BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian jenis analitik. B. Tempat dan Waktu Tempat penelitian dilakukan di laboratorium Hematologi Rumah Sakit Telogorejo Semarang. Waktu penelitian dilakukan pada bulan Maret 2011. C. Populasi dan Sampel 1. Populasi Sampel diambil di darah vena pasien yang periksa TAT di Rumah Sakit Telogorejo Semarang. Ada sebanyak 30 sampel pada bulan Maret 2011 yang harus memenuhi kriteria pemeriksaan. Kemudian diperiksa secara Tes Agregasi Trombosit (TAT) metoda turbidimetrik dan secara mikroskopik Sediaan Apus Darah Tepi (SADT). Data yang diperoleh merupakan data primer yang berupa hasil perhitungan agregat trombosit pada SADT dan pengukuran agregasi trombosit pada TAT. 2. Sampel
Sampel diambil darah pasien yang periksa Tes Agregasi Trombosit (TAT) sebanyak 30 pasien. Sampel pemeriksaan laboratorium darah citras dengan perbandingan darah : antikoagulan 9 : 1 dengan kriteria pasien puasa 12 jam, hasil peneriksaan trombosit 150.000 400.000 trigliserida <200 mgr/dl dan sampel tidak keruh. D. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel a. Variabel bebas Pembacaan agregat trombosit pada sediaan apus darah tepi dan agregasi trombosit pada TAT Metoda turbidimetrik. b. Variabel terikat Hasil pemeriksaan agregasi trombosit 2. Definisi operasional Agregasi trombosit adalah beberapa trombosit yang membentuk kelompok kelompok (clump trombosit) yang terlihat dalam pembacaan sediaan apus darah tepi dengan perhitungan hasil dalam bentuk persen (%) atau pada alat TAT Metoda turbidimetrik dengan pengukuran hasil dalam bentuk grafik dan persen (%) yang disebabkan oleh transmisi cahaya melalui PRP yang meningkat. E. Cara Penelitian
Cara pengambilan sampel. Sampel yang diambil adalah darah vena kemudian dimasukkan ke dalam tabung citras dengan perbandingan (9 : 1) sebanyak 3 tabung. Dua tabung citras untuk pemeriksaan TAT Metoda turbidimetrik yang telah dicentrifuge kemudian diambil PRP (Platelet Rich Plasma) dan PPP (Platelet Poor Plasma). Sedangkan satu tabung citras untuk pemeriksaan pada sediaan apus darah tepinya. F. Pemeriksaan Agregasi Trombosit pada TAT 1. Alat dan Bahan Alat : Agregometer trombosit chrono log model 490, Kuvet dan stir bar, Pipet dengan disposable plastik 5µl, 20 µl, 45 µl, 500 µl, Centrifuge, Tabung plastik dan tutupnya, Tips Bahan : Darah citras yang telah dicentrifuge dan diambil, Platelet Rich Plasma (PRP), Platelet Poor Plasma (PPP), Larutan ADP konsentrasi 10µM, 5 µm, 2 µm, 1 µm(sebagai agonist atau induktor). 2. Prinsip Pemeriksaan Sebelum penambahan platelet agonist ADP, transmisi cahaya melalui PRP rendah oleh karena trombosit masih tersuspensi homogen dalam PRP. Setelah penambahan agonist maka trombosit akan mengalami agregasi kemudian agregat trombosit akan mengendap
sehingga plasma menjadi jernih dan akibatnya transmisi cahaya meningkat. 3. Prosedur pemeriksaan TAT Metoda turbidimetrik a. Nyalakan alat, tunggu sampai suhu 37 ⁰C (± 15 menit) b. Nyalakan komputer, ketik data/identitas pasien c. Siapkan PRP dan PPP Tabung PPP PRP (trace 1) PRP (trace 2) PRP (trace 3) PRP (trace 4) Sampel 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Stir bar - + + + + d. Masukkan kelima kuvet tersebut ke dalam masing-masing lubang incubation wells dan diinkubasi selama 3 menit pada suhu 37 ⁰C e. Satu kuvet PPP pindahkan ke lubang optical chamber PPP f. Empat kuvet PRP pindahkan ke lubang optical chamber PRP g. Inkubasi kelima kuvet tersebut selama 3 menit pada suhu 37 ⁰C h. Buat garis baseline untuk menentukan batas atas dan bawah pada trace 1, 2, 3 dan 4 pada agregometer i. Siapkan reagen ADP kemudian masukkan larutan ADP berbagai konsentrasi sebagai berikut : Tabung PRP 500 µl (TACE 1) Tabung PRP 500 µl (TACE 2) Tabung PRP 500 µl (TACE 3) Tabung PRP 500 µl (TACE 4) ADP, Konsentrasi 10 µm 5 µl ADP, Konsentrasi 5 µm 5 µl ADP, Konsentrasi 2 µm 5 µl ADP, Konsentrasi 1 µm 5 µl
j. Biarkan grafik berjalan selama 13 menit k. Reaksi akan terlihat berupa kurva pada grafik Faktor-faktor teknis yang perlu diperhatikan agar tes agregasi trombosit didapatkan hasil yang sesuai karena bila diabaikan menghambat trombosit dalam beragregasi dan menghambat pembentukan transmisi cahaya. a. Darah diambil dalam keadaan puasa 10-12 jam b. Tabung yang digunakan terbuat dari bahan plastik atau gelas berlapis silicon. c. Pemeriksaan harus dikerjakan dalam waktu kurang dari 3 jam setelah pengambilan. d. Jumlah trombosit normal. e. Plasma tidak hemolisis dan tidak keruh. f. Trigliseride normal 4. Harga normal ADP 1, 2, 5 dan 10 µm berturut-turut : 3 15% ; 11 36% ; 25 68% dan 49 84%. G. Pemeriksaan Agregat Trombosit pada Sediaan Apus Darah Tepi 1. Alat dan Bahan : Alat : Vacutainer natrium citrate 3,8%, Tips, Cat giemsa dan methanol, Obyek glass, Mikroskop elektrik, Counter
Bahan : Darah citras dengan perbandingan darah antikoagulan 9 : 1, Larutan ADP konsentrasi 10 µm 2. Prinsip Pemeriksaan Darah citras dengan penambahan agonist maka trombosit akan mengalami agregasi yaitu trombosit berkelompok (clump trombosit) yang dapat dihitung pada sediaan apus darah tepi secara mikroskopik. 3. Prosedur Pemeriksaan Agregat Trombosit pada Sediaan Apus Darah Tepi a. Diambil darah vena Mediana Cubiti menggunakan vacutainer dengan tabung berisi 0,5 ml natrium citrate 3,8 % sebanyak 1 tabung untuk pengambilan darah hingga volume menjadi 5 ml. b. Tabung berisi 5 ml darah dan antikoagulan citrat, untuk pemeriksaan sediaan apus darah tepi pada menit ke 0. c. Pada sisa darah yang ada ditambahkan ADP dengan perbandingan darah natrium citrate adalah 1 : 10 digoyang agar tercampur rata. Ditunggu 3 menit dan dengan pipet diambil 10 µl, dibuat sediaan apus darah tepi pada menit ke 3. d. Sediaan apus ditunggu kering dan difiksasi dengan methanol selama 5 menit kemudian dicat giemsa yang telah diencerkan (1 : 9) selama 20 menit, lalu bilas dengan air sliding dan biarkan kering.
e. Pemeriksaan sediaan apus darah tepi dilakukan pada perbatasan zona VI dan ekor daerah lateral, medial dan mediolateral. Keterangan : M : Medial ML : Mediolateral L : Lateral Daerah baca pemeriksaan sediaan apus darah tepi pada perbatasan zone VI dan ekor daerah lateral, medial dan mediolateral f. Pembacaan agregasi trombosit dalam sediaan apus darah tepi juga dilakukan pada seluruh lapang pandang sebagai konfirmasi. g. Pembacaan dilakukan dengan pembesaran 400x (lensa okuler 10x dan lensa obyektif 40x) Dihitung jumlah trombosit pada masingmasing kelompok trombosit yang ada dan jumlah trombosit yang tersebar pada ketiga lapangan pandang. Bila diperlukan penghitungan banyaknya trombosit dalam kelompok dapat dihitung dengan pembesaran 1000x (lensa okuler 10x dan lensa obyektif 100x). h. Persentase trombosit yang beragregasi dihitung berdasarkan jumlah trombosit yang berkelompok dibandingkan jumlah trombosit total
(trombosit berkelompok dan tidak berkelompok). Dihitung dari sediaan apus I (0 menit) dan sediaan apus II (3 menit). i. Harga normal 50% - 70% Kelemahan pembacaan sediaan apus darah tepi terletak pada ketrampilan dan skill masing-masing orang dalam membaca agregasi trombosit. Pengecatan apus darah tepi kurang bagus juga akan mempengaruhi dalam pembacaan agregasi trombosit. Pembacaan agregasi trombosit pada sediaan apus darah tepi secara mikroskopik. Contoh :
Trombosit beragregasi : I 11 + 14 + 10 + 18 = 53 II 16 + 12 + 9 + 19 = 56 III 20 + 11 = 31 + 140 Trombosit bebas : I 13 II 15 III 17 + 45 Trombosit total = 140 + 45 = 185 Perhitungan % agregasi trombosit = = 75,7% Perhitungan agregasi dengan koreksi = = = 76%
H. Alur Penelitian I. Analisis Data Untuk menggambarkan hasil pemeriksaan pada sediaan apus darah tepi dan TAT Metoda turbidimetrik disajikan secara deskritif, kemudian dilakukan uji kesesuaian. Uji Kesesuaian (Goodness of Fit) Pengujian hipotesis kesesuaian (goodness of fit) merupakan pengujian hipotesis untuk menentukan apakah suatu himpunan frekuensi yang diharaplan (Expected) sama dengan frekuensi yang diperoleh dari suatu distribusi, seperti distribusi binomial, poisson, normal atau dari perbandingan lain. Jadi, uji goodness of fit merupakan pengujian
kecocokan atau kebaikan suai antara hasil pengamatan (frekuensi pengamatan) tertentu dengan frekuensi yang diperoleh berdasarkan nilai harapannya (frekuensi teoretis). Langkah-langkah pengujian hipotesis goodness of fit ialah sebagai berikut: a. Menentukan hipotesis H 0 : terdapat kesesuaian antara frekuensi pengamatan dengan frekuensi yang diharapkan. H 1 : terdapat ketidaksesuaian antara frekuensi pengamatan dengan frekuensi yang diharapkan. Kriteria penerimaan dan penolakan - H 0 diterima jika nilai p (p-value) > 0,05 - H 1 ditolak jika nilai p (p-value) < 0,05 b. Melakukan Uji Kesesuaian dengan prosedur Kolmogorov-Smirnov c. Membuat Kesimpulan Menyimpulkan apakah H 0 ditolak atau diterima berdasarkan nilai statistik uji yang diperoleh. Dalam uji kesesuaian dipilih prosedur one sample Kolmogorov Smirnov/K-S (Uji Kesesuaian satu sampel Kolmogorov-Smirnov (Ghozali, 2006: 37-42). Selanjutnya analisis uji kesesuaian dilakukan dengan bantuan Program SPSS 13. Pada penelitian ini ditetapkan Confidence Interval (CI) sebesar 95% dan Taraf Signifikansi 5% atau α = 0,05.