-4 dan juga dengan gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-4 yang bertetangga dari flavon dan flavonol. Sehingga metode ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah flavonoid golongan flavon dan flavonol. Pada pembuatan kurva kalibrasi dengan metode AlCl3 digunakan kuersetin sebagai pembanding karena kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang mempunyai gugus keto pada C-4 dan memiliki gugus hidroksi pada atom C-3 atau C-5 yang bertetangga dari flavon dan flavonol. Panjang gelombang maksimum yang dihasilkan dari pengukuran kuersetin adalah 438 nm. Pada metode AlCl3 jumlah flavonoid flavon dan flavonol diperoleh 0,13±0,00 % b/b. Pada penentuan jumlah flavonoid dengan metode kolorimetri 2,4-dinitrofenilhidrazin, prinsipnya adalah reaksi antara 2,4-dinitrofenilhidrazin, suatu senyawa yang mengandung gugus.nh2 dengan gugus aldehid dan gugus keton membentuk 2,4-dinitrofenilhidrazon. Flavon, flavonol, dan isoflavon yang memiliki ikatan rangkap pada atom C2-C3 tidak dapat bereaksi dengan 2,4-dinitrofenilhidrazin. Sehingga penentuan jumlah flavonoid dengan metoda kolorimetri 2,4-dinitrofenilhidrazin spesifik untuk flavanon dan flavanonol. Naringenin merupakan flavonoid golongan flavanon yang memiliki gugus keto pada atom C- 4 dan juga memiliki gugus hidroksi pada atom C-5, C-7 dan C-4. Pada saat pembuatan kurva kalibrasi naringenin, panjang gelombang maksimum yang dihasilkan adalah 494 nm. Pada metode kolorimetri 2,4-dinitrofenilhidrazin, jumlah flavonoid flavanon dan flavononol ekstrak etanol daun buah merah adalah 0,86±0,01 % b/b. KESIMPULAN Jumlah flavonoid daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) golongan flavanon dan flavanonol lebih tinggi daripada golongan flavon dan flavonol, yaitu 0,86±0,01 % b/b dan 0,13±0,00 % b/b. Jumlah flavonoid total daun buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) adalah 0,99±0,010% b/b. Pustaka 1. I Made Budi, Fendy R. Paimin, Buah Merah, Penebar Swadaya, 2005, 5-70. Page 7
2. Popova, M.S. Silici, O. Jaftanoglu V., Antibacterial Activity of Turkish Propolis Qualitative and Quantitative Chemical Composition, Bankova, Phytomedicine, 12 (2005). 3. Direktorat Jenderal POM., Departemen Kesehatan Republik Indonesia., Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta, 1989, 1-37. 4. Hidayat N. Atmaja., Penentuan Jumlah Flavonoid Total Ekstrak Etanol Daun Tempuyung (Sonchus arvensis.l.), Daun Sambiloto (Andrographis paniculata (Burn. F.) Nees) dan Herba Meniran (Phyllanthus niruri L.) Secara Kolorimetri Komplementer, skripsi, Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UNJANI, 2005 Page 8