1.1 Latar Belakang BAB I PENDAHULUAN Dalam bidang mikrobiologi, dipelajari mengenai mikroba yang meliputi bakteri, fungi atau mikroorganisme lainnya, baik dalam morfologi dan penampakan koloninya. Karena itu, untuk melihat dengan jelas penampakan mikroba tersebut, terlebih dahulu kita membuat biakan atau piaraan organisme. Sebelumnya, bahan serta peralatan harus dalam keadaan steril, artinya pada bahan dan peralatan yang ingin dipergunakan tidak terdapat mikroba lain yang tidak diharapkan. Proses dari kegiatan steril disebut sterilisasi. Sementara itu, untuk menumbuhkan mikroorganisme yang sudah dibiakkan (murni) digunakan media. Media merupakan campuran dari beberapa zat-zat makanan untuk pertumbuhan mikroba dan berfungsi sebagai nutrisi bagi mikroba tersebut. Media dibedakan berdasarkan fase (sifat fisik media), yaitu media padat, media setengah padat, media cair, dan berdasarkan komposisinya, yaitu media sintesis, media semi sintesis, dan media non sintesis. Dari media tersebut, maka kita dapat mengetahui sifat dan bentuk (koloni) dari mikroba. Yang melatar belakangi pada praktikum kali ini akan membuat piaraan mikroba dengan menggunakan media padat, yaitu agar-agar sebagai tempat pertumbuhan mikroba Setelah itu mengidentifikasi sifat dan koloni mikroba yang terdapat pada biakan. 1.2 Tujuan Praktikum 1. Mengetahui cara yang sering digunakan dalam biakan murni. 2. Mengetahui cara penanaman biakan dengan menggunakan metode cawan gores.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Secara alami, mikroorganisme di alam ditemukan dalam populasi campuran. Hanya dala keadaan tertentu saja populasi ini ditemukan dalam keadaan murni. Untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi, an sifat faalinya, maka mikroorganisme yang akan diteliti harus dapat dipisahkan. Hal ini berarti harus diperoleh biakan murni yang hanya mengandung satu macam mikroorganisme (Dwidjoseputro, 2003). Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan menggunakan bahan cair atau padat. Pada mulanya digunakan gelatin sebagai bahan pemadat. Gelatin terdiri dari protein sehingga dapat dicerna atau dicairkan oleh mikroorganisme. Bahan pemadat yang kemudian ditemukan adalah agar, yang merupakan polisakarida dari rumput laut. Agar dapat mencair pada suhu 100 0 C masih dalam bentuk cair. Suhu ini masih memungkinkan mikroorganise dapat tumbuh, sehingga prinsip ini dipakai untuk mengisolasi bakteri dengan agar tuang. Pada umumnya mikroorganisme tidak dapat mencerna atau mencairkan agar (Dwidjoseputro, 2003). Isolasi mikroba adalah memisahan mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Mengisolasi mikroba dengan cara menubuhkan (menanam) dalam medium padat. Hal ini karena dalam medium padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni yang tetap pada tempatnya. Sel mikroba yang tertangkap pada medium padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka sel atau kumpulan sel mikroba yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah (Dwidjoseputro, 2003). Bagaimana cara mengisolasi mikroba dalam medium cair. Bila kita menggunakan medium cair, maka sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tempatnya tidak tetap. Tetapi kita tetap dapat mengisolasi mikroba dalam medium padat dan dibiarkan membentuk koloni. Selanjutnya selsel mikroba tersebut diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan-cawn petri yang terpisah. Isolasi dapat dilakukan dengan cara penggoresan dan cara penaburan (Dwidjoseputro, 2003).
Isolasi Mikroba Beratus-ratus spesies mikroba dapat menghuni berbagai macam bagian tubuh kita, misalnya: mulut, saluran pencernaan, kulit dan lain-lain. Sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganise. Satu gram kotoran manusia atau hewan dapat mengundang jutaan bakteri. Udara, air, tanah, juga dihuni oleh sekumplan mikroorganisme (Irianto, 2006). Populasi mikroorganisme tesebut pada umumnya terdapat dalam populasi campuran. Amat jarang mikroorganise tersebut dijumpai sebagai satu spesies tunggal. Disisi lain, untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies mikroorganisme tertentu, yang pertama harus dilakukan adalah memisahkannya dari organise lain, hingga diperoleh biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang sel-selnya berasal dari pebelahan satu sel tunggal. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaan dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganise saja. Teknik tersebut dikenal dengan isolasi mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: 1. Isolasi Agar Cawan Prinsip pada metode isolasi agar cawan adalah mengencerkan mikroorganise sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lain. Setiap koloni yang terpisah yang tapak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: metode gores kuadran dan metode agar cawan tuang. 2. Isolasi Pada Medium Cair Metode isolasi pada mediu cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. 3.Isolasi Sel Tunggal Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau
medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun mikroanipulator, yang dilakuakn secara aseptis (Irianto, 2006). Teknik Biakan Murni ( Cara Menyendirikan Piaraan Murni) Dialam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain. Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba (saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu: 1. Cara pengenceran Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dala suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian diambil 1ml untuk diencerkan lagi. Kalau perlu, dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk di encerkan lebih lanjut. Langkah selanjutnya adalah dari pengenceran yang ketiga diatas, diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan piaraan murni (biakan murni). Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni tersebut sebagai sampel (Irianto, 2006). 2. Cara Penuangan Isolasi dengan menggunakan medium cair dengan cara pengenceran, seperti dijelaskan di atas. Prinsip melakukan pengenceran adalah menurunkan jumlah
mikroorganisme sehingga suatu saat hanya ditemukan satu sel dala satu tabung. Demikian juga dengan cara penuangan (Irianto, 2006). Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sapel itu keudian disebarkan dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti diatas, akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin. 3. Cara Penggesekan Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh (Irianto, 2006). Bakteri yang mempunyai flagel seringkali membentuk koloni yang menyebar terutaa bila digunakan lempengan agar yang basah. Untuk mencegah hal ini harus digunakan lempengan yang benar-benar kering (Irianto, 2006). Ada beberapa teknik penggesekan, yakni: a. goresan T b. goresan kuadran c. goresan radian d. goresan sinambung 4. Cara Penyebaran (Agarsebar) Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan. Dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelk. Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol dan kemudian dipanaskan sehingga alkohol terbakar habis. Penyebarkan didinginkan dahulu sebelum digunakan untuk menyebarkan cairan contoh (sampel) dilakukan dengan memutar agar lepengan tersebut (Irianto, 2006).
5. Cara Pengucilan Satu Sel (singel cell isolation) Cara ini dilakukan dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak bakteri, dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain. Alat semacam ini tidak mudah untuk menggunkannya. Alat ini berupa mikropipet yang ditempatkan pada mikromanipulator (Irianto, 2006). Dengan membuat beberapa tetesa tergantung pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet. Pekerjaan ini dilakukan di bawah kaca obyektif mikroskop. Bila tapak suatu tetesan yang hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain pipet, tetesan dipindahkan ke suatu mediu encer dengan tujuan bekteri tersebut berbiak lebih dahulu. Dari biakan ini akan diperoleh piaraan murni (Irianto, 2006). 6. Cara Inokulasi pada Hewan Metode ini didasarkan pada kenyataan bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misalnya, kita ambil bahan pemeriksaan berupa dahak (sputum) dari seseorang yang disangka menderita TBC. Bila dahak disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka saproba akan ikut serta, tetapi tidak dapat bertahan hidup, sehingga keudian hanya kita dapatkan kuman TBC saja. Biakan murni Pneumococcus dapat diperoleh dengan cara demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati itu akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai. Inokulasi dilakukan di dalam kulit (intracutaneous), di bawah kulit (subcutaneous), di dalam otot (intrauscular), dan dapat juga pada rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi (Irianto, 2006).
3.1 Waktu Dan Tempat BAB III METODE KERJA Praktikum percobaan tehnik biakan murni dilakukan pada hari Senin tanggal 17 Maret 2010 dilaboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman. 3.1 Alat dan bahan 3.1.1 Alat-alat 1. Cawan petri 2. Lampu bunsen 3. Laminar air 4. Flow cabinet 5. Pipet tetes 6. Inkubator 7. Tabung reaksi 8. Alat tulis 1.1.2 Bahan 1. Kapas 2. Kertas 3. Aquades 4. Alkohol 70% 5. PDA 6. NA 7. Bakteri Staphyloococcus aureus 3.2 Cara kerja 3.2.1 Metode Cawan Sebar (Spread Plate) 1. Sebelum melakukan penanaman dilakukan pensterilkan tangan praktikan dengan menggunakan alkohol.
2. Dibuka laminar flow air cabinet, kemudian diambil cuttembud yang sudah disediakan. 3. Kemudian dipanaskan didekat Bunsen burner. 4. Diambil media bibit, dipanaskan pinggir-pingir cawan petri. 5. Dibuka cawan petri sedikit saja, kemudian dengan menggunakan cuttembud dicolek bakteri yang ada pada media bibt dengan perlahan. 6. Setelah itu diambil media biakan, dipanaskan pinggir-pinggir cawan petri. 7. Dibuka cawan petri, kemudian dioleskan dengan menggunakan cutembud bakteri yang sudah diambil. 8. Dioleskan secara merata di seluruh permukaan agar penuh, dengan membentuk zig-zag. 9. Setelah itu ditutup cawan petri dan dipanaskan lagi pinggiran cawan. 10. Kemudian diinkubasi secara terbaliknpada suhu 37 0 C selama 24-48 jam. 11. Setelah diinkubasi dilakukan pengamatan dan dicatat serta digambar hasil pengamatan. 3.1.2 Metode Cawan Gores (Sterak Plate) 1. Dipanaskan jarum ose sampai memerah. 2. Diambil media bibit, dipanaskan pinggiran cawan. 3. Kemudian disentuh permukaan koloni dengan jarum ose perlahan-lahan. 4. Kemudian diambil media biakan NA, dipanaskan pinggiran cawan. 5. Digoreskan jarum ose pada media NA, dengan metode third streak dengan perlahan. 6. Ditutp cawan, kemudian dipanaskan pinggiran cawan. 7. Setelah itu diinkubasi secara terbalik pada suhu 37 0 C selama 24-48 jam. 8. Setelah diinkubasi dilakukan pengamatan dan dicatat serta digambar hasil pengamatan.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Pengamatan Gambar 1. Metode Cawan Sebar (Spread Plate) pada Medium NA. Gambar 2. Metode Cawan Gores (Streak Plate) pada Medium NA.
4.2 Pembahasan Biakan murni adalah suatu biakan yang hanya mengandung satu spesies mikroorganisme saja di dalam satu media biakan. Dimana kita mengambil dari satu koloni bahan biakan campuran dan dipindahkan atau ditanam pada medium baru yang steril dengan mengunakan teknik anseptik dan dilakukan dengan cermat. Biakan adalah medium yang mengandung organisme hidup. Medium itu menyediakan makanan untuk pertumbuhan bakteri Penanaman bakteri pada praktikum kali ini adalah dengan cara sebar dan gores. Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak plate) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Penggoresan-penggoresan sederhana yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Jarum ose dimasukan pada medium biakan induk, jarum ose bentuk bulat untuk inokulasi bakteri. Pengambilan inokulum dengan dengan menggoreskan ujung bulat jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Inokulum digoreskan dipermukaan media agar nutrient. Diantara goresan akan terdapat selsel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat,bila dilakukan dengan baik maka akan mnghasilkan baik. Ada beberapa teknik dalam metode goresan yakni goresan T, goresan kuadran, goresan radian dan goresan sinambung. Dari praktikum yang telah dilakukan diperoleh hasil yang kurang memuaskan karena bakteri yang tumbuh koloni yang sedikit saja atau dalam jumlah yang kecil atau karena terkontaminasi. Pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor : 1. Temperatur, umumnya bakteri tumbuh baik pada suhu antara 25-35 C. 2. Kelmbapan lingkungan lembab dan tingginya kadar air sangat menguntungkan untuk pertumbuhan bakteri 3. Sinar Matahari, sinar ultraviolet yang terkandung dalam sinar matahari dapat mematikan bakteri.
4. Zat kimia, antibiotik, logam berat dan senyawa-senyawa kimia tertentu dapat menghambat bahkan mematikan bakteri. Faktor kesalahan yang menyebabkan gagalnya dalam percobaan biakan murni diantara lain ialah : 1. Kesterilan alat dan ruang penanaman. 2. Kontaminasi bakteri lainnya. 3. Kesalahan diwaktu penanam bakteri.
BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Dari praktikum yang telah dilakukan dapat ditarik kesimpulan yaitu : 1. Metode yang sering digunakan dalam pembiakan bakteri adalah metode cawan gores (streak plate) dan metode cawan sebar (spread plate). 2. Pada metode cawan gores biasanya digunakan beberapa cara yaitu goresan T, goresan kuadran, goresan radian, goresan sinambung. 5.2 Saran Sebaiknya dalam praktikum tidak hanya menggunakan bakteri Staphylococcus aureus saja dalam pembiakan bakteri murni, tetapi juga menggunakan bakteri yang lainnya seperti Streptococcus sp. Agar dapat dibandingkan hasilnya.
DAFTAR PUSTAKA Dwijoseputro, D. 2003. Dasar- dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang Entjang. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi. Citra Aditya Bakti : Bandung Irianto, koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Yrama Widya : Bandung Waluyo. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM : Malang